CN104830964A - 一种东南亚型地中海贫血的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种东南亚型地中海贫血的检测技术，具体涉及一种东南亚型地中海贫血致病基因的检测方法。为了克服现有东南亚型地中海贫血检测方法中存在的敏感性低、成本高、操作复杂、耗时长的缺点，本发明提供了这样一种东南亚型地中海贫血的检测方法，包括以下步骤：a、设计SEA地中海贫血特异性LAMP引物和人基因组内参LAMP引物，b、提取人血基因组DNA，c、LAMP扩增，d、LAMP产物检测。本发明的检测方法特异性好、灵敏度高、成本低、操作简单，可在1小时内检测出结果，可满足高通量样本检测，特别适合基层单位的检验部门对SEA地中海贫血进行定性检测使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种东南亚型地中海贫血的检测技术，具体涉及一种东南亚型地中海贫血致病基因的检测方法。
背景技术
地中海贫血（thalassemia，简称：地贫）是一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，因最早发现于地中海地区而得名。其共同特点是珠蛋白基因缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，导致慢性溶血性贫血。根据合成障碍的肽链不同可把地贫分为α、β、δ、δβ、γδβ等类型，其中以α-和β-地贫最为常见。在我国，地贫高发于长江以南各省区，其中α-地贫基因携带者检出率为2%-18%，β-地贫为1%-7%。地贫基因携带者之间婚配可使下一代有1/4 的概率患有重症地贫。重型α-地贫患儿死胎或出生后就死亡。重型β-地贫患者除干细胞移植外尚无其他有效的根治方法，需输血以维持生命，大部分患者死于成年之前，东南亚型（southeast asian, 简写：SEA）地中海贫血属于α-地贫的一种。
目前国内的各级医疗系统对于地中海贫血的筛查主要采用如下的方法：先用红细胞渗透脆性一管法（基础医疗系统和计生系统的主要方法）和/或血液学表型筛查（MCV、MCH）进行地贫筛查，然后对筛查阳性的样本进行基因诊断。红细胞渗透脆性一管法是利用地贫红细胞的渗透脆性与正常人红细胞的渗透脆性不同的原理来进行筛选的，它的优点是方法简便经济、适合基层单位的使用，但是它同时也存在着特异性差，误诊率高的缺点。在筛选出疑似地贫的患者的同时，有大量的缺铁性贫血等非地贫的红细胞脆性相关疾病被误筛。血液学表型筛查（MCV、MCH）的筛查方法是《地中海贫血预防控制操作指南》推荐的方法，性价比高，筛查准确，在血球仪准确度得到保障的情况下，以MCV<82fL为标准，可以筛查出近100%的轻型α及β地贫的基因携带者，但目前只有部分基层单位及计生系统拥有血球仪，由于日常样本量少，无法购买仪器配套的质控品及参加国家的血常规的全国室间质控，因此准确度无法得到保障，从而限制了这种方法的普及。此外，血液学表型筛查法无法检出部分静止型地贫，说明其敏感性远不如基因诊断方法。
目前地贫基因诊断普遍使用跨越断裂点的聚合酶链式反应（Gap-PCR）诊断缺失型α-地贫，PCR结合反向斑点杂交技术（PCR-RDB）诊断β-地贫及突变型α-地贫。Gap-PCR需要通过琼脂糖凝胶电泳分析产物，耗时且产物易污染；PCR-RDB需要PCR扩增、产物变性、杂交等多个步骤，操作复杂繁琐，耗时长。这些基因诊断方法一来成本较高（约400元/人份），无法对广泛人群进行普查，二来开展这些项目对场地、仪器、人员素质要求较高，也很难在基层医院和农村地区广泛推广。受阻突变体系聚合酶链反应（AMRS-PCR）、多重连接探针扩增技术（MLPA）、高效变相液相色谱（DHPLC）、高分辨率溶解曲线（HRM）与PCR-测序的方法也被用于地贫的研究，但是这些方法同样存在上述两个问题。
专利申请号为201110098786.1的发明专利提供了一种抗体检测SEA型地贫特异性珠蛋白的方法，此方法检测靶点为地中海贫血特异性蛋白。专利申请号为201110081598.8的发明专利提供了一种检测SEA珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒，此方法需要使用荧光定量PCR仪，在专门的PCR室进行操作。专利申请号为200710074203.5的发明专利提供了一种检测SEA地中海贫血的核酸膜条，该方法需要将待测样本扩增后与核酸杂交膜条进行杂交显色。以上方法均不能达到快速简便、可在基层医院及农村操作的要求。
综上所述，目前地贫检测需要研究一种新的敏感性高、成本低、操作简单、快速的地贫检测方法，才能更好的符合我国国情，满足基层医院和广大农村进行广泛地贫防控的需要，真正有效的减少重症地贫患儿的出生，减少社会及家庭的负担。
发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明为了克服现有东南亚型地中海贫血检测方法中存在的敏感性低、成本高、操作复杂、耗时长的缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性高、成本低、操作简单、快速的东南亚型地中海贫血的检测方法。
（2）技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了这样一种东南亚型地中海贫血的检测方法，包括以下步骤：
a、设计SEA地中海贫血特异性LAMP引物和人基因组内参LAMP引物，包括SEA-FIP、SEA-BIP、SEA-F3、SEA-B3、control-FIP、control-BIP、control-F3、control-B3共8条引物；
所设计的SEA地中海贫血特异性LAMP引物如下：
SEA-F3:CGATCTGGGCTCTGTGTTC
SEA-B3:TGGAGTGCAGTGTTGTAGTC
SEA-FIP: GGACGACCGAGTTCCTGCGATTTGAGGGAAGGAGGGGAGAAG
SEA-BIP: CCTTGGGGAGGTTCACTTGGAGAGCCTTGAACTCCTGGACTT
所设计的人基因组内参LAMP引物如下：
control-FIP：ATGCAGAGATATTGCTATTGGCACCATTCTAAAGAATAACAGT
control-BIP: AGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTCTTATCCCAACCATAAAATAAAAGC
control-F3: GATACAATGTATCATGCCTCTT
control-B3: TGGACTCAGAATAATCCAGC
b、提取人血基因组DNA：采用Chelex 100阳离子树脂吸附法提取，取300 ul全血样本，碱裂解红细胞，加入5％ Chelex-100阳离子树脂，温度56℃，水浴20min，高速涡旋振荡样本5～10s，高速离心2min，吸取上清作为步骤c中的人血基因组DNA样本；
c、LAMP扩增：把步骤b中所取得的人血基因组DNA样本分为对照管和SEA检测管两份；
在对照管中加入control-FIP、control-BIP、control-F3、control-B3引物，并加入LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、ddH2O，形成对照管LAMP反应体系；
在SEA检测管中加入SEA-F3、SEA-B3、SEA-FIP、SEA-BIP引物，并加入LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、ddH2O，形成SEA检测管LAMP反应体系；
对照管LAMP反应体系和SEA检测管反应体系在温度56℃、时间45min的反应条件下进行反应，反应结束后，分别得到对照管LAMP产物和SEA检测管LAMP产物；
d、LAMP产物检测：使用紫外灯荧光显色的方法，对步骤c中得到的对照管LAMP产物和SEA检测管LAMP产物进行检测；将对照管和SEA检测管放至紫外灯下，当对照管和SEA检测管均出现绿色荧光时，判断为SEA地贫阳性；当对照管出现绿色荧光、SEA检测管无绿色荧光时，判断为SEA地贫阴性；当对照管和SEA检测管均无绿色荧光时，判断为反应失败，需重新检测。
步骤c中，LAMP反应缓冲液的成分和含量分别为：Tris (pH 8.8) 40 mM、KCl 20 mM、MgSO4 16 mM、(NH4)2SO4 20 mM、Tween 20 0.20%、甜菜碱 1.6M、dNTPs 2.8 mM each、MnCl2 1 mM、钙黄绿素 50 μM；
步骤c中，对照管LAMP反应体系的成分和含量分别为：LAMP反应缓冲液 12.5μl、control-FIP 40 pmol each、control-BIP 40 pmol each、control-F3 10 pmol each、control-B3 10 pmol each、Bst DNA聚合酶 8U、人血基因组DNA 5μl、ddH2O up to 25 μl；
步骤c中，SEA检测管LAMP反应体系成分和含量分别为：LAMP反应缓冲液 12.5μl、SEA-FIP 40 pmol each、SEA-BIP 40 pmol each、SEA-F3 10 pmol each、SEA-B3 10 pmol each、Bst DNA聚合酶 8U、人血基因组DNA 5μl、ddH2O up to 25 μl。
（3）有益效果
本发明提供了一种利用LAMP对SEA地中海贫血进行检测的方法，通过荧光直接激发阳性样本的绿色荧光进行检测，本发明的检测方法特异性好、灵敏度高、成本低、操作简单，可在1小时内检测出结果，同时避免了传统LAMP检测中的开盖操作，减少了污染的可能性，可满足高通量样本检测，特别适合基层单位的检验部门对SEA地中海贫血进行定性检测使用。
附图说明
图1：本发明检测方法的阳性和阴性样本结果图。
图2：本发明方法的灵敏度样本检测结果图。
图3：PCR方法的灵敏度样本检测结果图。
图4：特异性样本检测结果图。
其中：
图1 左起分别为1、2、3号管；
图2 左起分别为原浓度、10%、1%、0.1%、0.01%、阴性样本；
图3 左起分别为Marker、原浓度、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、阴性样本；
图4 左起分别为-3.7型alpha地贫患者、-4.2型alpha地贫患者、-28M型beta地贫患者、41/42M型beta地贫患者、正常人、SEA地贫患者样本。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
检测人外周血SEA地贫基因
a、设计SEA地中海贫血特异性LAMP引物和人基因组内参LAMP引物，包括SEA-FIP、SEA-BIP、SEA-F3、SEA-B3、control-FIP、control-BIP、control-F3、control-B3共8条引物；
所设计的SEA地中海贫血特异性LAMP引物如下：
SEA-F3:CGATCTGGGCTCTGTGTTC
SEA-B3:TGGAGTGCAGTGTTGTAGTC
SEA-FIP: GGACGACCGAGTTCCTGCGATTTGAGGGAAGGAGGGGAGAAG
SEA-BIP: CCTTGGGGAGGTTCACTTGGAGAGCCTTGAACTCCTGGACTT
所设计的人基因组内参LAMP引物如下：
control-FIP：ATGCAGAGATATTGCTATTGGCACCATTCTAAAGAATAACAGT
control-BIP: AGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTCTTATCCCAACCATAAAATAAAAGC
control-F3: GATACAATGTATCATGCCTCTT
control-B3: TGGACTCAGAATAATCCAGC
b、样本提取：提取人血基因组DNA，采用Chelex 100阳离子树脂（Bio-Rad）吸附法提取，取300 ul全血样本，碱裂解红细胞，加入5％ Chelex-100阳离子树脂，56℃，水浴20min，高速涡旋振荡样本 5～10s，高速离心2min，吸取上清作为步骤c中的人血基因组DNA样本；
c、LAMP扩增：把步骤b中所取得的人血基因组DNA样本分为对照管和SEA检测管两份；
在对照管中加入control-FIP、control-BIP、control-F3、control-B3引物，并加入LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、ddH2O，形成对照管LAMP反应体系，其具体成分和含量见表1，其中的LAMP反应缓冲液的成分和含量见表3；
在SEA检测管中加入SEA-F3、SEA-B3、SEA-FIP、SEA-BIP引物，并加入LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、ddH2O，形成SEA检测管LAMP反应体系，其具体成分和含量见表2，其中的LAMP反应缓冲液的成分和含量见表3；
对照管LAMP反应体系和SEA检测管反应体系在温度56℃、时间45min的反应条件下进行反应，反应结束后，分别得到对照管LAMP产物和SEA检测管LAMP产物；
表1 对照管LAMP反应体系的成分和含量
| 成分 | 含量 |
| LAMP反应缓冲液 | 12.5μl |
| control-FIP | 40 pmol each |
| control-BIP | 40 pmol each |
| control-F3 | 10 pmol each |
| control-B3 | 10 pmol each |
| Bst DNA聚合酶 | 8U |
| 人血基因组DNA | 5 μl |
| ddH2O | up to 25 μl |
表2 SEA检测管LAMP反应体系成分和含量
| 成分 | 含量 |
| LAMP反应缓冲液 | 12.5μl |
| SEA-FIP | 40 pmol each |
| SEA-BIP | 40 pmol each |
| SEA-F3 | 10 pmol each |
| SEA-B3 | 10 pmol each |
| Bst DNA聚合酶 | 8U |
| 人血基因组DNA | 5 μl |
| ddH2O | up to 25 μl |
表3 LAMP反应缓冲液的成分和含量
| 成分 | 含量 |
| Tris (pH 8.8) | 40 mM |
| KCl | 20 mM |
| MgSO4 | 16 mM |
| (NH4)2SO4 | 20 mM |
| Tween 20 | 0.20% |
| 甜菜碱 | 1.6M |
| dNTPs | 2.8 mM each |
| MnCl2 | 1 mM |
| 钙黄绿素 | 50 μM |
d、LAMP产物检测：使用紫外灯荧光显色的方法，对步骤c中得到的对照管LAMP产物和SEA检测管LAMP产物进行检测；将对照管和SEA检测管放至紫外灯（250 nm - 350 nm波长）下，当对照管和SEA检测管均出现绿色荧光时，判断为SEA地贫阳性；当对照管出现绿色荧光、SEA检测管无绿色荧光时，判断为SEA地贫阴性；当对照管和SEA检测管均无绿色荧光时，判断为反应失败，需重新检测。
通过本实施例的上述步骤，分别对正常人全血样本和SEA地贫患者全血样本进行检测，第1管模版为正常人标本，使用对照组的反应体系，第2管模版为正常人标本，使用SEA地贫组反应体系，第3管SEA地贫患者标本，使用SEA地贫组反应体系，检测的结果如图1所示，1、2、3号管分别为对照管阳性结果、SEA管阴性结果和SEA管阳性结果。
实施例2
灵敏度检测
样本提取：方法同实施例1。
反应分组：将提取的SEA阳性样本基因组DNA进行10倍稀释，分为6组，浓度分别为：原始样本、10%、1%、0.1%、0.01%、阴性对照。分别进行LAMP反应和PCR反应。
LAMP反应体系、反应条件和判读标准：方法同实施例1。如图2所示，结果原始样本、10%、1%、0.1%、组均发出绿色荧光，0.01%组和阴性对照组为黄色液体，无绿色荧光。说明LAMP方法的灵敏度>0.1%。
PCR反应体系：PCR反应体系见表4，使用的10X PCR 缓冲液、2.5 mM dNTP、DNA聚合酶均来自日本宝生物公司。PCR引物使用SEA-F3和SEA-B3。
表4 PCR反应体系的成分和含量
| 成分 | 含量 |
| 10X PCR缓冲液 | 2.5μl |
| SEA-F3 | 5 pmol each |
| SEA-B3 | 5 pmol each |
| DNA聚合酶 | 1U |
| DNA模版 | 5 μl |
| ddH2O | up to 25 μl |
PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。
PCR判读标准：取10 ul PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，100V 40 min，紫外灯下凝胶成像观察目标反应条带判断结果。如图3所示，结果原始样本、10%、1%有目标条带，0.1%组、0.01%、0.001%和阴性对照组无目标条带，说明PCR方法的灵敏度<0.1%，从而说明了PCR方法的灵敏度低。
实施例3
特异性检测
样本提取：方法同实施例1。
反应分组：分为6组，分别为SEA地贫患者、-3.7型alpha地贫患者、-4.2型alpha地贫患者、-28M型beta地贫患者、41/42M型beta地贫患者、正常人。
LAMP反应体系、反应条件和判读标准：方法同实施例1。如图4所示，结果SEA地贫患者样本发出绿色荧光，-3.7型alpha地贫患者、-4.2 型alpha地贫患者、-28M型beta地贫患者、41/42M型beta地贫患者、正常人组均为黄色液体，无绿色荧光。说明本方法方法对正常人及上述其它地贫类型样本无交叉反应，显示出良好的特异性。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种东南亚型地中海贫血的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、设计SEA地中海贫血特异性LAMP引物和人基因组内参LAMP引物，包括SEA-FIP、SEA-BIP、SEA-F3、SEA-B3、control-FIP、control-BIP、control-F3、control-B3共8条引物；
所设计的SEA地中海贫血特异性LAMP引物如下：
SEA-F3:CGATCTGGGCTCTGTGTTC
SEA-B3:TGGAGTGCAGTGTTGTAGTC
SEA-FIP: GGACGACCGAGTTCCTGCGATTTGAGGGAAGGAGGGGAGAAG
SEA-BIP: CCTTGGGGAGGTTCACTTGGAGAGCCTTGAACTCCTGGACTT
所设计的人基因组内参LAMP引物如下：
control-FIP：ATGCAGAGATATTGCTATTGGCACCATTCTAAAGAATAACAGT
control-BIP: AGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTCTTATCCCAACCATAAAATAAAAGC
control-F3: GATACAATGTATCATGCCTCTT
control-B3: TGGACTCAGAATAATCCAGC
b、提取人血基因组DNA：采用Chelex 100阳离子树脂吸附法提取，取300 ul全血样本，碱裂解红细胞，加入5％ Chelex-100阳离子树脂，温度56℃，水浴20min，高速涡旋振荡样本5～10s，高速离心2min，吸取上清作为步骤c中的人血基因组DNA样本；
c、LAMP扩增：把步骤b中所取得的人血基因组DNA样本分为对照管和SEA检测管两份；
在对照管中加入control-FIP、control-BIP、control-F3、control-B3引物，并加入LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、ddH2O，形成对照管LAMP反应体系；
在SEA检测管中加入SEA-F3、SEA-B3、SEA-FIP、SEA-BIP引物，并加入LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、ddH2O，形成SEA检测管LAMP反应体系；
对照管LAMP反应体系和SEA检测管反应体系在温度56℃、时间45min的反应条件下进行反应，反应结束后，分别得到对照管LAMP产物和SEA检测管LAMP产物；
d、LAMP产物检测：使用紫外灯荧光显色的方法，对步骤c中得到的对照管LAMP产物和SEA检测管LAMP产物进行检测；将对照管和SEA检测管放至紫外灯下，当对照管和SEA检测管均出现绿色荧光时，判断为SEA地贫阳性；当对照管出现绿色荧光、SEA检测管无绿色荧光时，判断为SEA地贫阴性；当对照管和SEA检测管均无绿色荧光时，判断为反应失败，需重新检测。
2.根据权利要求1所述的东南亚型地中海贫血的检测方法，其特征在于，步骤c中，LAMP反应缓冲液的成分和含量分别为：Tris (pH 8.8) 40 mM、KCl 20 mM、MgSO4 16mM、(NH4)2SO4 20mM、Tween 20 0.20%、甜菜碱 1.6M、dNTPs 2.8 mM each、MnCl2 1mM、钙黄绿素 50μM；
对照管LAMP反应体系的成分和含量分别为：LAMP反应缓冲液 12.5μl、control-FIP 40 pmol each、control-BIP 40 pmol each、control-F3 10 pmol each、control-B3 10 pmol each、Bst DNA聚合酶 8U、人血基因组DNA 5μl、ddH2O up to 25 μl；
SEA检测管LAMP反应体系成分和含量分别为：LAMP反应缓冲液 12.5μl、SEA-FIP 40 pmol each、SEA-BIP 40 pmol each、SEA-F3 10 pmol each、SEA-B3 10 pmol each、Bst DNA聚合酶 8U、人血基因组DNA 5μl、ddH2O up to 25 μl。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |