CN111575366A - 用于检测自闭症基因组拷贝数变异的引物组、探针组及试剂盒 - Google Patents

用于检测自闭症基因组拷贝数变异的引物组、探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测自闭症患者基因组变异的引物组、探针组及试剂盒，通过引物组SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8和探针SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.12可以检测自闭症相关的SHANK3、CHRNA7、GABRB3基因拷贝数的变异。本发明具有灵敏度高，检测时间短，成本低廉的特点。

Description

用于检测自闭症基因组拷贝数变异的引物组、探针组及试 剂盒
技术领域
本发明涉遗传病检测领域，特别涉及用于检测自闭症患者相关基因拷贝数变异的引物组、探针组及试剂盒。
背景技术
自闭症又称孤独症（autism）是常见神经系统发育失调导致的广泛性发育障碍，是复杂的遗传性多基因神经精神紊乱疾病。1943年，美国医生Kanner报道了11例行为异常的患者，并命名为“早期婴儿孤独症”，认为是儿童精神分裂症的一个亚型。经历了七十多年的研究，学术界和临床医生对自闭症的定义和认识已经发生了较大变化，对自闭症的认识已经从最初的看成一种心理疾病转变为看作一种生理疾病。而自闭症囊括的范围也逐渐增大，2013年美国精神障碍诊断与统计手册（Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders）第五版（简称DSM-Ⅴ），修订了自闭症的定义，统称为自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，简称ASD）。
自闭症的主要临床行为表现包括人际交流障碍、语言障碍和重复性刻板行为，病人同时在智力、感觉和情绪等方面也有相应的特征。患儿从出生开始就可以表现出与其他正常儿童不同的差异。自闭症在儿童的发病率为1%～2%，男性是女性4倍，根据WHO统计，在中国有150万-780万的孤独症患者。患有自闭症的儿童不仅身心健康受到损伤，且也给家庭带来沉重的经济和精神压力，因此自闭症在我国已经成为了一个急需关注的公共健康问题。
影响自闭症发生的基因有许多。在调查分析自闭症患者在基因组水平上的变异后，发现存在多种类型和多位点的变异，既有染色体区域的缺失重复，也有基因上的SNP。这些变异既有从父母遗传的也有新发的。对变异的基因进行分析，发现变异主要发生在与突触、染色质重构、转录、神经递质传递有关的基因上。但单个基因在自闭症群体中出现的概率不足1%。对神经细胞连接因子基因进行研究，发现SHANK1、SHANK2、SHANK3，NRXN1、NRXN2、NRXN3，NLGN3、NLGN4等基因都与自闭症发生有关。
传统的自闭症筛查方法主要是根据自闭症诊断标准，对待检者进行人际关系、语言交流、知觉等方面的表象观察，并依照标准进行确诊。这些方法的不足之处是只能患者进行初步的自闭症筛查，无法对患者基因变异进行确诊，而且在诊断时容易发生漏诊和误诊的情况，延误患者治疗，造成重症自闭症儿童的出现。因此，市场上迫切需要一种准确、快捷、成本低廉的自闭症诊断方法，对患者进行快速确诊。
发明内容
本发明的主要目的在于提出一种准确、快速、灵敏的用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的引物组、探针组及试剂盒。
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的引物组。
本发明的第二目的是，提供一种提供一种用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的探针组。
本发明的第三目的是，提供一种提供一种用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的PCR引物组，所述的引物组检测的基因包括NRXN1、SHANK3和CHRNA7基因。
进一步地，所述的引物组还包括检测内参基因RPP30的引物SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述探针组包括SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12，每一条探针两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
进一步地，每一条所述探针的熔解温度在60~65℃。
进一步地，所述荧光基团选择FAM、HEX、ROX、CY5，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团，且带有MGB修饰结构。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：用于检测自闭症多个基因拷贝数差异的试剂盒，包括权利要求1-5任意所述的引物组和探针组。
本发明的有益效果包括：
1.采用本发明的技术方案，可以检测并鉴别自闭症患者多基因位点的拷贝数变异。而且该方法操作简便、检测准确、灵敏、快速，2小时内可出结果。
2.本发明利用荧光PCR-探针技术，采用稳定扩增的内参基因作为对照，可以准确的计算出检测的目标基因的拷贝数，对基因拷贝数的分辨率高。该技术方案，检测的特异性高，成本较低。
附图说明
图1. 样品的NRXN1目标基因扩增曲线图
图2. 样品的SHANK3目标基因扩增曲线图
图3. 样品的CHRNA7目标基因扩增曲线图
图4. 样品的RPP30内参基因扩增曲线图
具体实施方式
本发明涉及检测自闭症患者多基因位点拷贝数变异的引物组、探针组、反应液及试剂盒。下面结合具体实施方式及附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
实施例1 引物及探针
根据本发明的实施例，对自闭症患者多基因位点拷贝数变异检测的引物组、探针组、反应液及试剂盒将用于以下4个基因进行检测，分别为：NRXN1、SHANK3、CHRNA7和内参基因RPP30。
在一些实施例中，可以通过PCR扩增待检者的血液基因组DNA中的基因片段以及内参基因RPP30的引物对：
表1 目标基因和内参基因引物序列
Figure 609600DEST_PATH_IMAGE001
其中“F”表示上游引物，“R”表示下游引物。
在一些实施例中，采用如下3条探针针对自闭症相关基因的探针和内参RPP30基因的探针。探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，探针序列如下表2。
表2 目标基因和内参基因探针序列
Figure 526741DEST_PATH_IMAGE002
其中，FAM、ROX、CY5、HEX为荧光基团，MGB为修饰结构，可以与DNA小沟结合，提高探针的退火温度。
每条探针的熔解温度范围在60~65℃，不同探针的Tm值尽量接近。
在其他实施例中，每一条探针的荧光基团可以互换，上述序列对应的荧光基团和淬灭基团不限于上述特定类型。
在其他实施例中，用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的PCR反应液可以包括上述至少两对引物对以及相应的至少两条探针。较优的是，在PCR反应液中，必须包含一对内参基因引物对及相应的内参探针。
在一些实施例中，PCR反应液中除上述引物对和探针以外，还包括DNA聚合酶、10×Buffer、dNTP等，以进行PCR反应液的配制和PCR扩增。扩增程序可以包括高温变性、低温复性、片段延伸等。
在一些实施例中，依据内参基因的Ct值和目标基因的Ct值的差值△Ct，及待检样本和参照样本的目标基因的△△Ct，依据2-△△Ct方法计算目标基因拷贝数。
在一些实施例中，用于检测自闭症患者多个基因拷贝数变异的试剂盒包括至少一人份上述PCR反应液。
实施例2 检测过程
以下通过具体的实施例进行进一步说明。
（a）样品收集
收集正常对照和自闭症患者的血液样品，EDTA抗凝，-20℃冷冻保存。
（b）样品血液基因组DNA提取
使用市售的人基因组DNA提取试剂盒提取待检者的血液DNA，具体操作按其说明书进行。
（c）引物设计
从GenBank中搜索拟检测的3个目标基因NRXN1、SHANK3、CHRNA7及1个内参基因RPP30的保守序列，分别设计多组备选引物，确保理论上每对引物能特异的扩增出目标基因，并且不与其他基因发生非特异扩增。再通过实验验证和筛选。
（d）探针设计
在引物的扩增区域内，分别设计3个目标基因和1个内参基因的多组备选探针，应该保证所设计探针的特异性，确保所设计的探针理论上与相应的目标基因特异结合，在延伸温度下，不与其他基因发生非特异结合。所设计的探针的Tm值范围在60~65℃，且探针间Tm值应尽量接近，以保证结合效率接近。所有设计的探针分别用不同的荧光基团标记，本例中分成四种荧光标记。
（e）PCR反应液配制
将所有引物和探针加入PCR反应液中，最终的一管PCR反应液基本组成如下表：
Figure 306478DEST_PATH_IMAGE003
（f）反应程序设置
荧光PCR扩增的基本程序设置如下：
Figure 29583DEST_PATH_IMAGE004
（g）基因拷贝数计算
以RPP30基因为内参基因，其拷贝数为2个。依据内参基因的Ct值和目标基因的Ct值的差值△Ct，及待检样本和正常对照样本的目标基因的△△Ct，依据2-△△Ct方法计算目标基因拷贝数。
样本内Ct值差异：△Ct=Ct(目标基因)-Ct(内参基因)
样本间Ct值差异：△△Ct=△Ct(待测样本)-△Ct(正常对照样本)
计算目标基因与内参基因的拷贝数的相对比值：RQ值=2-△△Ct
待测样本中目标基因拷贝数=2×RQ
利用2-△△Ct方法计算待检样本中三个自闭症相关基因NRXN1、SHANK3、CHRNA7基因的拷贝数。图1、图2、图3和图4为部分样本的NRXN1、SHANK3、CHRNA7、RPP30的荧光定量PCR扩增曲线图。
表3 用2-△△Ct法计算所检测样本的基因拷贝数
Figure 843955DEST_PATH_IMAGE005
以上实施例是可以同时检测3个自闭症相关基因的示例，在其他实施例中，也可以只检测1个和2个自闭症相关基因，或者在多管中检测多个自闭症相关基因。
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例作出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市亿立方生物技术有限公司
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 1
gcagcagcag tcgccttatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 2
ctcgagccag agcctgaagc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 3
gaagctggac gagatgctgg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 4
cggctctgga gtctgcgtct g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 5
cagaatatcc aggggtgaag 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 6
gagaagaatg tctggtttcc a 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 7
gatttggacc tgcgagcg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 8
gcggctgtct ccacaagt 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 9
tagacctcag gaaattcgct t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 10
ccgccgcaga gccaacgctg c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 11
ctggccatct gggaaacg 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 12
ctgacctgaa ggctct 16

Claims (6)

1.用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的PCR引物组，其特征在于，所述的引物组包括SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.6，引物组检测的基因包括NRXN1、SHANK3和CHRNA7。
2.根据权利要求1所述的用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的PCR引物组，所述的引物组还包括检测内参基因RPP30的引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
3.用于检测自闭症患者多基因拷贝数变异的探针组，其特征在于，所述探针组包括SEQID NO.9~ SEQ ID NO.12，每一条探针两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的探针组，其特征在于，每一条所述探针的熔解温度在60~65℃。
5.根据权利要求3所述的探针组，其特征在于，所述荧光基团选择FAM、HEX、ROX、CY5，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团，且带有MGB修饰结构。
6.用于检测自闭症多个基因拷贝数差异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任意所述的引物组和探针组。
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