CN117265138B - 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用 - Google Patents

用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117265138B
CN117265138B CN202311555275.7A CN202311555275A CN117265138B CN 117265138 B CN117265138 B CN 117265138B CN 202311555275 A CN202311555275 A CN 202311555275A CN 117265138 B CN117265138 B CN 117265138B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
sequence seq
probes
wild
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311555275.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117265138A (zh
Inventor
费敏
吴颖超
请求不公布姓名
曹亦峰
卢楷烨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Shuda Innovative Medical Technology Co ltd
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou Shuda Innovative Medical Technology Co ltd
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Shuda Innovative Medical Technology Co ltd, Suzhou University filed Critical Suzhou Shuda Innovative Medical Technology Co ltd
Priority to CN202311555275.7A priority Critical patent/CN117265138B/zh
Publication of CN117265138A publication Critical patent/CN117265138A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117265138B publication Critical patent/CN117265138B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用。本发明根据猫CMAH基因的179G>T、268T>A、364C>T、1322delT四个位点分型的SNP突变情况，设计用于检测上述四个位点野生型和突变型的引物和探针组合物；利用实时荧光PCR技术绘制扩增曲线，通过对扩增曲线的分析，实现对四处SNP位点的碱基结果进行识别，从而判断猫血型结果。本发明的检测方法全程在密闭空间内进行，避免了环境气溶胶污染的问题。

Description

用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及一种用于猫血型检测的引物和探针组合物、猫血型的检测方法及应用。
背景技术
猫血型系统一般公认为AB型血型系统，包括3种血型：A型、B型和AB型。其中A型最常见，在不同的品种中，猫A血型高达90％。A型、B型和AB型的显隐性关系为：A型显性>AB型显性>B型显性。
现有技术中，通过依据猫CMAH基因179G>T、268T>A、364C>T、1322delT 四个位点分型的SNP突变情况进行引物设计，结合PCR技术对位点的分型结果进行判读。例如，中国发明专利CN115717170A公开了一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，并对扩增引物进行blast特异性对比，对该方法具有在检测时间短、灵敏度高的优点，尤其是在检测的特异性上具有很大的优势，但是，该方法在扩增后需要对产物进行纯化、延伸和再纯化，后期处理过程过于复杂，且对产物进行处理时容易造成严重的气溶胶污染。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了用于猫血型检测的引物和探针组合物、猫血型的检测方法及应用，利用PCR技术结合实时荧光技术进行猫血型的检测，根据猫CMAH基因的四个位点的突变情况进行引物和探针的特异性设计，通过实时荧光PCR仪绘制扩增曲线，从而对四处SNP位点进行精确分析，并获得猫血型结果。检测过程全程在封闭条件下进行，无需开盖，避免了气溶胶造成的污染。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，一种用于猫血型检测的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物通过检测猫血型的单核苷酸突变位点的突变情况特异性设计，共包括四组引物和四组探针。
具体地，根据猫CMAH基因的四个SNP位点设计的四组引物，分别包括：
四组引物：
第一组引物，包括序列为SEQ ID NO.1的正向引物和序列为SEQ ID NO.2的反向引物；
第二组引物，包括序列为SEQ ID NO.5的正向引物和序列为SEQ ID NO.6的反向引物；
第三组引物，包括序列为SEQ ID NO.9的正向引物和序列为SEQ ID NO.10的反向引物；
第四组引物，包括序列为SEQ ID NO.13的正向引物和序列为SEQ ID NO.14的反向引物；
四组探针：
第一组探针，包括序列为SEQ ID NO.3的野生型探针和序列为SEQ ID NO.4的突变型探针；
第二组探针，包括序列为SEQ ID NO.7的野生型探针和序列为SEQ ID NO.8的突变型探针；
第三组探针，包括序列为SEQ ID NO.11的野生型探针和序列为SEQ ID NO.12的突变型探针；
第四组探针，包括序列为SEQ ID NO.15的野生型探针和序列为SEQ ID NO.16的突变型探针。
进一步地，采用上述方案提供的引物和探针组合物制备猫血型检测试剂进行猫血型的检测分析，具体地，检测试剂包括上述的引物和探针组合物，还包括阳性参考品，所述阳性参考品包括野生型阳性参考品和突变型阳性参考品。
具体地，所述野生型阳性参考品包括序列为SEQ ID NO.17的野生型特异性质粒片段；所述突变型阳性参考品包括序列为SEQ ID NO.18的突变型特异性质粒片段。
进一步地，猫血型检测分析的方法包括：通过检测猫血型的单核苷酸突变位点的突变情况设计特异性引物和探针，以猫体表的核酸为模板DNA，进行PCR反应，利用实时荧光PCR技术绘制扩增曲线，从而对四处所述SNP位点进行分析和结果判读，获得猫血型结果。
优选地，将四处所述突变位点设计在探针中间，探针Tm值和探针的退火温度保持一致；当述模板DNA发生碱基突变时，则导致所述探针与模板DNA解链温度偏低，因此退火温度会大于探针与模板DNA的解链温度，使探针无法和所述模板DNA结合，从而无法分析出扩增曲线，则结果判读为阴性；若所述模板DNA未发生碱基突变，则所述探针和所述模板DNA能够互补结合，从而可分析得到扩增曲线，则结果判读为阳性。
优选地，根据猫CMAH基因的四个SNP位点设计的四组引物，分别包括：
第一组引物，包括序列为SEQ ID NO.1的正向引物（179F）和序列为SEQ ID NO.2的反向引物（179R），用于检测179G>T；
第二组引物，包括序列为SEQ ID NO.5（268F）的正向引物和序列为SEQ ID NO.6的反向引物（268R），用于检测268T>A；
第三组引物，包括序列为SEQ ID NO.9的正向引物（364F）和序列为SEQ ID NO.10的反向引物（364R），用于检测364C>T；
第四组引物，包括序列为SEQ ID NO.13的正向引物（1322F）和序列为SEQ IDNO.14的反向引物（1322R），用于检测1322delT。
根据猫CMAH基因的四个SNP位点的突变情况涉及的四组探针，分别包括
第一组探针，包括序列为SEQ ID NO.3的野生型探针（179WP）和序列为SEQ IDNO.4的突变型探针（179MP），用于检测179G>T；
第二组探针，包括序列为SEQ ID NO.7的野生型探针（268WP）和序列为SEQ IDNO.8的突变型探针（268MP），用于检测268T>A；
第三组探针，包括序列为SEQ ID NO.11的野生型探针（364WP）和序列为SEQ IDNO.12的突变型探针（364MP），用于检测364C>T；
第四组探针，包括序列为SEQ ID NO.15的野生型探针（1322WP）和序列为SEQ IDNO.16的突变型探针（1322MP），用于检测1322delT。
优选地，猫血型检测分析的方法，具体包括以下步骤：
S1.分别根据猫CMAH基因179G>T、268T>A、364C>T、1322delT 四个位点的SNP突变情况，分别设计一组用于检测野生型的引物和探针物和一组用于检测突变型的引物和探针物，共四组引物和探针物，并配置成检测液；
S2.提取猫口腔拭子的核酸作为待检测样本，并与所述检测液混合；
S3.通过荧光PCR仪进行程序运行绘制出扩增曲线；
S4.依据S3得到的扩增曲线对所述待检测样本中猫CMAH基因的四个SNP位点进行分析和结果判读，获得猫的血型。
优选地，所述检测液包括野生型检测液和突变型检测液；将所述样本分别加入至野生型检测液和突变型检测液中，分别进行野生位点和突变位点的检测，野生型检测液检测野生位点，突变型检测液检测位点是否发生突变。
优选地，所述阳性参考品包括检测的目的基因合成的特异性质粒片段；
所述阳性参考品包括野生型阳性参考品和突变型阳性参考品；
所述野生型阳性参考品的终浓度为105~107copies/mL；
突变型阳性参考品的终浓度为105~107copies/mL。
优选地，所述特异性质粒片段包括野生型特异性质粒片段和突变型特异性质粒片段两种；所述野生型特异性质粒片段的序列如SEQ ID NO.17所示；所述突变型特异性质粒片段的序列如SEQ ID NO.18所示。
优选地，S3中，所述程序运行包括将核酸和阳性对照及空白对照分别置于实时荧光PCR仪中，设置下列程序运行：
步骤①：95℃×5min，运行1个循环；
步骤②：95℃×5s；60℃×20s；运行45个循环；
步骤②60℃×20s时，分别设置FAM通道、VIC通道、ROX通道和CY5通道，进行荧光采集；
其中，FAM通道检测的基因位点为179G＞T；VIC通道检测的基因位点为268T-A；ROX通道检测的基因位点为268T-A，CY5通道检测的基因位点为1322delT。
优选地，S4中对荧光采集的结果进行分析，包括首先分析是否存在扩增信号，如无扩增信号直接判读为阴性；如果有扩增信号时，模板DNA为阳性。
基于上述技术方案，可将其应用于猫CMAH基因是否为纯合子作出判断。包括通过野生型和突变型两种试剂同时对样本检测，可实现对猫CMAH基因是否为纯合子作出判断，其具体原理为：纯合子，指二倍体中同源染色体上相同位点上的两个等位基因相同的基因型个体。 杂合子，是指二倍体中同源染色体相同位点上的两个等位基因不相同的基因型个体 。 若样本中野生型和突变型检测均判读为阳性，即相同位点上的两个等位基因不相同，既有野生型又有突变型，说明该样本的检测位点为杂合子；若样本中野生型判读为阳性，突变型判读为阴性，即相同位点上的等位基因相同，且都是野生型，则说明该样本的检测位点为显性纯合子，若样本中野生型判读为阴性，突变型判读为阳性，即相同位点上的等位基因相同，且都是突变型，则说明该样本的检测位点为隐性纯合子。
本发明提供的技术方案与现有技术相比取得的有益效果：
1.采用本发明的技术方案，依据猫CMAH基因179G>T、268T>A、364C>T、1322delT 四个位点的SNP突变情况，设计分别用于检测野生型的引物探针和用于检测突变型的引物探针，利用PCR技术结合实时荧光技术，绘制扩增曲线，对猫血型作出判断，全程在密闭空间内进行，不需要开盖，避免了环境气溶胶污染的问题。
2.采用本发明的技术方案，本发明扩增时长低于1小时，检测速度快，尤其是针对猫CMAH基因进行的引物和探针设计使得检测结果特异性高。
3.采用本发明的技术方案可检测出1000 copies/mL的核酸浓度，具有检测灵敏度高的特点。
4.本发明提供的技术方案，不仅可以判断猫血型，也可对猫CMAH基因是否为纯合子作出判断。
附图说明
图1-图4分别为本发明进行猫血型分析的原理图。
图5为本发明实施例1中野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，FAM通道扩增曲线结果图。
图6为本发明实施例1中野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，VIC通道扩增曲线结果图。
图7为本发明实施例1中野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，ROX通道扩增曲线结果图。
图8为本发明实施例1中野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，CY5通道扩增曲线结果图。
图9为本发明实施例1中突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，FAM通道扩增曲线结果图。
图10为本发明实施例1中突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，VIC通道扩增曲线结果图。
图11为本发明实施例1中突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，ROX通道扩增曲线结果图。
图12为本发明实施例1中突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，CY5通道扩增曲线结果图。
图13为本实施例1中野生型检测液检测待检测样本在FAM通道、VIC通道、ROX通道和ROX通道扩增曲线结果图。
图14为本实施例中突变型检测液检测待检测样本在FAM通道、VIC通道、ROX通道和ROX通道扩增曲线结果图。
具体实施方式
使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
表1 设计的引物探针序列
参阅图1-图4，为本发明进行引物和探针组合物设计的原理示意图，将突变位点设计在探针中间位置，模板DNA的碱基与引物和探针的碱基完全互补，若模板DNA发生碱基突变，则探针无法和模板DNA的结合或无法完全结合，从而无法分析出扩增曲线。
具体地，参阅图1，引物、探针与模板DNA完全互补，荧光PCR仪即可绘制出如图2所示的扩增曲线；参阅图3，当探针含有突变，与模板不结合或不能完全结合时，荧光PCR仪无法绘制出扩增曲线，结果如图4所示。
进一步分析，将179G>T、268T>A、364C>T、1322delT四个SNP突变位点设计在探针中间，探针Tm值和探针的退火温度保持一致；模板DNA发生碱基突变时，则导致探针与模板DNA解链温度偏低，因此退火温度会大于探针与模板DNA解链温度，使探针无法和模板DNA结合，从而无法分析出扩增曲线，则结果判读为阴性；若模板DNA未发生碱基突变，则探针和模板DNA能够互补结合，从而可分析得到扩增曲线，则结果判读为阳性。
表2 检测液的组成和配比
基于上述原理，本发明根据猫CMAH基因的四个SNP位点设计的四组引物探针；其中，四组引物分别包括第一组用于检测179G>T的正向引物179F和反向引物179R，第二组用于检测268T>A的正向引物268F和反向引物268R，第三组用于检测364C>T的正向引物364F和反向引物364R，第四组用于检测1322delT的正向引物1322F和反向引物1322R。
进一步地，根据CMAH基因SNP变化设计八条探针（四组探针），两条用于检测179G>T的野生型探针179WP和突变型探针179MP，两条用于检测268T>A的野生型探针268WP和突变型探针268MP，两条用于检测364C>T的野生型探针364WP和突变型探针364MP，两条用于检测1322delT的探针野生型1322WP和突变型探针1322MP。
引物名称分别为179F、179R、268F、268R、364F、364R、1322F和1322R的序列分别对应为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，具体序列参见表1。
探针名称分别为179WP、268WP、364WP、1322WP，属于野生型探针，序列分别为SEQID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.15，探针名称分别为179MP、268MP、364MP、1322MP属于突变型探针，序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.16，具体序列参见表1。
将合成后的引物和PCR试剂按表2所示的浓度配置成检测液，检测液分别包括野生型检测液和突变型检测液，野生型检测液作为第一检测液，突变型检测液作为第二检测液，其中，野生型检测液中突变探针体积为0，突变型检测液中野生探针体积为0。
进一步的，本发明还包括通过检测的目的基因合成的特异性质粒片段，作为阳性参考品，阳性参考品包括野生型阳性参考品和突变型阳性参考品；本发明中的特异性质粒片段由北京擎科生物科技股份有限公司合成，具体序列分别如SEQ ID NO. 17和SEQ IDNO. 18所示。
序列SEQ ID NO. 17（野生型阳性参考品）的核苷酸序列(3'-5')包括：
TTTCATTCTGTACAAGAGCAAGAATCGCGTGAGGGCGTGCAAGAACGTGTGCAAGCATCAAGGAGGCCTGTTCATAAAAGACATAGAAGATTTAGACGGAAGGTCTGTCAGATGCACAAAGCACAACTGGAGGTTGGATGTGAGCACCATGAAATACGTCAATCCCCCAGGCAGCTTCTGTCAAGACGAACTAGTTGTTGAAATGGATGAAGAAAATGGACTTTTACTTCTAGAACTGAATCCTCCCAATCCCTGGGATTCAGAACCCAGATCTCCTGAACATTTGGCTTTTGGAGAAGTTGCTAAAGGACCCGACAGACAGCAAGGGCATCATAGARCCTCCAGAGGGGACCAAGATCTACAAGGATTCCTGGGACTTTGAACCCTATTTGAACATCTTGAATGCTGCTGTAGGAGATGAGATATTTCTTCACTCATCCTGGATAAAAGAATACTTCACTTGGGC。
序列SEQ ID NO. 18（突变型阳性参考品）的核苷酸序列(3'-5')包括：
TTTCATTCTGTACAAGAGCAAGAATCGCGTGAGGGCGTGCAAGAACGTGTGCAAGCATCAAGGAGTCCTGTTCATAAAAGACATYGAAGATTTAGACGGAAGGTCTGTCAGATGCACAAAGCACAACTGGAGGTTGGATGTGAGCACCATGAAAAACGTCAATCCCCCAGGCAGCTTCTGTCAAGACGAACTAGTTGTTGAAATGGATGAAGAAAATGGACTTTTACTTCTAGAACTGAATCCTCCCAATTCCTGGGATTCAGAACCCAGATCTCCTGAACATTTGGCTTTTGGAGAAGTTGCTAAAGGACCCGACAGACAGCAAGGGCATCATAGARCCTCCAGAGGGGACCAAGATCTACAAGGATTCCTGGGACTTTGAACCCTATTTGAACATCTTGAATGCTGCTGTAGGAGATGAGATATTTCTTCACTCATCCTGGATAAAAGAATACTTCACTTGGGC。
优选地，本发明还包括采用上述的阳性参考品作为阳性对照。具体信息如下：
野生型阳性参考品按105~107copies/mL的终浓度配制作为野生型阳性质控品。
突变型阳性参考品按105~107copies/mL的终浓度配制作为突变型阳性质控品。
优选地，上述的野生型阳性参考品和突变型阳性参考品均采用TE缓冲液作为溶剂进行稀释配置得到。
野生型检测液检测野生型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阳性；野生型检测液检测突变型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阴性；突变型检测液检测野生型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阴性；突变型检测液检测突变型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阳性；野生型阳性参考品、突变型参考品分别应用为野生型阳性质控品、突变型阳性质控品，用于判断实验结果是否在控。
进一步地，本实施例还做了核酸检出限的测试，具体包括：
将野生型阳性参考品和突变型参考品分别稀释至5000copies/ml、2000copies/ml、1000copies/mL、800copies/mL，然后采用野生型检测液和突变型检测液分别重复检测20次，其中1000copies/mL浓度检出率为95%，据此，采用本发明的技术方案进行核酸最低浓度的检测的检出限设定为1000copies/mL。
核酸提取：对获取到的猫口腔拭子样本进行核酸提取（模板DNA）作为待检测样本，该部分提取步骤为现有技术，可使用商业化核酸提取试剂进行提取，具体提取方法按照说明书操作。
核酸加样：将提取好的核酸、阳性参考品及空白对照（阴性样本）按10µL的体积分别加入含有野生型检测液和突变型检测液的8连管中，封盖后震荡离心。
在配置好的野生型检测液和突变型检测液中分别加入10µL待检样本的核酸并振荡混匀，最后在荧光PCR仪上按预设的反应程序运行。
上述荧光PCR仪包含适配本发明中反应程序设置参数的荧光定量PCR设备。
具体地，程序运行：将上述反应管置于实时荧光PCR仪，设置下列程序运行：
步骤①：95℃×5min，运行一个循环；
步骤②：95℃×5s；60℃×20s；运行45个循环。
步骤②中，60℃×20s时，设置FAM、VIC、ROX、CY5采集荧光。
需要特别说明的是，ABI7500荧光PCR仪不选择ROX 校正，淬灭基团选None。
结果分析：首先分析是否存在扩增信号，若无扩增信号时直接判读为阴性；如果有扩增时，该待检测样本判读为阳性。
结果判读：
本发明中FAM通道检测的基因位点为179G＞T；VIC通道检测的基因位点为268T-A；ROX通道检测的基因位点为268T-A，CY5通道检测的基因位点为1322delT。其中，野生型检测液检测野生位点，突变型检测液检测位点是否发生突变。
阳性判断值：本发明通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数（Youden index）确定阳性判断值。其中检测结果Ct≤40时判读为阳性；检测结果未检出时判读为阴性。
表3 SNP位点分型对应的猫血型对应的结果判读
上述4个SNP位点分型对应的猫血型判读方法与专利CN 115717170 A提供的判读方法相同，具体如表3所示。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，本发明中PCR试剂均来源于苏州新海生物科技股份有限公司。
下面通过具体的实施例进一步详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供一种猫血型检测分析的方法，具体步骤包括：
1.引物探针设计
根据猫CMAH基因设计四组引物和探针物；其中，四组引物分别包括第一组用于检测179G>T的正向引物179F和反向引物179R，第二组用于检测268T>A的正向引物268F和反向引物268R，第三组用于检测364C>T的正向引物364F和反向引物364R，第四组用于检测1322delT的正向引物1322F和反向引物1322R。进一步地，根据CMAH基因SNP变化设计八条探针（四组探针），两条用于检测179G>T的野生型探针179WP和突变型探针179MP，两条用于检测268T>A的野生型探针268WP和突变型探针268MP，两条用于检测364C>T的野生型探针364WP和突变型探针364MP，两条用于检测1322delT的探针野生型1322WP和突变型探针1322MP。
根据猫CMAH基因的四个SNP位点设计的四组引物，分别包括：
第一组引物包括179F和179R，用于检测179G>T；
第二组引物包括268F和268R，用于检测268T>A；
第二组引物包括364F和364R；用于检测364C>T；
第四组引物包括1322F和1322R，用于检测1322delT；
引物名称分别为179F、179R、268F、268R、364F、364R、1322F和1322R的序列分别对应为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，具体序列参见表1。
根据猫CMAH基因的四个SNP位点的突变情况涉及的四组探针，分别包括：
第一组探针包括179WP和179MP，用于检测179G>T；
第二组探针包括268WP和268MP，用于检测268T>A；
第三组探针包括364WP和364MP，用于检测364C>T；
第三组探针包括1322WP和1322MP，用于检测1322delT；
探针名称分别为179WP、268WP、364WP、1322WP，属于野生型探针，序列分别为：
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.15，探针名称分别为179MP、268MP、364MP、1322MP属于突变型探针，序列分别为：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQID NO.12和SEQ ID NO.16，具体序列参见表1。
2.DNA提取
提取待检样本中的核酸。本实施例中，通过裂解液对猫口腔拭子进行热裂解5分钟后获得的上清液为待检测样本。本实施例中，选取的待测样本的猫血型为已知的A型。
上述裂解液每50mL中包括10mmol/L的NaCl 15μL、10mmol/L的EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）15μL、NP-40（乙基苯基聚乙二醇）350μL，采用Tris-HCl缓冲液将pH调制8.0，最后用超纯水补充体积至50mL。
3.阳性参考品的合成
阳性参考品为通过检测的目的基因合成的特异性质粒片段，包括野生型阳性参考品和突变型阳性参考品两种，其中，特异性质粒片段由北京擎科生物科技股份有限公司合成，具体序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示。
野生型阳性参考品按106copies/mL的终浓度配制得到野生型阳性质控品。
突变型阳性参考品按106copies/mL的终浓度配制得到突变型阳性质控品。
4.核酸加样：将待检测样本、野生型阳性质控品、突变型阳性质控品及空白对照样品均以10µL的体积分别加入含有野生型检测液和突变型检测液的8连管中，封盖后震荡离心。
程序运行：将上述反应管置于实时荧光PCR仪，设置下列程序运行：
步骤①：95℃×5min，运行一个循环；
步骤②：95℃×5s；60℃×20s；运行45个循环。
步骤②中，60℃×20s时，设置FAM检测通道、VIC检测通道、ROX检测通道和CY5检测通道，进行荧光采集，获得荧光图谱。
结果分析：分析荧光图谱中是否存在扩增信号，如无扩增信号直接判读为阴性；如果有扩增信号时，则相应样品中的核酸模板为阳性。
结果判读：本实施例中FAM通道检测的基因位点为179G＞T；VIC通道检测的基因位点为268T-A；ROX通道检测的基因位点为364C-T，CY5通道检测的基因位点为1322delT；其中，野生型检测液检测野生位点，突变型检测液检测位点是否发生突变。
参阅图5-图12，分别为本实施例中野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品和突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品在FAM通道、VIC通道、ROX通道和ROX通道扩增曲线结果图。
图5为野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，FAM通道扩增曲线结果图，其中野生型阳性参考品Ct≤40，突变型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在179基因位点碱基为G，突变型阳性参考品在179基因位点碱基为T。
图6为野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，VIC通道扩增曲线结果图，其中野生型阳性参考品Ct≤40，突变型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在268基因位点碱基为T，突变型阳性参考品在179基因位点碱基为A。
图7为野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，ROX通道扩增曲线结果图，其中野生型阳性参考品Ct≤40，突变型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在364基因位点碱基为C，突变型阳性参考品在364基因位点碱基为T。
图8为野生型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，CY5通道扩增曲线结果图，其中野生型阳性参考品Ct≤40，突变型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在1322基因位点未缺失T，突变型阳性参考品在1322基因位点缺失碱基T。
图9为突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，FAM通道扩增曲线结果图，其中突变型阳性参考品Ct≤40，野生型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在179基因位点碱基为G，突变型阳性参考品在179基因位点碱基为T。
图10为突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，VIC通道扩增曲线结果图，其中突变型阳性参考品Ct≤40，野生型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在268基因位点碱基为T，突变型阳性参考品在179基因位点碱基为A。
图11为突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，ROX通道扩增曲线结果图，其中突变型阳性参考品Ct≤40，野生型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在364基因位点碱基为C，突变型阳性参考品在364基因位点碱基为T。
图12为突变型检测液检测野生型阳性参考品和突变型阳性参考品，CY5通道扩增曲线结果图，其中突变型阳性参考品Ct≤40，野生型阳性参考品无扩增曲线，因此判读为野生型阳性参考品在1322基因位点未缺失T，突变型阳性参考品在1322基因位点缺失碱基T。
对上述图谱进行分析，野生型阳性参考品在上述四个基因位点的碱基分别为179G纯合子、268T纯合子、364C纯合子、1322未缺失T纯合子；突变型阳性参考品在上述四个基因位点的碱基分别为179T纯合子、268A纯合子、364T纯合子、1322缺失T纯合子；野生型检测液检测野生型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阳性；野生型检测液检测突变型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阴性；突变型检测液检测野生型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阴性；突变型检测液检测突变型参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阳性；野生型阳性参考品、突变型参考品分别应用为野生型阳性质控品、突变型阳性质控品，判断实验结果可控。
参阅图13-图14，分别为本实施例中野生型检测液检测待检测样本和突变型检测液检测待检测样本在FAM通道、VIC通道、ROX通道和ROX通道扩增曲线结果图。
参阅图13，为野生型检测液检测待检测样本的结果，结果显示野生型检测中，四个荧光通道FAM、VIC、ROX、CY5均为阳性。
参阅图14，为突变型检测液检测待检测样本的结果，结果显示野生型四个荧光通道均为阳性，突变型四个荧光通道均为阴性。
对上述图谱分析可知，待测样本为A型纯合子，其猫血型的判断结果与本发明实施例1采用的分析方法判定结果一致，说明采用本发明的技术方案进行猫血型的检测分析，方法是可靠的。
基于实施例提供的技术方案，可进一步地将其应用于CMAH基因是否为纯合子的判断，判断方法包括通过野生型和突变型两种试剂同时对样本检测，可实现对CMAH基因是否为纯合子作出判断，其具体原理为：纯合子，指二倍体中同源染色体上相同位点上的两个等位基因相同的基因型个体； 杂合子，是指二倍体中同源染色体相同位点上的两个等位基因不相同的基因型个体；若样本中野生型和突变型检测均判读为阳性，即相同位点上的两个等位基因不相同，既有野生型又有突变型，说明该样本的检测位点为杂合子；若样本中野生型判读为阳性，突变型判读为阴性，即相同位点上的等位基因相同，且都是野生型，则说明该样本的检测位点为显性纯合子；若样本中野生型判读为阴性，突变型判读为阳性，即相同位点上的等位基因相同，且都是突变型，则说明该样本的检测位点为隐性纯合子。
以上仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种猫血型检测方法，其特征在于，包括：采用引物和探针组合物，以猫口腔拭子样本的核酸为模板DNA，进行PCR反应，完成所述PCR反应后，无需将PCR反应产物取出，直接进行荧光采集；利用实时荧光PCR技术检测分析猫CMAH基因是否存在179G>T、268T>A、364C>T、1322delT四个位点SNP突变，从而实现对猫血型的检测；
所述引物和探针组合物包括四组引物和四组探针：
第一组引物，包括序列为SEQ ID NO.1的正向引物和序列为SEQ ID NO.2的反向引物；
第二组引物，包括序列为SEQ ID NO.5的正向引物和序列为SEQ ID NO.6的反向引物；
第三组引物，包括序列为SEQ ID NO.9的正向引物和序列为SEQ ID NO.10的反向引物；
第四组引物，包括序列为SEQ ID NO.13的正向引物和序列为SEQ ID NO.14的反向引物；
第一组探针，包括序列为SEQ ID NO.3的野生型探针和序列为SEQ ID NO.4的突变型探针；
第二组探针，包括序列为SEQ ID NO.7的野生型探针和序列为SEQ ID NO.8的突变型探针；
第三组探针，包括序列为SEQ ID NO.11的野生型探针和序列为SEQ ID NO.12的突变型探针；
第四组探针，包括序列为SEQ ID NO.15的野生型探针和序列为SEQ ID NO.16的突变型探针。
2.根据权利要求1所述的猫血型检测方法，其特征在于，具体包括：在完成PCR反应后，若利用所述实时荧光PCR技术无法获得扩增信号，则判断为阴性，反之，若利用所述实时荧光PCR技术获得扩增信号，则判断为阳性。
3.根据权利要求1所述的猫血型检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将所述引物和探针组合物中用于检测野生位点的引物和探针制成第一检测液，用于检测突变位点的引物和探针制成第二检测液；
将含有所述模板DNA的待检测样本分别与所述第一检测液、所述第二检测液混合，然后利用所述实时荧光PCR技术分别进行野生位点、突变位点的检测，并根据获得的野生位点、突变位点的两个检测结果进行猫血型的判定。
4.根据权利要求3所述的猫血型检测方法，其特征在于，还包括：
分别将野生型阳性参考品、突变型阳性参考品分别按105~107copies/mL的终浓度配制得到野生型阳性质控品、突变型阳性质控品；
其中，所述野生型阳性参考品包括序列为SEQ ID NO.17的野生型特异性质粒片段，所述突变型阳性参考品包括序列为SEQ ID NO.18的突变型特异性质粒片段；
所述第一检测液检测所述野生型阳性参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阳性；
所述第一检测液检测所述突变型阳性参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阴性；
所述第二检测液检测所述野生型阳性参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阴性；
所述第二检测液检测所述突变型阳性参考品，检测结果应为FAM、VIC、ROX、CY5四个荧光通道均为阳性；
所述野生型阳性参考品、所述突变型阳性参考品分别应用为所述野生型阳性质控品、所述突变型阳性质控品，用于判断实验结果是否在控。
5.根据权利要求4所述的猫血型检测方法，其特征在于，具体包括：
将待检测样本、所述野生型阳性参考品、所述突变型阳性参考品、空白对照样品分别与所述第一检测液、所述第二检测液混合，制成多组样品；
将所述多组样品分别置于实时荧光PCR仪中，设置下列程序运行：
步骤①：95℃×5min，运行1个循环；
步骤②：95℃×5s；60℃×20s；运行45个循环；
步骤②中，60℃×20s时，分别设置FAM通道、VIC通道、ROX通道和CY5通道，进行荧光采集，其中FAM通道、VIC通道、ROX通道、CY5通道所检测的猫CMAH基因的位点分别对应为179G＞T、268T>A、364C＞T、1322delT；
之后，对荧光采集的结果进行分析，包括：检测结果中Ct≤40时判读为阳性；检测结果中Ct未检出时判读为阴性。
6.一种猫血型检测试剂，其特征在于，采用如权利要求1所述的猫血型检测方法，其中包括如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.16所示的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括：
第一组引物，包括序列为SEQ ID NO.1的正向引物和序列为SEQ ID NO.2的反向引物；
第二组引物，包括序列为SEQ ID NO.5的正向引物和序列为SEQ ID NO.6的反向引物；
第三组引物，包括序列为SEQ ID NO.9的正向引物和序列为SEQ ID NO.10的反向引物；
第四组引物，包括序列为SEQ ID NO.13的正向引物和序列为SEQ ID NO.14的反向引物；
第一组探针，包括序列为SEQ ID NO.3的野生型探针和序列为SEQ ID NO.4的突变型探针；
第二组探针，包括序列为SEQ ID NO.7的野生型探针和序列为SEQ ID NO.8的突变型探针；
第三组探针，包括序列为SEQ ID NO.11的野生型探针和序列为SEQ ID NO.12的突变型探针；
第四组探针，包括序列为SEQ ID NO.15的野生型探针和序列为SEQ ID NO.16的突变型探针。
7.根据权利要求6所述的猫血型检测试剂，其特征在于，还包括阳性参考品；
所述阳性参考品包括野生型阳性参考品和突变型阳性参考品；
所述野生型阳性参考品包括序列为SEQ ID NO.17的野生型特异性质粒片段；
所述突变型阳性参考品包括序列为SEQ ID NO.18的突变型特异性质粒片段。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6-7中任一项所述猫血型检测试剂。
9.如权利要求1-5任一项所述的猫血型检测方法在鉴别猫CMAH基因是否为纯合子中的应用。
CN202311555275.7A 2023-11-21 2023-11-21 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用 Active CN117265138B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311555275.7A CN117265138B (zh) 2023-11-21 2023-11-21 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311555275.7A CN117265138B (zh) 2023-11-21 2023-11-21 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117265138A CN117265138A (zh) 2023-12-22
CN117265138B true CN117265138B (zh) 2024-02-27

Family

ID=89218110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311555275.7A Active CN117265138B (zh) 2023-11-21 2023-11-21 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117265138B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115717170A (zh) * 2022-12-26 2023-02-28 北京格致博雅生物科技有限公司 一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115717170A (zh) * 2022-12-26 2023-02-28 北京格致博雅生物科技有限公司 一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CMAH genotyping survey for blood types A, B and C (AB) in purpose-bred cats;Alexandra Kehl等;Anim Genet;第50卷(第3期);第2页最后1段 *
Evaluating the association between blood genotype or phenotype and haemoplasma infection in UK and Italian cats;Eva Spada等;Vet Rec;第192卷(第12期);全文 *
Molecular characterization of blood type A, B, and C (AB) in domestic cats and a CMAH genotyping scheme;AlexandraKehl等;Plos One;第13卷(第9期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117265138A (zh) 2023-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103451311B (zh) 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
JP7391877B2 (ja) 癌におけるマイクロサテライト不安定性を検出するためのバイオマーカーパネル及び方法
CN107488711B (zh) 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
CN110055312B (zh) 用于检测egfr基因c797s和t790m顺反式突变的引物、探针及试剂盒
CN107385028B (zh) 一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒
CN108823294B (zh) 基于20个单倍群d的y-snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN110564861A (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN107988385B (zh) 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒
CN111748628B (zh) 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒
CN117265138B (zh) 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用
CN114085926B (zh) Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN107937493B (zh) 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物
CN109706247B (zh) 利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法
CN113234838A (zh) 高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法
CN108642190B (zh) 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN112029836A (zh) 检测braf基因突变的核酸组合物及试剂盒和braf基因突变的检测方法
CN112080556A (zh) 一种对淋球菌耐药基因进行多重快速测序的方法
CN113088566B (zh) 人运动神经元存活基因1拷贝数定量检测试剂盒及分析方法
CN117106865B (zh) 基于双扩增放大和双lna探针特异识别dna突变的高灵敏检测方法
CN114525363B (zh) 与菜花颜色相关的分子标记的引物及鉴别菜花颜色的方法
CN113652476B (zh) 羟甲基化分析中dna整体转化效率的评估方法
CN111235293B (zh) 一种黑麦6rl染色体臂特异kasp分子标记及其应用
CN111850142B (zh) 商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异indel及其分子标记与应用
Ceko et al. Comparison Test of Sensitivity Between Next Generation Sequencing (NGS) Hotspot Panel and Droplet Digital PCR of KRAS G12/G13 Mutation
CN112226494A (zh) 一种AGTR1基因rs5186位点多态性检测用引物组及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant