CN117070607B - 一种检测人脊髓性肌萎缩症smn1和smn2基因拷贝数的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的荧光定量PCR试剂盒。本发明设计了检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合。本发明同时设置了SMN1第7外显子和SMN2第7外显子Exon7荧光探针，通过荧光探针之间的相互竞争作用，提高检测的特异性。在检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的特异性位点进行了锁核酸修饰，降低了核糖结构的柔韧性，对DNA、RNA有更强大的亲和力，并提高Tm值，提高对单碱基错配的敏感度。此外，竞争性Blocker和Touch down PCR技术进一步减少彼此干扰而产生的非特异扩增，实现了单管多通道同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的荧光定量PCR试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种较为常见的常染色体隐性遗传病，其是由脊髓前角ɑ-运动神经元退化变性，进而导致肌无力和肌萎缩。SMA是儿童最常见的神经肌肉病，发病率为1/6000～1/10000，致病基因携带率为1/40～1/50，具有种族差异性。
人基因组有两个高度同源的SMN基因，位于人5号染色体的5q13位置，包括端粒侧的运动神经元存活基因1(SMN1)和着丝粒侧的运动神经元存活基因2(SMN2)。SMN1和SMN2同源性>99.9％，均含有9个外显子，且仅存在5个碱基的差异。
SMN1决定疾病的发生，而SMN2影响疾病的严重程度和进展。研究表明，SMN1基因是SMA的致病基因，大多数(90.0％以上)SMA患者有SMN1基因第7和/或第8外显子的纯合缺失突变；而SMN2基因是SMA症状轻重的调节基因，其拷贝数与SMA病情的严重程度有关，轻型SMA患者通常比重型SMA具有更多的SMN2拷贝数，即SMN2能在一定程度上弥补SMN1缺失所造成的功能缺陷。
2020年《脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专家共识》明确SMN1发生双等位基因的致病性变异是SMA诊断的主要依据，临床诊断或者临床疑似SMA的患者均应进行基因检测。基因检测的目标基因为SMN1和SMN2。其中SMN1拷贝数和致病性变异的检测结果用于疾病诊断或排除诊断，SMN2拷贝数的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管理和预后评估的参考指标。由于在人类基因组中SMN1和SMN2高度同源，需分别针对SMN1和SMN2进行基因检测。
多重连接探针扩增技术(MLPA)作为诊断SMA的金标准，被国内外SMA管理共识推荐使用。MLPA技术针对SMN1与SMN2基因第7和第8外显子的碱基差异位点设计杂交探针，采用其他染色体位点的多个管家基因作为内参基因，以SMN1：SMN2不同拷贝数的样本作为平行对照，在完成杂交连接等反应后，根据荧光峰面积的比值比来判段目标基因序列的拷贝数。MLPA技术可以直接检测SMN1和SMN2第7、8外显子的拷贝数，明确区分纯合缺失患者，杂合缺失携带者和正常人。但是该方法学实验步骤较为繁琐，容易出现失误。例如实验要在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行后处理，在操作过程中易发生实验室污染。而且该方法试剂成本较高，测试需要一代基因测序仪。实验耗时长，从DNA提取完成到数据分析得到结果至少需要2个工作日，难以在临床上进行大规模人群筛查和技术推广。
近年来，越来越多学者在研究基于荧光定量PCR技术的SMA检测方法。其主要原理是通过多重实时荧光定量PCR反应，以管家基因为内参，采用Taqman探针法分别对SMN1和SMN2第7和第8外显子的拷贝数进行相对定量。该方法操作简单、成本低廉，适用于大规模筛查。但特异性不及MLPA技术，在区分基因的1个拷贝或2个拷贝上定量能力一般。常规荧光定量检测方法，在一个荧光定量扩增体系中，通过特异性引物和探针，同时检测目的基因和内参基因，并通过比较目的基因和内参基因Ct值差异确定目的基因拷贝数。但是SMN1和SMN2基因拷贝数检测有两个特殊的困难。一是临床检测需求要区分SMA携带者和正常人，即区分1拷贝和2拷贝，理论上，1拷贝的Ct值和2拷贝的Ct值差异只有1，要保证有效区分Ct差异为1的样本这对检测的特异性和稳定性要求非常高；二是SMN1和SMN2基因序列一致性非常高，SMN1和SMN2很容易引起相互的非特异的扩增，干扰定量准确程度。大样本的研究表明，在携带者群体中，SMN2基因拷贝数可多达4个以上，对于只有1个拷贝SMN1的携带者而言，当SMN1与SMN2采用公用引物进行扩增时，将无法避免多拷贝SMN2基因优势扩增对单拷贝SMN1基因的影响(因为此时二者的PCR引物相同)，同样会导致相对定量结果的偏差。
随着以降低SMA患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及SMA发病机制及分子流行病学的深入研究，开发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的快速检测SMN1和SMN2基因拷贝数，准确区分SMA患者、携带者和正常人的新型分子诊断试剂盒为当前迫切之需。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的荧光定量PCR试剂盒。
常规的荧光定量PCR技术可以只利用一个碱基的差异实现特异性检测，但在实际应用中，其检测稳定性难以保证，常常出现区分度较差的情况。本发明提出的试剂盒，利用多重实时荧光定量PCR技术和高特异性的引物探针组合，避免了同源序列之间相互干扰而产生的非特异扩增，实现了单管多通道同时检测SMN1基因Exon7和Exon8以及SMN2基因Exon7的拷贝数。
本发明的第一个目的是提供一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合。
本发明的第二个目的是提供所述的引物探针组合在制备检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合，
检测SMN1和SMN2基因第7外显子Exon7的共用引物的核苷酸序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示；检测SMN1基因第8外显子Exon8的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示；
检测SMN1基因第7外显子Exon7的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；进行了锁核酸修饰，降低了核糖结构的柔韧性，对DNA、RNA有更强大的亲和力，并提高Tm值，提高对单碱基错配的敏感度。
检测SMN2基因第7外显子Exon7的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步地，还包括抑制SMN2基因第8外显子Exon8扩增和/或产生荧光信号的Blocker，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
进一步地，还包括检测内参基因B2M的引物和探针，所述检测内参基因B2M的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述检测内参基因B2M的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
进一步地，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述荧光基团为FAM、VIC、ROX或CY5。
进一步地，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1、MGB-NFQ或BHQ2。
进一步地，检测SMN1基因第7外显子Exon7的探针的5’端标记荧光基团为FAM，3’端标记荧光淬灭基团为BHQ1；
检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的5’端标记荧光基团为VIC，3’端标记荧光淬灭基团为MGB-NFQ；
检测SMN2基因第7外显子Exon7的探针的5’端标记荧光基团为ROX，3’端标记荧光淬灭基团为MGB-NFQ；
检测内参基因B2M的探针的5’端标记荧光基团为CY5，3’端标记荧光淬灭基团为BHQ2。
进一步地，所述Blocker的3’端经磷酸化修饰。
本发明还提供所述的引物探针组合在制备检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒中的应用。
基于此，本发明还请求保护一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有所述引物探针组合。
进一步地，所述试剂盒中还含有PCR反应试剂，所述PCR反应试剂含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、UNG酶、甘油、BSA和热启动taq酶中的一种或几种。
进一步地，所述的PCR反应试剂由Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、UNG酶、甘油、BSA、热启动taq酶和水组成。
进一步地，所述PCR反应试剂可以由25～45mmol/L Tris-HCl、160～280mmol/LKCl、15～25mmol/L MgCl2、0.8～1mmol/L dNTP、0.1～1U/μL UNG酶、3～6％(W/V)甘油、4～10μg/mL BSA、0.5～1U/μL热启动taq酶的水溶液组成。
进一步地，所述PCR反应试剂由35mmol/L Tris-HCl、200mmol/L KCl、20mmol/LMgCl2、1mmol/L dNTP、0.2U/μL UNG酶、4％(W/V)甘油、10μg/mLBSA和1U/μL热启动taq酶的水溶液组成。
进一步地，所述试剂盒中还含有去离子水。
进一步地，所述试剂盒中还含有经MLPA验证过的SMA携带者DNA作为SMN1和SMN2基因1拷贝质控品；以及经MLPA验证过SMA正常人DNA作为SMN1和SMN2基因2拷贝质控品。
其中，SMN1和SMN2基因1拷贝质控品SMN-control-1中，SMN1基因第7外显子Exon7、SMN1基因第8外显子Exon8、SMN2基因第7外显子Exon7和内参基因B2M的拷贝数比例为1：1：1：2；
SMN1和SMN2基因2拷贝质控品SMN-control-2中，SMN1基因第7外显子Exon7、SMN1基因第8外显子Exon8、SMN2基因第7外显子Exon7和内参基因B2M的拷贝数比例为2：2：2：2。
SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8和SMN2基因Exon7的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。SMN1基因在NCBI上的Gene ID为6606，SMN2基因在NCBI上的Gene ID为6607，内参基因B2M在NCBI上的Gene ID为567。
进一步地，在使用所用试剂盒时，包括以下步骤：
首先配置PCR反应体系并进行反应：
1、制备DNA模板：
提取血液样本中的基因组DNA，去离子水稀释基因组DNA浓度至10～20ng/μL，作为样本DNA模板。
2、稀释对照品
将SMN1和SMN2基因1拷贝质控品，及SMN1和SMN2基因2拷贝质控品分别稀释，得到1、2和4倍三个浓度梯度，备用。
去离子水替代DNA模板作为空白对照。
3、配制PCR反应体系
所述PCR反应体系由所述引物探针组合、PCR反应试剂、去离子水和DNA模板组成。
4、在荧光PCR仪上进行Touchdown PCR反应，每一循环实时采集FAM、VIC、ROX和CY5荧光信号，PCR扩增反应程序为：
50℃2min，95℃5min，1个循环；95℃10s，70℃50s，1个循环；95℃10s，69℃50s，1个循环；95℃10s，68℃50s，1个循环；95℃10s，67℃50s，1个循环；95℃10s，66℃50s，1个循环；95℃10s，65℃50s，1个循环；95℃10s，64℃50s，1个循环；95℃10s，63℃50s，1个循环；95℃10s，62℃50s，1个循环；95℃10s，61℃50s，1个循环；95℃10s，60℃50s，30个循环。
5、结果分析
对实时荧光PCR检测得到的数据进行分析，计算SMN1和SMN2基因拷贝数，从而判别所述基因样本是否来源于脊髓性肌萎缩症基因携带者。目的基因SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8和SMN2基因Exon7分别用FAM、VIC和ROX标记的探针检测，参比基因B2M用CY5标记的探针检测，对照样本为SMN1和SMN2基因2拷贝质控品SMN-control-2。按下述公式进行计算样品SMN1和SMN2基因的拷贝数：
待检样本目的基因△Ct＝Ct目的基因-Ct参比基因；
待检样本目的基因△△Ct＝△Ct待检样本-△Ct对照样本；
RQ＝2-△△Ct。
结果判读为：
(1)无RQ值或RQ值＜0.125，拷贝数为0，表示纯合缺失型基因型；
(2)0.25＜RQ值＜0.65，拷贝数为1，表示杂合缺失型基因型；
(3)0.75＜RQ值＜1.25，拷贝数为2；或RQ值＞1.25，拷贝数＞2；表示正常型基因型；
(4)当检测结果的RQ值位于0.125～0.25、0.65～0.75临界区间时，需重新检测。在样本满足试剂盒检测纯度的要求下，可将DNA浓度浓缩或稀释至10～20ng/μL进行重检，对照样本设置三个重复，取均值进行分析；若重检结果依然位于临界区间，请结合多重连接探针扩增技术(MLPA)进行拷贝数分析。
另外，检验结果应满足的质控标准为：
SMN1和SMN2基因1拷贝质控品的所有Ct均值为24＜Ct＜29，0.25＜RQ值＜0.65；
SMN1和SMN2基因2拷贝质控品的所有Ct均值为24＜Ct＜29，0.75＜RQ值＜1.25；
空白对照所有Ct均值＞35或无Ct值。
SMN1基因Exon7和Exon8以及SMN2基因Exon7的拷贝数的分析，采用ΔΔCt值法相对定量方式，其依据是每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，比较测试样本中SMN基因Ct值与内参B2M基因Ct值差值的变化，就可对未知标本SMN基因的原始拷贝数做出判断。理论上，1拷贝的Ct值和2拷贝的Ct值差异只有1，所以SMA携带者与正常人ΔΔCt理论上也为1。纯合缺失的SMA患者在理论上是没有荧光信号的，但实际检测时SMN1和SMN2同源序列之间相互干扰可能会产生少量非特异扩增。
进一步地，所述引物探针的浓度都为10～100μM。
进一步地，所述引物探针的浓度都为100μM。
进一步地，所述PCR反应试剂的体积为10～15μL。
进一步地，所述PCR反应试剂的体积为12.5μL。
进一步地，所述检测SMN1和SMN2基因第7外显子Exon7的共用上下游引物的体积都为0.06～0.20μL。
进一步地，检测SMN1和SMN2基因第7外显子Exon7的共用上下游引物的体积都为0.12μL。
进一步地，所述检测SMN1基因第8外显子Exon8的上下游引物的体积都为0.04～0.18μL。
进一步地，进一步地，检测SMN1基因第8外显子Exon8的上下游引物的体积都为0.08μL。
进一步地，所述检测内参基因B2M的上下游引物的体积都为0.08～0.16μL。
进一步地，检测内参基因B2M的上下游引物的体积都为0.1μL。
进一步地，所述检测SMN1基因第7外显子Exon7的探针的体积为0.08～0.18μL。
进一步地，所述检测SMN1基因第7外显子Exon7的探针的体积为0.12μL。
进一步地，所述检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的体积为0.03～0.12μL。
进一步地，所述检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的体积为0.08μL。
进一步地，所述检测SMN2基因第7外显子Exon7的探针的体积0.07～0.20μL。
进一步地，所述检测SMN2基因第7外显子Exon7的探针的体积为0.12μL。
进一步地，所述检测内参基因B2M的探针的体积为0.08～0.2μL。
进一步地，所述检测内参基因B2M的探针的体积为0.1μL。
进一步地，所述Blocker的体积为0.03～0.12μL。
进一步地，所述Blocker的体积为0.08μL。
对于对照品反应，分别取稀释后的对照品5μL替换样本DNA模板；阴性对照反应，采用去离子水替换样本DNA模板。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明避免了同源序列之间相互干扰而产生的非特异扩增，实现了单管多通道同时检测SMN1基因Exon7和Exon8以及SMN2基因Exon7的拷贝数。
(2)本发明分别针对SMN1与SMN2基因Exon7的碱基差异位点，设计了一对共用引物以及两条检测SMN1第7外显子和SMN2第7外显子Exon7的高特异性荧光标记Taqman探针。通过荧光探针之间的相互竞争作用，消除彼此干扰而产生的非特异扩增，提高检测的特异性，实现了SMN1和SMN2基因Exon7拷贝数的同时准确检测。
(3)本发明在检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的特异性位点进行了锁核酸修饰，降低了核糖结构的柔韧性，对DNA、RNA有更强大的亲和力，并提高Tm值，提高对单碱基错配的敏感度。
(4)本发明的竞争性Blocker分别针对SMN1与SMN2基因Exon8的碱基差异位点，通过相互的竞争性抑制作用，消除彼此干扰而产生的非特异扩增。进一步地，所述Blocker 3’端被磷酸化修饰封闭无法继续延伸，在特异性地阻止SMN2基因Exon8模板扩增的同时也阻止探针SMN1-Exon8-P在SMN2基因Exon8的非特异性结合，故无法产生荧光信号。长序列的Blocker覆盖了SMN2基因Exon8结合位点及上游引物的部分结合区域，Blocker的阻挡使上游引物难以结合，进一步抑制了SMN2基因Exon8的扩增。
(4)本发明的Touchdown PCR技术是一种改进的PCR策略，它通过逐渐降低退火温度来增加PCR扩增的特异性，进一步减少彼此干扰而产生的非特异扩增。在每个循环的开始，引物的退火温度会较高，然后逐渐降低到特异性的退火温度。这个策略有助于减少非特异性扩增，从而增加特异性产物的优势。在SMA拷贝数检测中，使用touchdown PCR可以帮助优化PCR反应的条件，减少可能出现的非特异性扩增，提高PCR的准确性。通过确保扩增产物的特异性，可以减少解释结果时的混淆，并提高SMA拷贝数检测的可靠性。
(5)本发明的试剂盒通过优化各组分浓度，基因扩增曲线几乎同时起跳，正常人检测结果中目标基因扩增曲线Ct值与内参接近，极大增加了结果判读的简易性，仅凭肉眼便可初步判断出检测样本拷贝数是否异常。
附图说明
图1为正常人样本1的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝2：2：2：2)。
图2为正常人样本2的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝2：2：0：2)。
图3为正常人样本2的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝3：3：1：2)。
图4为SMA患者样本1的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝0：1：3：2)。
图5为SMA患者样本2的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝0：0：3：2)。
图6为SMA携带者样本1的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝1：1：3：2)。
图7为SMA携带者样本2的荧光定量PCR图(SMN1基因Exon7：SMN1基因Exon8：SMN2基因Exon7：内参基因B2M＝2：1：2：2)。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的荧光定量PCR试剂盒
一、试剂盒的组成
1、引物探针
(1)SMN1和SMN2基因第7外显子Exon7的共用引物：上游引物SMN-Exon7-F1；下游引物SMN-Exon7-R1。
(2)SMN1基因第8外显子Exon8的特异性引物：上游引物SMN1-Exon8-F1；下游引物SMN1-Exon8-R1。
(3)内参基因B2M的特异性引物：上游引物B2M-F1，下游引物B2M-R1。
(4)检测SMN1基因第7外显子Exon7的探针：SMN1-Exon7-P1，其5’端用FAM荧光基团标记。
(5)检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针：SMN1-Exon8-P1，其5’端用VIC荧光基团标记。
(6)检测SMN2基因第7外显子Exon7的探针：SMN2-Exon7-P1，其5’端用ROX荧光基团标记。
(7)检测内参基因B2M的探针：B2M-P1，其5’端用CY5荧光基团标记。
(8)SMN2Exon8特异性Blocker：SMN2-Exon8-B1。
上述引物探针的核苷酸序列如表1所示。
表1引物探针序列
2、PCR反应试剂：由35mmol/L Tris-HCl、200mmol/L KCl、20mmol/L MgCl2、1mmol/L dNTP、0.2U/μL UNG酶、4％(W/V)甘油、10μg/mL BSA和1U/μL热启动taq酶的水溶液组成。
3、SMN1和SMN2基因1拷贝质控品：SMN-control-1；即SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8、SMN2基因Exon7和内参基因B2M的DNA溶液，其拷贝数比依次为1：1：1：2。
4、SMN1和SMN2基因2拷贝质控品：SMN-control-2；即SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8、SMN2基因Exon7和内参基因B2M的DNA溶液，其拷贝数比依次为2：2：2：2。
5、去离子水，经高温灭菌。
SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8和SMN2基因Exon7的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。SMN1基因在NCBI上的Gene ID为6606，SMN2基因在NCBI上的Gene ID为6607，内参基因B2M在NCBI上的Gene ID为567。
二、使用方法
1、制备基因组DNA：
按医疗常规操作采集人外周静脉血200μL，加入EDTA抗凝剂。采用凯普生物公司生产的全自动核酸提取仪HBNP-4801A和磁珠法DR-4801-KZ型核酸提取试剂抽提人外周静脉血的基因组DNA，洗脱体积为60μL，采用微量分光定量仪Nano100定量，OD260/OD280的比值应为1.8～2.0，使用去离子水稀释基因组DNA浓度至10～20ng/μL，作为样本DNA模板。
2、梯度稀释对照品：
SMN基因杂合缺失对照品准备：将SMN1和SMN2基因1拷贝质控品SMN-control-1分别稀释1、2和4倍三个浓度梯度，备用。
SMN基因正常对照品准备：SMN1和SMN2基因2拷贝质控品SMN-control-2分别稀释1、2和4倍三个浓度梯度，备用。
具体稀释方法为：取100μL对照品加入到1.5mL离心管中，再加入去离子水100μL，混匀后得到2倍稀释对照品；从2倍稀释对照品溶液中，取出100μL，加入至1只新的1.5mL离心管，再加入去离子水100μL，混匀后得到4倍稀释对照品。去离子水替代DNA作为空白对照。
3、配制PCR反应体系
总反应体系为25μL，反应体系组成如表2所示。
表2PCR反应体系
| 试剂名称及浓度 | 体积 | 试剂名称及浓度 | 体积 |
| 2×PCR反应试剂 | 12.5μL | 去离子水 | 6.4μL |
| SMN-Exon7-F1(100μM) | 0.12μL | SMN1-Exon7-P1(100μM) | 0.12μL |
| SMN-Exon7-R1(100μM) | 0.12μL | SMN1-Exon8-P1(100μM) | 0.08μL |
| SMN1-Exon8-F1(100μM) | 0.08μL | SMN2-Exon7-P1(100μM) | 0.12μL |
| SMN1-Exon8-R1(100μM) | 0.08μL | B2M-P1(100μM) | 0.1μL |
| B2M-F1(100μM) | 0.1μL | SMN2-Exon8-B1(100μM) | 0.08μL |
| B2M-R1(100μM) | 0.1μL | 样本DNA模板 | 5μL |
对于对照品反应，分别取稀释后的对照品5μL替换样本DNA模板；阴性对照反应，采用去离子水替换样本DNA模板。
4、PCR反应
在宏石SLAN 96S实时荧光PCR仪(也可选其他品牌的实时荧光PCR仪)上进行PCR反应，每一循环实时采集FAM、VIC、ROX和CY5荧光信号，PCR扩增反应程序如表3所示。
表3 PCR扩增反应程序
三、结果分析
对实时荧光PCR检测得到的数据进行分析，计算SMN1和SMN2基因拷贝数，从而判别所述基因样本是否来源于脊髓性肌萎缩症基因携带者。目的基因SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8和SMN2基因Exon7分别用FAM、VIC和ROX标记的探针检测，参比基因B2M用CY5标记的探针检测，对照样本为SMN1和SMN2基因2拷贝质控品SMN-control-2。按下述公式进行计算样品SMN1和SMN2基因的拷贝数：
待检样本目的基因△Ct＝Ct目的基因-Ct参比基因；
待检样本目的基因△△Ct＝△Ct待检样本-△Ct对照样本；
RQ＝2-△△Ct。
结果判读如表4所示。
表4结果判读
当检测结果的RQ值位于0.125～0.25、0.65～0.75临界区间时，需重新检测。在样本满足试剂盒检测纯度的要求下，可将DNA浓度浓缩或稀释至10～20ng/μL进行重检，对照样本设置三个重复，取均值进行分析；若重检结果依然位于临界区间，请结合多重连接探针扩增技术(MLPA)进行拷贝数分析。
检验结果应满足的条件如表5所示。
表5质控标准
SMN1基因Exon7和Exon8以及SMN2基因Exon7的拷贝数的分析，采用ΔΔCt值法相对定量方式，其依据是每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，比较测试样本中SMN基因Ct值与内参B2M基因Ct值差值的变化，就可对未知标本SMN基因的原始拷贝数做出判断。理论上，1拷贝的Ct值和2拷贝的Ct值差异只有1，所以SMA携带者与正常人ΔΔCt理论上也为1。
实施例2实际样本检测
一、实验方法
准备正常人样本、SMA患者样本和SMA携带者样本。再用实施例1的试剂盒、对照品和检测方法检测上述样本。
其中，正常人样本1中，SMN1基因Exon7、SMN1基因Exon8、SMN2基因Exon7和内参基因B2M的拷贝数比例依次为2：2：2：2。
正常人样本2中，上述基因拷贝数比例为2：2：0：2。
正常人样本3中，上述基因拷贝数比例为3：3：1：2。
SMA患者样本1中，上述基因拷贝数比例为0：1：3：2。
SMA患者样本2中，上述基因拷贝数比例为0：0：3：2。
SMA携带者样本1中，上述基因拷贝数比例为1：1：3：2。
SMA携带者样本2中，上述基因拷贝数比例为2：1：2：2。
二、实验结果
如图1～7所示，在各个基因拷贝数均为2时，其扩增曲线几乎同时起跳。正常人检测结果中目标基因扩增曲线Ct值与内参基因B2M接近。而当检测基因拷贝数为1时，其扩增曲线相较内参会往后延1个Ct左右，极大增加了结果判读的简易性，仅凭肉眼便可初步判断出检测样本拷贝数是否异常。
实施例3不同SMN1基因Exon8探针对检测效果的影响
一、实验方法
如表6所示，设计不含锁核酸修饰的SMN1基因Exon8探针SMN1-Exon8-P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，替换实施例1的试剂盒中的SMN1-Exon8-P1，试剂盒的其他组分、对照品和检验方法均不变。检测样本为实施例2中的SMA患者样本2。
表6 SMN1基因Exon8探针序列
| 名称 | 核苷酸序列 | 序列编号 |
| SMN1-Exon8-P1 | ATCTGTAAAAGACTG+GGGTG | SEQ ID NO：8 |
| SMN1-Exon8-P2 | ATCTGTAAAAGACTGGGGTG | SEQ ID NO：15 |
二、实验结果
如表7所示，没有经过锁核酸修饰的探针SMN1-Exon8-P2在检测SMA患者样本时，尽管判读结果仍然是拷贝数为0，但仍会产生较多的非特异性扩增。经过锁核酸修饰的探针SMN1-Exon8-P1的非特异性扩增会大幅降低，由此可见锁核酸修饰可以提高检测的特异性。
表7SMN1基因Exon8探针检测实验结果
实施例4不同SMN2基因Exon8特异性Blocker对检测效果的影响
一、实验方法
设计另外三条SMN2基因Exon8特异性Blocker，其核苷酸序列如表8所示，分别替换实施例1的试剂盒中的SMN2-Exon8-B1，试剂盒的其他组分、对照品和检验方法不变。检测样本为实施例2中的SMA患者样本2。
表8SMN2基因Exon8特异性Blocker序列
二、实验结果
如表9所示，SMN2基因Exon8检测的特异性与Blocker序列长度呈明显正相关，Blocker越长，0拷贝的SMA患者样本检测的非特异性扩增越少，长序列的Blocker覆盖了SMN2基因Exon8结合位点及上游引物的部分结合区域，Blocker的阻挡使上游引物难以结合，进一步抑制了SMN2基因Exon8的扩增。
表9 SMN2基因Exon8特异性Blocker检测结果
实施例5不同引物探针浓度对检测效果的影响
一、实验方法
根据表10配置4种配方的反应体系，剂盒的其他组分、对照品和检验方法不变。检测样本为实施例2中正常人样本1。配方1为实施例1中的PCR反应体系。
表10引物探针浓度配方
| 试剂名称及浓度 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 |
| 2×PCR反应试剂 | 12.5μL | 12.5μL | 12.5μL | 12.5μL |
| SMN-Exon7-F(100μM) | 0.12μL | 0.06μL | 0.16μL | 0.20μL |
| SMN-Exon7-R(100μM) | 0.12μL | 0.06μL | 0.16μL | 0.20μL |
| SMN1-Exon8-F(100μM) | 0.08μL | 0.04μL | 0.12μL | 0.18μL |
| SMN1-Exon8-R(100μM) | 0.08μL | 0.04μL | 0.12μL | 0.18μL |
| B2M-F(100μM) | 0.1μL | 0.1μL | 0.1μL | 0.1μL |
| B2M-R(100μM) | 0.1μL | 0.1μL | 0.1μL | 0.1μL |
| SMN1-Exon7-P(100μM) | 0.12μL | 0.08μL | 0.14μL | 0.18μL |
| SMN1-Exon8-P(100μM) | 0.08μL | 0.03μL | 0.10μL | 0.12μL |
| SMN2-Exon7-P(100μM) | 0.12μL | 0.07μL | 0.15μL | 0.20μL |
| B2M-P(100μM) | 0.1μL | 0.1μL | 0.1μL | 0.1μL |
| SMN2-Exon8-B(100μM) | 0.08μL | 0.03μL | 0.10μL | 0.12μL |
| 去离子水 | 6.40μL | 6.79μL | 6.15μL | 5.82μL |
| 样本DNA模板 | 5μL | 5μL | 5μL | 5μL |
二、实验结果
如表11所示，各配方中随着引物探针浓度地提高，扩增效率也会有所上升，Ct值会减小，RQ值均符合0.75～1.25，判读结果都为2拷贝。在配方1中，各靶标的Ct值相近，其扩增曲线几乎同时起跳，故选择配方1(实施例1中的PCR反应体系)最优。
表11配方1～4的反应体系检测结果
实施例6试剂盒准确度
一、实验方法
使用实施例1的试剂盒和检测方法，检测临床15例SMA患儿、15例SMA携带者以及200例随机人群，共230例样本。
用荷兰MRC公司的P060SMA probemix 100rxn检测试剂盒(技术原理为MLPA，Cat.No.P060-100R)对实施例1的试剂盒和检测方法的检测结果进行验证。操作按试剂盒说明书进行，产物采用ABI 3500遗传分析仪进行检测。
二、实验结果
本发明实施例1的试剂盒的检测结果与MLPA检测结果完全一致，准确率达100％。
实施例7试剂盒重复性
一、实验方法
对实施例1和2中SMN基因不同拷贝数的样本进行重复性检测实验。选取3个批次的实施例1试剂盒产品，不同人(2人)使用试剂盒检测，每次检测中，每个样本重复3次，评价实施例1试剂盒的重复性。
二、实验结果
各批次检测结果一致，实施例1试剂盒检测重复性良好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合，其特征在于，
检测SMN1和SMN2基因第7外显子Exon7的共用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；
检测SMN1基因第8外显子Exon8的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示；
检测SMN1基因第7外显子Exon7的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
检测SMN1基因第8外显子Exon8的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
检测SMN2基因第7外显子Exon7的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
还包括抑制SMN2基因第8外显子Exon8扩增和/或产生荧光信号的Blocker，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括检测内参基因B2M的引物和探针，所述检测内参基因B2M的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述检测内参基因B2M的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述荧光基团为FAM、VIC、ROX或CY5。
4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1、MGB-NFQ或BHQ2。
5.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述Blocker的3’端经磷酸化修饰。
6.权利要求1～5所述的引物探针组合在制备检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒中的应用。
7.一种检测人脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～6所述引物探针组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PCR反应试剂，所述PCR反应试剂含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、热启动taq酶、UNG酶、甘油和BSA中的一种或几种。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有去离子水。
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