CN113088566B

CN113088566B - 人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒及分析方法

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Publication number: CN113088566B
Application number: CN202110449459.XA
Authority: CN
Inventors: 王小舟; 王雨; 徐�明; 苗保刚; 李明; 彭年才
Original assignee: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113088566A

Abstract

本发明公开了一种人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒及分析方法，所述试剂盒包括SMN1－7主反应液、SMN1－8主反应液、SMN1酶混合液、0拷贝质控品、SMN1－7单拷贝质控品、SMN1－7两拷贝标准品、SMN1－8单拷贝质控品、SMN1－8两拷贝标准品，所述SMN1－7主反应液包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1－7号外显子的检测引物对。本发明通过限制PCR反应体系中核心物料dNTPs使用浓度构建限制竞争性多重PCR检测体系，同时利用ARMS－PCR引物设计与“Touchdown 64－60℃”PCR扩增条件提高检测特异性，采用归一化熔解曲线分析技术实现7、8号外显子SMN1基因拷贝数的准确定量，其操作简单、检测准确性高、耗时短且检测成本低，克服了现有实时荧光定量PCR法所存在的不足。

Description

人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒及分析方法

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测技术领域，特别涉及一种人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒及分析方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spina lmuscular alrophy，SMA)是一种常见的致死性神经肌肉疾病之一，属于常染色体隐性遗传性疾病，由于脊髓前角细胞运动神经元退化变性所导致的进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力瘫痪及萎缩为特征的遗传性神经肌肉疾病。该病在新生婴儿中的发病率约1/10000～1/6000，正常人群的携带率约1/50～1/40。该病的主要致病基因是运动神经元存活基因1(surviva lmotor neuron，SMN1)，位于5q11.2－13.3，该区域内结构复杂，存在的重复序列及众多假基因簇导致其结构不稳定。SMN基因在一条染色体上存在2个拷贝，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2，二者仅存在5个碱基的差异，分别位于第7、8号外显子和第6、7号内含子中。在SMN基因的两个拷贝中，SMN1基因的缺失是导致脊髓性肌萎缩的主要原因，约有98.6％的SMA患者中存在SMN1第7、8号外显子的纯合缺失或仅第7号外显子的杂合缺失，约95％的SMA患者表现为SMN1基因第7号外显子0拷贝，另外5％患者为SMN1杂合缺失，即属于含有微小突变的单拷贝SMN1基因，通过对SMN1基因第7号外显子拷贝数进行检测，可以实现SMA疾病的初步筛查，后续再通过其他临床医学诊断综合确定是否患有SMA疾病。因此，精准地对SMN1基因7号外显子拷贝数进行检测，对SMA患者诊断及人群携带者筛查具有重要指导意义。

目前临床上针对SMN1基因拷贝数检测主要检测方法：限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(PCR－RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR－DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR等。PCR－RFLP仅可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者的定性分析(即0拷贝)，不能检测杂合缺失型的携带者(即单拷贝)，而技术本身也存在酶切不完全导致错判的结果；PCR－DHLPC法、MLPA法可用于检测纯合缺失型患者和杂合缺失型的携带者，且MLPA法可以实现对基因0拷贝、单拷贝、两拷贝、三拷贝及四拷贝的定量分析，但操作复杂、通量低、耗时长(48～72小时)、需要特定的仪器且价格昂贵，在实际应用过程中难以得到广泛推广。实时荧光定量PCR方法分析SMN1基因拷贝数，主要包括以下3类：①SYBR Green I染料法：Feldkotter M等将一个SMN1：SMN2＝2：0的参照样本梯度稀释，模拟不同SMN1拷贝数的标准品，并通过未知样本与标准品荧光crossing point(Cp)值的拟合判断样本的实际拷贝数，报道灵敏度为96.2％，特异性为100％。SoloviovOO等则通过引入ALB内参基因，并依照相对定量算法2^－△△Ct计算样本的SMN1基因拷贝数。荧光染料实时定量PCR法的应用大幅度地提升了检测的易操作性，为大规模携带者筛查提供了可能。但是由于SYBR Green I等荧光染料本身并无序列特异性，无法区分扩增产物与引物二聚体及非特异产物产生的荧光信号差异。此外，目标基因与内参基因的扩增效率差异是否稳定符合2^－△△Ct相对定量算法的数学基础也有待验证，因而该方法在携带者检测中的可靠性尚值得商榷。②通用引物结合特异性探针方法：此方法采用一对可同时扩增SMN1和SMN2基因第7外显子C840T位点的通用引物，并通过针对差异位点设计的特异性Taqman探针区分SMN1和SMN2。但此方法区分SMN基因的特异性存在局限，无SMN1拷贝的患者同样会产生一定强度的SMN1探针杂交信号，从而干扰了携带者筛查检测中的SMN1基因拷贝数分析。③特异性引物结合通用探针方法：此法是通过针对SMN基因第7外显子C840T位点设计竞争性引物，分别扩增SMN1及SMN2基因，再通过两者共用的Taqman探针检测荧光信号。相较由探针区分SMN1及SMN2基因，竞争性引物区分避免了SMN2基因的干扰，提高了分析的准确性。但由于体系中加入了内参基因、校正品以及外部标准曲线等多层次质控，使得操作性和成本均增高。因此，采用实时荧光定量PCR方法分析SMN1基因拷贝数时，检测特异性与携带者检测可靠性方面表现不佳，且不能实现对基因多个拷贝数的定量检测。

综上诉述，现有检测SMN1基因拷贝数的试剂盒各有局限，针对以上问题，急需一种特异性高、操作便捷、准确性高、简单经济的检测试剂盒，用于SMN1基因拷贝数定量检测。

发明内容

本发明的第一个发明目的在于：为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种操作简捷、检测结果判读简单、准确性高、灵敏度高、检测耗时短、检测成本低而适合大规模人群脊髓性肌萎缩症携带者筛查的人运动神经元存活基因1(SMN1)拷贝数定量检测试剂盒。

本发明采用的技术方案如下：一种人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒，其特征在于，它包括SMN1－7主反应液、SMN1－8主反应液、SMN1酶混合液、0拷贝数质控品、SMN1－7单拷贝质控品、SMN1－7两拷贝标准品、SMN1－8单拷贝质控品、SMN1－8两拷贝标准品，所述SMN1－7主反应液包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1－7号外显子的检测引物对，序列信息见下表1：

表1

所述SMN1－8主反应液包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1－8号外显子的检测引物对，序列信息见下表2：

表2

在本发明中，发明人在进行引物的筛选及确定时，在同一管中同时扩增靶标基因序列和内参基因序列，通过大量实验对比筛选引物，实验结果证明：引物序列左右平移或长度改变，二者扩增效率均会产生较大差异。引物太长会发生非特异性产物，太短会导致引物退火温度低而扩增灵敏度降低或者靶标基因与内参基因二者扩增效率差异大。经大量实验设计、筛选及优化后最终确定上述表1和表2的引物组合，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5为锁核酸修饰引物，即是说，以7、8号外显子SMN1基因C/T、G/A特异性位点作为引物3＇末端设计上游引物，同时在特异性位点引入锁核酸修饰，增加了引物的TM值，提高了检测特异性和扩增效率，使用效果明显优于现有技术所使用的引物组合。

进一步，所述SMN1－7主反应液包括以下组分：35－50mM Tris、1.5－2.5mMMgCl₂、300－500mg/L BSA、5－10v％DMSO、3－6μM dNTPs、300－500nM SMN1－7FP、300－500nMSMN1－7RP、300－500nM CFTR－FP、300－500nM CFTR－RP、20－50×Syto9、去离子水。

进一步，所述SMN1－8主反应液包括以下组分：35－50mM Tris、1.5－2.5mMMgCl₂、300－500mg/L BSA、5－10v％DMSO、3－6μM dNTPs、300－500nM SMN1－8FP、300－500nMSMN1－8RP、300－500nM TPGS2－FP、300－500nM TPGS2－RP、20－50×Syto 9、去离子水。

在上述SMN1－7主反应液和SMN1－8主反应液中，最主要的创新核心在于dNTPs和MgCl₂的选择。对于dNTPs浓度的选择，常规dNTPs浓度的选择为100－300μM，常规dNTPs的浓度无法在PCR反应体系中构建出有效的靶标基因与内参基因的扩增竞争机制，以使整个PCR扩增检测完成后反应体系中dNTPs被消耗完成。本发明人通过选择超低浓度的dNTPs，并通过测试1.5μM、3μM、6μM、9μM、18μM dNTPs使用终浓度，确定在3－6μM浓度范围可以实现不同拷贝数SMN1基因样本熔解曲线的准确区分。在此基础上，MgCl₂的浓度被限定为1.5－2.5mM，浓度范围略小于现有的1－3mM的范围，该浓度范围配合原PCR扩增程序中设计“Touchdown 64－60℃”，并结合熔解曲线分析，可消除高度同源基因SMN2对SMN1基因拷贝数定量的影响，能够有效提升检测特异性。

进一步，所述SMN1酶混合液包括以下组分：0.8－1U/Test DNA聚合酶、0.2－0.25μL/Test DNA聚合酶抗体。

进一步，SMN1－7单拷贝质控品为GM03815细胞株提取的基因组DNA，其7号外显子SMN1基因为单拷贝，浓度为15－25ng/μL；所述SMN1－7两拷贝标准品为HG01701细胞株提取的基因组DNA，其7号外显子SMN1基因为两拷贝，浓度为15－25ng/μL；所述SMN1－8单拷贝质控品为GM03815细胞株提取的基因组DNA，其8号外显子SMN1基因为单拷贝，浓度为15－25ng/μL；所述SMN1－8两拷贝标准品为HG01701细胞株提取的基因组DNA，其8号外显子SMN1基因为两拷贝，浓度为15－25ng/μL。

进一步，所述0拷贝质控品为含CFTR与TPGS2基因片段序列的人工合成质粒。

在本发明的检测试剂盒中，引物SMN1－7FP、SMN1－7RP、SMN1－8FP、SMN1－8RP采用ARMS引物设计原则。

进一步，在SMN1酶混合液中，DNA聚合酶浓度需控制在0.8－1U范围内，以形成限制性竞争PCR扩增检测反应体系，从而保证PCR扩增完成后反应体系中dNTPs被消耗完成。

在本发明的检测试剂盒中，针对目前实时荧光定量PCR存在检测特异性的问题，我们对SMN1基因检测引物和反应体系Mg²⁺浓度进行了设计。利用ARMS－PCR设计原理，在上游引物的3＇末端利用特异性位点控制靶标基因SMN1的检测特异性，同时在3＇端特异性位点引入锁核酸修饰，增加引物的TM值以提高检测特异性和扩增效率。同时，反应体系中使用低Mg²⁺浓度(浓度为1.5－2.5mM)，其可以消除高度同源基因SMN2对SMN1基因拷贝数定量的影响，进而有效提升检测特异性。进一步，本发明限制dNTPs浓度为3－6μM，远远低于常规PCR反应体系dNTPs的浓度(常规浓度为100－300μM)，通过限制dNTPs浓度，构建多重PCR反应体系中靶标基因与内参基因的扩增竞争机制，整个PCR扩增检测完成后反应体系中dNTPs被消耗完成，从而使得靶标基因和内参基因模板初始浓度与PCR扩增完成后的反应终产物浓度对应比例关系保持一致，建立出靶标基因、内参基因双重扩增效率趋于一致的竞争性PCR反应体系，由此实现了7、8号外显子SMN1基因拷贝数的准确定量，克服了现有技术中所存在的检测准确性不高、操作复杂、检测成本高等问题。

本发明的第二个发明目的在于：针对现有实时荧光定量PCR法分析SMN1基因拷贝数时，由于不同检测仪器、不同操作人员及不同批次配制试剂等因素差异导致靶标基因熔解峰峰出现波动偏差，进而影响数据分析的计算结果而造成准确性不高的问题，提出一种实时荧光定量PCR数据处理方法，以提高数据分析的准确性，解决现有数据分析方法所存在的不足。

本发明采用的技术方案如下：一种实时荧光定量PCR数据处理方法，其特征在于，利用现有的实时荧光定量PCR法对人运动神经元存活基因1拷贝数定量分析，在进行PCR扩增及荧光检测阶段，PCR扩增完成后，直接将原始数据导入多重熔解曲线分析软件进行设置，软件自动进行结果分析，输出△Tm、P值和R值，其中，P值为熔解曲线分析软件归一化处理后熔解峰的峰高值，R值为待测样本熔解峰峰高值除以两拷贝标准品熔解峰峰高值。

在本发明的实时荧光定量PCR数据分析方法中，根据扩增子Tm值的差异形成不同的熔解峰，因不同样本的内参基因均为两拷贝，经多重熔解曲线分析软件对不同检测样本的内参基因熔解峰进行归一化处理，从而使得不同SMN1基因拷贝数的样本会形成不同高度的熔解峰，熔解峰的峰高与SMN1基因拷贝数成正比例关系，因样本中SMN1基因的拷贝数均为整数，对于SMN1基因不同拷贝数样本靶标基因熔解峰会形成明显的区分度，相同拷贝数样本熔解峰会汇集在一起，为对SMN1基因熔解峰实现精准定量，分析引入P值和R值两个可实现量化的参数，其中P值为靶标基因熔解峰峰高，R值为待测样本熔解峰峰高P值除以两拷贝标准品熔解峰峰高P值。因靶标基因熔解峰峰高P值会因不同检测仪器、不同操作人员及不同批次配制试剂的差异导致P值出现较大波动，而R值的引入可消除此类因素造成的误差对检测结果的影响，从而可以实现输出准确的检测数据，提高了数据的准确性、有效性和可靠性。

本发明的实时荧光定量PCR数据处理方法，包括测定熔解曲线是否为非空白对照对应的熔解曲线，其方式为判断熔解曲线下降的幅值大于所有熔解曲线的最大下降幅值的20％。该处理实施过程还包括归一化熔解曲线，其方式为非空白对照的熔解曲线去除根据统计或指定的归一化起始区域与终止区域计算的背景曲线，空白对照的归一化熔解曲线为0值直线；该处理实施过程进一步归一化熔解峰值曲线以及计算P值与R值，其方式为把空白对照的归一化熔解曲线数值计算负倒数，得到熔解峰值曲线，在熔解峰值曲线上搜索一到两个熔解峰，只有一个熔解峰的作为参考峰，有两个熔解峰的根据指定的熔解峰作为参考峰(内参基因熔解峰)，另一个为目标峰，把所有参考峰经过平移与缩放统计成相同的峰，成为归一化熔解峰值曲线，目标峰根据对应参考峰的平移与缩放比例进行同步调整，成为归一化熔解峰值曲线的目标峰与参考峰。计算每条熔解曲线对应的熔解峰峰高值(P值)，待测样本熔解峰峰高P值除以两拷贝标准品熔解峰峰高P值得到峰高比值(R值)。

在本发明的实时荧光定量PCR数据分析方法中，还可以通过R值进行检测有效性的判定，具体为：单拷贝质控品R≤0.70，如不在此范围内，应排除仪器、试剂或操作原因后重新检测。

进一步，还可以根据Tm值判断检测的有效性，具体为：0拷贝质控品在熔解分析后，熔解曲线Tm2值在77.0℃±1.0℃出现单一熔解峰；若分析后出现其他熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测。

进一步，本发明的实时荧光定量PCR数据分析方法应用于本发明的人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测技术中时，其实施过程为：一种对人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒的PCR定量分析方法，包括以下步骤：

S1、配制SMN1－7PCR反应混合液和SMN1－8PCR反应混合液，所述SMN1－7PCR反应混合液由17.75μL的SMN1－7主反应液和0.25μL的SMN1酶混合液混合得到，所述SMN1－8PCR反应混合液由17.75μL的SMN1－8主反应液和0.25μL的SMN1酶混合液混合得到，按照需要检测样本的数量配制使用量，分别按18μL的量分装到PCR反应管中；

S2、在SMN1－7PCR反应混合液中分别加入0拷贝质控品、SMN1－7单拷贝质控品、SMN1－7两拷贝标准品及待测样品提取基因组DNA各2μL，总检测体积为20μL，盖紧反应管，进行瞬时低速离心，转移至PCR扩增区；

S3、在SMN1－8PCR反应混合液中分别加入0拷贝质控品、SMN1－8单拷贝质控品、SMN1－8两拷贝标准品及待测样品提取基因组DNA各2μL，总检测体积为20μL，盖紧反应管，进行瞬时低速离心，转移至PCR扩增区；

S4、将各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，设置反应程序，进行PCR扩增及荧光检测；

S5、在扩增完成后，直接将原始数据导入多重熔解曲线分析软件进行设置，软件自动进行结果分析，输出△Tm、P值和R值，其中，P值为熔解曲线分析软件归一化处理后熔解峰的峰高值，R值为待测样本熔解峰峰高值除以两拷贝标准品熔解峰峰高值，进而根据P值和R值进行检测结果的判读。

进一步，待测样品提取基因组DNA的浓度范围为10－120ng/μL，OD260/OD280在1.7－2.0范围内。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、在本发明的检测试剂盒中，针对目前实时荧光定量PCR存在检测特异性的问题，我们对SMN1基因检测引物和反应体系Mg²⁺浓度进行了设计，利用ARMS－PCR设计原理，以7、8号外显子SMN1基因C/T、G/A特异性位点作为引物3＇末端设计上游引物，同时在特异性位点引入锁核酸修饰，利用特异性位点控制靶标基因SMN1的检测特异性，增加引物的TM值以提高检测特异性和扩增效率；同时，反应体系中使用低Mg²⁺浓度(浓度为1.5－2.5mM)，其可以消除高度同源基因SMN2对SMN1基因拷贝数定量的影响，进而有效提升检测特异性。

2、本发明限制dNTPs浓度为3－6μM，远远低于常规PCR反应体系dNTPs的浓度，通过限制dNTPs浓度，构建多重PCR反应体系中靶标基因与内参基因的扩增竞争机制，整个PCR扩增检测完成后反应体系中dNTPs被消耗完成，从而使得靶标基因和内参基因模板初始浓度与PCR扩增完成后的反应终产物浓度对应比例关系保持一致，建立出靶标基因、内参基因双重扩增效率趋于一致的竞争性PCR反应体系，由此实现了7、8号外显子SMN1基因拷贝数的准确定量，克服了现有技术中所存在的检测准确性不高、操作复杂、检测成本高等问题；

3、本发明针对现有实时荧光定量PCR法分析SMN1基因拷贝数时，由于不同检测仪器、不同操作人员及不同批次配制试剂等因素差异导致靶标基因熔解峰峰出现波动偏差，进而影响数据分析的计算结果而造成准确性不高的问题，提出了一种实时荧光定量PCR数据处理方法，本发明通过引入可量化的参数P值和R值，由此可避免因不同实验操作的误差导致熔解峰峰高差异，进而造成的结果差异，从而可以实现准确的输出检测数据，提高了数据的准确性、有效性和可靠性。

4、本发明提供的PCR定量分析方法，通过限制PCR反应体系中核心物料dNTPs使用浓度构建限制竞争性多重PCR检测体系，同时利用ARMS－PCR引物设计与“Touchdown 64－60℃”PCR扩增条件提高检测特异性，采用归一化熔解曲线分析技术实现7、8号外显子SMN1基因拷贝数的准确定量，本发明的分析方法操作简单、检测准确性高、耗时短且检测成本低，优于现有的实时荧光定量PCR法。

附图说明

图1是本发明44例样本7号外显子SMN1基因拷贝数检测结果图；

图2是本发明44例样本8号外显子SMN1基因拷贝数检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

采用本发明的试剂盒分析44例SMN1基因不同拷贝数临床样本(样本编号为1－44)，同时以荷兰MRC公司的MLPA试剂盒的检测结果作为对照，评价本发明试剂盒检测性能。实施流程如下：

1、样本处理

EDTA抗凝全血样本采用核酸提取或纯化试剂(陕西械备20140007号)进行磁珠法人类基因组DNA提取，样本量为200μL，核酸提取仪选择西安天隆NP968，核酸提取程序见下表3：

表3核酸提取程序

提取后的DNA需用紫外分光光度计测定浓度，10ng/μL≤DNA浓度要求≤120ng/μL，超过浓度范围可使用TE缓冲液稀释，OD260/OD280在1.7－2.0内。

2、试剂配制

从试剂盒中分别取出SMN1－7主反应液、SMN1－8主反应液和SMN酶混合液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm快速离心10sec，计算需准备反应试剂人份数[n＝样本数+3(质控品数)]，其中主反应液17.75μL/测试，SMN1酶混合液0.25μL/测试，7、8号外显子分别进行试剂混合液配制，按18μL量分装到八联管或96孔板中，转移至样本处理区，构成的检测体系为：

7号外显子SMN1基因检测体系：SMN1－7主反应液 17.75μL

SMN1酶混合液0.25μL

DNA 2μL

8号外显子SMN1基因检测体系：SMN1－8主反应液 17.75μL

SMN1酶混合液 0.25μL

DNA 2μL

在进行PCR检测过程中，样本DNA、质控品与标准品需同步进行上机检测；

3、PCR反应体系的构建

PCR反应体系配方如下表4所示：

表4 PCR反应体系配方

注：基因组DNA加样量为2μL，总反应体积为20μL；

4、加样

以检测7号外显子SMN1基因为例，在SMN1－7基因PCR反应混合液中分别加入0拷贝质控品、SMN1－7单拷贝质控品、SMN1－7两拷贝标准品及待测样品提取基因组DNA各2μL，总检测体积为20μL。盖紧反应管，进行瞬时低速离心，转移至PCR扩增区；8号外显子SMN1基因操作类似；

5、PCR扩增及荧光检测

将各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，设置反应程序，以西安天隆Gentier 96E仪器如下表5，荧光检测通道选择SYBR Green/FAM检测通道：

表5 Gentier 96E全自动医用PCR分析系统检测程序

6、数据处理

在扩增完成后，可直接将原始数据导入天隆多重熔解曲线分析软件进行设置，软件自动进行结果分析，输出△Tm、P值或R值；

7、检测有效性判定

a.7号外显子SMN1基因：0拷贝质控品在熔解分析后，熔解曲线Tm2值在77.0℃±1.0℃出现单一熔解峰；若分析后出现其他熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测；单拷贝质控品R≤0.70，如不在此范围内，应排除仪器、试剂或操作原因后重新检测；

b.8号外显子SMN1基因：0拷贝质控品在熔解分析后，熔解曲线Tm2值在83.0℃±1.0℃出现单一熔解峰；若分析后出现其他熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测；单拷贝质控品R≤0.70，如不在此范围内应排除仪器、试剂或操作原因后重新检测；

c.样本有效性：检测样本7、8号外显子SMN1基因熔解曲线△Tm值在[3.5，5]内；

8、检测结果判定

检测值根据表6进行结果判定：

表6、检测值结果判定

9、44例样本检测结果

发明试剂盒对44例样本检测结果与MLPA试剂检测结果对比表见下表6所示，检测结果图如图1和图2所示：

表7 SMN1基因检测结果对比表

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根据上述表7可知，使用本发明的试剂盒对临床44例样本进行检测，7、8号外显子SMN1基因拷贝数检测结果与MLPA法检测结果完全一致，准确率为100％。

作为补充说明，拷贝数的分析可采用归一化熔解分析靶标基因熔解峰的峰图(如图1、图2)，对于SMN1基因不同拷贝数样本靶标基因熔解峰会形成明显的区分度，相同拷贝数样本熔解峰会汇集在一起；为对SMN1基因熔解峰实现精准定量，分析引入P值和R值两个可实现量化的参数，其中P值为靶标基因熔解峰峰高，R值为待测样本熔解峰峰高P值除以两拷贝标准品熔解峰峰高P值。因靶标基因熔解峰峰高P值会因不同检测仪器、不同操作人员及不同批次配制试剂的差异导致P值出现较大波动，而R值的引入可消除此类因素造成的误差对检测结果的影响。通过大量样本测试数据采用百分位法P99确定表6中拷贝数定量数据分析结果判定表。

进一步，本发明为保证PCR扩增效率和提高检测特异性，通过将PCR扩增分为两轮，第一轮采用降落PCR初始退火温度提升至64℃，以每个循环降低0.4℃进行10个预循环，初始退火温度明显高于引物Tm值以提高检测的特异性；第二轮采用正常的退火温度以保证高灵敏度的扩增检测，扩增完成后增加连续熔解过程，在形成区分不同拷贝数熔解峰的同时通过熔解峰的Tm值可进一步确定扩增产物的特异性。确定的PCR反应条件见表8。

表8 PCR反应条件

荧光检测通道选择SYBR Green I检测通道。

进一步，多重熔解曲线分析软件原理：将PCR检测完成后的原始实验数据导入分析软件进行归一化熔解曲线处理，软件可自动计算并输出Tm值、P值与R值。该处理实施过程包括测定熔解曲线是否为非空白对照对应的熔解曲线，其方式为判断熔解曲线下降的幅值大于所有熔解曲线的最大下降幅值的20％；该处理实施过程还包括归一化熔解曲线，其方式为非空白对照的熔解曲线去除根据统计或指定的归一化起始区域与终止区域计算的背景曲线，空白对照的归一化熔解曲线为0值直线；该处理实施过程进一步归一化熔解峰值曲线以及计算P值与R值，其方式为把空白对照的归一化熔解曲线数值计算负倒数，得到熔解峰值曲线，在熔解峰值曲线上搜索一到两个熔解峰，只有一个熔解峰的作为参考峰，有两个熔解峰的根据指定的熔解峰作为参考峰(内参基因熔解峰)，另一个为目标峰，把所有参考峰经过平移与缩放统计成相同的峰，成为归一化熔解峰值曲线，目标峰根据对应参考峰的平移与缩放比例进行同步调整，成为归一化熔解峰值曲线的目标峰与参考峰。计算每条熔解曲线对应的熔解峰峰高值(P值)，待测样本熔解峰峰高P值除以两拷贝标准品熔解峰峰高P值得到峰高比值(R值)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人运动神经元存活基因1（SMN1）拷贝数定量检测试剂盒，其特征在于，人运动神经元存活基因1包括第7号外显子SMN1-7和第8号外显子SMN1-8，所述检测试剂盒包括SMN1-7主反应液、SMN1-8主反应液、SMN1酶混合液、0拷贝质控品、SMN1-7单拷贝质控品、SMN1-7两拷贝标准品、SMN1-8单拷贝质控品、SMN1-8两拷贝标准品，所述SMN1-7主反应液包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1-7号外显子的检测引物对，序列信息见下表1：

表1

所述SMN1-8主反应液包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1-8号外显子的检测引物对，序列信息见下表2：

表2

；

其中，在表1和表2的引物组合中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5为锁核酸修饰引物；所述SMN1-7主反应液包括以下组分：35-50mM Tris、1.5-2.5mM MgCl₂、300-500mg/L BSA、5-10v% DMSO、3-6μM dNTPs、300-500nM SMN1-7FP、300-500nM SMN1-7RP、300-500nM CFTR-FP、300-500nM CFTR-RP、20-50×Syto 9、去离子水；

所述SMN1-8主反应液包括以下组分：35-50mM Tris、1.5-2.5mM MgCl₂、300-500mg/LBSA、5-10 v%DMSO、3-6μM dNTPs、300-500nM SMN1-8FP、300-500nM SMN1-8RP、300-500nMTPGS2-FP、300-500nM TPGS2-RP、20-50×Syto 9、去离子水。

2.如权利要求1所述的人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒，其特征在于，所述SMN1酶混合液包括以下组分：0.8-1U /Test DNA聚合酶、0.2-0.25μL /Test DNA聚合酶抗体。

3.如权利要求2所述的人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒，其特征在于，SMN1-7单拷贝质控品为GM03815细胞株提取的基因组DNA，其7号外显子SMN1基因为单拷贝，浓度为15-25ng/μL；所述SMN1-7两拷贝标准品为HG01701细胞株提取的基因组DNA，其7号外显子SMN1基因为两拷贝，浓度为15-25ng/μL；所述SMN1-8单拷贝质控品为GM03815细胞株提取的基因组DNA，其8号外显子SMN1基因为单拷贝，浓度为15-25ng/μL；所述SMN1-8两拷贝标准品为HG01701细胞株提取的基因组DNA，其8号外显子SMN1基因为两拷贝，浓度为15-25ng/μL。

4.如权利要求1-3任一所述的人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒，其特征在于，所述0拷贝质控品为含CFTR与TPGS2基因片段序列的人工合成质粒。

5.一种基于权利要求4所述的对人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒的PCR定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制SMN1-7 PCR反应混合液和SMN1-8 PCR反应混合液，所述SMN1-7 PCR反应混合液由17.75μL的SMN1-7主反应液和0.25μL的SMN1酶混合液混合得到，所述SMN1-8 PCR反应混合液由17.75μL的SMN1-8主反应液和0.25μL的SMN1酶混合液混合得到，按照需要检测样本的数量配制使用量，分别按18μL的量分装到PCR反应管中；

S2、在SMN1-7 PCR反应混合液中分别加入0拷贝质控品、SMN1-7单拷贝质控品、SMN1-7两拷贝标准品及待测样品提取基因组DNA各2μL，总检测体积为20μL，盖紧反应管，进行瞬时低速离心，转移至PCR扩增区；

S3、在SMN1-8 PCR反应混合液中分别加入0拷贝质控品、SMN1-8单拷贝质控品、SMN1-8两拷贝标准品及待测样品提取基因组DNA各2μL，总检测体积为20μL，盖紧反应管，进行瞬时低速离心，转移至PCR扩增区；

S5、在扩增完成后，直接将原始数据导入多重熔解曲线分析软件进行设置，软件自动进行结果分析，输出△Tm 、P值和R值，其中，P值为熔解曲线分析软件归一化处理后熔解峰的峰高值，R值为待测样本熔解峰峰高值除以两拷贝标准品熔解峰峰高值，根据P值和R值进行检测结果的判读。

6.如权利要求5所述的PCR定量分析方法，其特征在于，待测样品提取基因组DNA的浓度范围为10-120ng/μL，OD260/OD280在1.7-2.0范围内。