CN115717170A - 一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，对猫CMAH基因上的4个单核苷酸突变位点进行检测。其特征在于：检测猫血型的单核苷酸突变位点包括：CMAH 179G>T，CMAH 268T>A，CMAH 364C>T，CMAH1322delT。本发明采用SNaPshot技术进行SNP分型检测，一次性可以检测多个位点，取样量少，且准确度高，结果容易判读。通过对猫血型检测，可有效避免新生儿溶血和输血不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法。
背景技术
我们的伴侣动物猫跟人一样，拥有自己的血型系统。猫公认的血型系统为AB型血型系统，包括3种血型：A型、B型和AB型。其中A型最常见，在不同的品种中，猫A血型高达90％。A型、B型和AB型的显隐性关系为：A型显性>AB型显性>B型显性。
宠物主人平时很少会想到检测猫的血型，除非自己的猫咪需要输血。和人一样，猫咪如果输错血型也很危险。在临床治疗中，当猫遇到外科手术、事故、贫血等需要输血的情况，如果没有输入相配的血，死亡的几率会很大。在繁育时，准确知道猫咪血型对繁育者意义重大，如果B型母猫与A型公猫交配，产下A型或AB型幼猫，当幼猫饮用母乳时则会造成红细胞破坏发生溶血，即新生儿溶血。这是因为B型母猫分娩后，乳汁中存在大量的A抗体，会攻击幼猫的红细胞，导致幼猫溶血症。据统计，新生猫溶血是造成新生幼猫死亡的最主要因素之一。因此，无论是临床还是繁育，提前了解猫咪的血型都十分重要。
目前常用的分型检测方法有Sanger测序、Taqman探针、Massarray等方法。Sanger测序一次仅能检测一个位点，费用高且耗时长；Taqman探针对探针的特异性要求高，不易设计；Massarray要求样本量多，准确度低。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，其包括扩增引物、延伸引物，并对扩增引物进行blast特异性比对；
步骤二：提取待测猫的口腔拭子基因组DNA；
步骤三：以待测猫的口腔拭子基因组DNA为模板，利用引物组合进行多重SNaPshot分型检测：包括多重PCR扩增；PCR产物纯化；多重延伸反应；延伸产物纯化；
步骤四：毛细管电泳，分析延伸产物，从而对猫血型进行判定。
优选的，所述步骤一中扩增名称为CMAH179-F、CMAH 179-R、CMAH268-F、CMAH268-R、CMAH364-F、CMAH364-R、CMAH1322-F、CMAH1322-R；延伸引物名称为CMAH179-YS-F、CMAH268-YS-F、CMAH364-YS-F、CMAH1322-YS-F。
优选的，所述步骤一中还包括以下步骤，
a：将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟；
b：按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM；
c：再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物；
d：将延伸引物稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重延伸引物。
优选的，所述步骤二中采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
优选的，所述步骤三中多重PCR扩增步骤如下，
a：预先将PCR扩增组分取出置冰上融化，10×buffer、dNTP、多重扩增引物混合液轻微震荡混匀，离心备用，Hstaq酶离心置于冰上备用；
b：配置PCR扩增混合液，每反应分装9μL；
c：加样，在9μL扩增反应体系中加入1μL DNA；
d：扩增，在PCR仪上进行PCR程序扩增，扩增程序如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、65℃～55℃每循环降低1℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行10个循环；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；之后72℃延伸10分钟，4℃保存。
优选的，所述步骤三中PCR产物纯化步骤如下，
a：取4μL多重PCR产物；
b：加入2U SAP酶和2U Exonuc lease I酶；37℃温浴1小时；
c：然后75℃灭活20分钟。
优选的，所述步骤四中产物毛细管电泳检测步骤如下，
a：取1μL SAP处理完的延伸产物；
b：加入8.8μL HIDI及0.2μL Liz120，95℃变性3分钟；
c：立即冰浴2分钟，用测序仪进行测序。
优选的，所述测序完成后用genemapper6.0对分型结果进行判读，根据延伸引物大小设置panel、bin，依据出峰的位置及颜色判断每个位点的分型。
(三)有益效果
本发明提供了一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法。具备以下有益效果：该一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，同现有其他技术相比，采用SNaPshot技术进行SNP分型检测，一次性可以检测多个位点，取样量少，且准确度高，结果容易判读。通过对猫血型进行检测，可有效避免新生儿溶血和输血不良反应。
附图说明
图1为实施例中对A型血样本进行SNaPshot分型检测结果；
图2为实施例中对A型血携带一份B型血样本进行SNaPshot分型检测结果；
图3—图6为图1样本sanger测序验证结果；
图7—图10为图2样本sanger测序验证结果；
图11为4个SNP位点检测分型结果对应的猫血型。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、引物设计
根据SNaPshot分型检测技术，设计4个SNP位点引物，包含扩增引物及延伸引物。
(一)、扩增引物
(二)、延伸引物
二、DNA提取
采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
三、稀释引物
将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟，按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM。再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物。将延伸引物稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重延伸引物。
四、多重PCR扩增
(1)预先将PCR扩增组分取出置冰上融化，10×buffer、dNTP、多重扩增引物混合液轻微震荡混匀，离心备用，Hstaq酶离心置于冰上备用。
(2)配置PCR扩增混合液，每反应分装9μL，体系如下：
| 试剂 | 用量(μL) |
| 10×PCR Buffer(Mg2+Plus) | 1×n |
| dNTP Mixture(各2.5mM) | 0.6×n |
| TaKaRa Taq HS(5U/μL) | 0.1×n |
| Primer Mix(扩增) | 0.5×n |
| ddH<sub>2</sub>O | 6.8×n |
n＝检测样本数+1。
(3)加样：在9μL扩增反应体系中加入1μL DNA；
(4)扩增：在PCR仪上进行PCR程序扩增，扩增程序如下：
(5)95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、65℃～55℃每循环降低1℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行10个循环；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；之后72℃延伸10分钟，4℃保存。
五、PCR产物纯化
取4μL多重PCR产物，加入2U SAP酶和2U Exonuc lease I酶，37℃温浴1小时，然后75℃灭活20分钟。
六、多重延伸反应
(1)预先将延伸组分取出置冰上融化，SNaPshot Ready Mix试剂、延伸引物混合液轻微震荡混匀，离心备用。
(2)配置延伸反应混合液，每反应分装5μL，体系如下：
| 试剂 | 用量(μL) |
| SNaPshot Ready Mix | 1×n |
| Primer Mix(延伸) | 1×n |
| ddH<sub>2</sub>O | 3×n |
n＝检测样本数+1。
(3)加样：在5μL延伸反应体系中加入1μL纯化后的多重PCR产物；
(4)延伸：在PCR仪上进行PCR程序延伸，延伸程序如下：
(5)95℃变性10秒、50℃退火5秒、60℃延伸30秒；运行30次循环，4℃保存。
七、延伸产物纯化
在6μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1小时，然后75℃灭活20分钟。
八、产物毛细管电泳检测
取1μL SAP处理完的延伸产物，加入8.8μL HIDI及0.2μL Liz120，95℃变性3分钟，立即冰浴2分钟，用测序仪进行测序。
九、数据分析
测序完成后用genemapper6.0对分型结果进行判读。根据延伸引物大小设置panel、bin，依据出峰的位置及颜色判断每个位点的分型。
图1、图2样本位点分型结果如下表：
| 样本 | CMAH 179G>T | CMAH 268T>A | CMAH 364C>T | CMAH 1322delT |
| 8087 | GG | TT | CC | TT |
| 8112 | GG | TA | CC | TT |
以上内容描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神和基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，包括扩增引物、延伸引物，并对扩增引物进行blast特异性比对；
步骤二：提取待测猫的口腔拭子基因组DNA；
步骤三：以待测猫的口腔拭子基因组DNA为模板，利用引物组合进行多重SNaPshot分型检测：包括多重PCR扩增；PCR产物纯化；多重延伸反应；延伸产物纯化；
步骤四：毛细管电泳，分析延伸产物，从而对猫血型进行判定。
2.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤一中扩增名称为CMAH179-F、CMAH179-R、CMAH268-F、CMAH268-R、CMAH364-F、CMAH364-R、CMAH1322-F、CMAH1322-R；延伸引物名称为CMAH179-YS-F、CMAH268-YS-F、CMAH364-YS-F、CMAH1322-YS-F。
3.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤一中还包括以下步骤，
a：将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟；
b：按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM；
c：再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物；
d：将延伸引物稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重延伸引物。
4.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤二中采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
5.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤三中多重PCR扩增步骤如下，
a：预先将PCR扩增组分取出置冰上融化，10×buffer、dNTP、多重扩增引物混合液轻微震荡混匀，离心备用，Hstaq酶离心置于冰上备用；
b：配置PCR扩增混合液，每反应分装9μL；
c：加样，在9μL扩增反应体系中加入1μL DNA；
d：扩增，在PCR仪上进行PCR程序扩增，扩增程序如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、65℃～55℃每循环降低1℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行10个循环；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；之后72℃延伸10分钟，4℃保存。
6.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤三中PCR产物纯化步骤如下，
a：取4μL多重PCR产物；
b：加入2U SAP酶和2U Exonuc lease I酶；37℃温浴1小时；
c：75℃灭活20分钟。
7.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤四中产物毛细管电泳检测步骤如下，
a：取1μL SAP处理完的延伸产物；
b：加入8.8μL HIDI及0.2μL Liz120，95℃变性3分钟；
c：立即冰浴2分钟，用测序仪进行测序。
8.根据权利要求7所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述测序完成后用genemapper6.0对分型结果进行判读，根据延伸引物大小设置panel、bin，依据出峰的位置及颜色判断每个位点的分型。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN117265138A (zh) * | 2023-11-21 | 2023-12-22 | 苏州大学 | 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用 |
| CN117305477A (zh) * | 2023-11-27 | 2023-12-29 | 北京纳百生物科技有限公司 | 一种对猫血型基因分型的荧光检测试剂盒 |
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| CN117265138B (zh) * | 2023-11-21 | 2024-02-27 | 苏州大学 | 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用 |
| CN117305477A (zh) * | 2023-11-27 | 2023-12-29 | 北京纳百生物科技有限公司 | 一种对猫血型基因分型的荧光检测试剂盒 |
| CN117305477B (zh) * | 2023-11-27 | 2024-03-08 | 北京纳百生物科技有限公司 | 一种对猫血型基因分型的荧光检测试剂盒 |
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