CN104611425B - 一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用。所述分子标记来自奶牛TRAPPC9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第165bp位点处的碱基为T或C。此处碱基为C的中国荷斯坦奶牛的金葡菌乳房炎抗性显著高于此处碱基为T的中国荷斯坦奶牛，而体细胞数前者显著低于后者。本发明还提供了用于检测所述SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒。本发明还提供了所述SNP标记在鉴定金葡菌乳房炎抗性高的中国荷斯坦奶牛优势品系中的应用。本发明还提供了所述SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用。本发明的SNP标记为中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性的标记辅助选择提供了科学依据。

Description

一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP分子标 记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记，具体地说，涉及一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
乳房炎主要是由于病原微生物通过奶牛的乳头导管或乳头管以及乳房皮肤外伤等因素进入奶牛的乳房组织，并在组织内大量繁殖，引起乳腺发生炎症反应。另外，饲养管理时奶牛的乳腺组织受到机械刺激或者物理和化学性损伤也会引起奶牛乳房炎。
金葡菌产生毒素可以破坏细胞膜，并且可以直接毁坏组织，毒素转移到管道系统，毁坏泌乳细胞。金葡菌引起的乳房炎对奶牛群产生的不利影响包括牛奶产量和品质的降低等，还会影响奶牛正常生理功能并延长产后发情时间，严重的会造成奶牛过早淘汰增加牛群更替成本。
又有前人发现被有40％被金葡菌感染的奶牛的SCC反而低于未感染时，因此不能准确地断定高低SCC与金葡菌感染之间的关系，这也导致在奶牛生产中不能正确排除感染金葡菌的奶牛。
随着分子遗传学、分子生物学技术和数量遗传学的发展，分子遗传标记和标记辅助选择被广泛地应用到畜禽育种中，并取得了巨大的成就。Snapshot测序技术是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目，其主要原理是将测序酶、四种荧光标记的ddNTP、紧邻多态位点的延伸引物和PCR产物模板按一定体系混合，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测，根据峰的颜色可以得知参与反应的碱基种內，从而判断样本在该位点的基因型。该方法具有分型准确、通量高、不受SNP位点多态性特性限制和样本个数限制等优点。
转运蛋白颗粒复合体9(TRAPPC9,trafficking protein particle complex 9)基因是人常染色体隐性精神发育迟滞智力障碍相关的基因，其编码的蛋白转运蛋白颗粒复合体9参与内质网到高尔基体的囊泡转移和神经细胞的分化，其编码的蛋白也叫做NIBP(NIKand IKKβ-binding protein)，参与膜泡运输过程，同时具有增强TNF-α活化NF-κB信号通路的功能。NF-κB是重要的核转录因子，参与调控大量基因表达，在细胞生存、增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要的生物学功能。目前关于TRAPPC9基因对于金葡菌乳房炎抗性的影响还没有报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP分子标记，所述分子标记来自奶牛TRAPPC9基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，第165bp位点处的碱基为T或C。
本发明还提供了用于扩增所述SNP标记的引物对，所述引物对中正向引物F如SEQID No.2所示、反向引物R如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了用于检测所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒含有正向引物F如SEQ ID No.2所示、反向引物R如SEQ ID No.3所示和分型延伸引物如SEQ ID No.4所示。
进一步地，所述试剂盒包括Premix TaqTM、ExoI、FastAP、ExoI buffer和SnapshotMix。
本发明还提供了所述SNP标记在鉴定中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性优势品系中的应用。
具体地，包括如下步骤：
(1)提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA；
(2)以待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA为模版，利用扩增引物，通过PCR反应扩增出中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因345bp片段；
(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中165bp处的碱基为C，则待测中国荷斯坦奶牛属于金葡菌乳房炎抗性高的中国荷斯坦奶牛优势品系。
进一步地，步骤(2)中PCR反应使用的扩增体系以15μl计为：模板DNA 1μl，引物混合0.151μl，dNTP mix 0.3μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液1.5μl，MgCl21.5μl,ddH2O 10.25μl。
F：5’-TTTATCCTGACGATGTCTGCC-3’
R：5’-CTGCTGTGAGCCCAAAACTAT-3’；
PCR反应的条件为：95℃5分钟；94℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，72℃30秒，11个循环；94℃15秒,54℃15秒，72℃30秒，24个循环；72℃3分钟。
本发明还提供了所述SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用。
具体地，包括如下步骤：
(1)采用聚合酶链式反应和测序技术筛选到与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP标记；
(2)检测待测中国荷斯坦奶牛的基因型；
(3)根据基因型进行金葡菌乳房炎抗性高的中国荷斯坦奶牛优势品系的选育。
本发明的有益效果在于：
本发明对中国荷斯坦奶牛的TRAPPC9基因的SNP位点进行基因分型，并对该SNP分子标记与奶牛的金葡菌乳房炎抗性进行关联分析，分析发现，CC基因型个体的金葡菌乳房炎抗性显著高于TT基因型个体(P<0.05)，GG基因型个体的体细胞数显著低于AA基因型个体(P<0.01)。该多态位点的检出，为中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性的标记辅助选择提供了科学依据。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.1提取待测中国荷斯坦奶牛血液中的基因组DNA
将采自中国地区不同奶牛养殖场的共517头中国荷斯坦奶牛的牛血样保存于-20℃，该牛血样为凝结牛全血，全血分为血凝块和血清，血凝块为黯红色，血清呈清亮黄色，血液中只有白细胞内含有DNA，白细胞主要存在于血凝块部分。
本试验采用天根血液DNA样品提取试剂盒从血凝块中提取基因组DNA，具体步骤如下：
1)用眼科剪剪取0.2-0.3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管中，加入500μl的细胞裂解液CL；
2)利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，震荡15s,12,000rpm离心1min,弃去暗红色上清
3)再次加入700μl细胞裂解液CL，振荡器振荡使沉淀物散开悬浮，12,000rpm离心1min,弃去上清；
4)加入200μl缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；
5)加入20μl蛋白酶K，250μl缓冲液GB，充分晃动混匀；
6)将离心管用封口膜封号放入到56℃杂交炉中消化3-4小时，为确保充分消化，消化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离心；
7)加入200μl冰镇无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀15s,此时可能会出现絮状沉淀；
8)将上一步所得的溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12，000rpm离心30s,弃去收集管中废液，将吸附柱放入收集管中；
9)向吸附柱CB3中加入500μl去蛋白缓冲液GD，静置2min,12000rmp离心30s,弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
10)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rmp离心30s,弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
11)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rmp离心30s,弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
12)将吸附柱放入收集管中，12000rmp离心2min,弃去废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底发挥吸附柱上残余的乙醇；
13)将吸附柱转入至一个新的离心管中，加入100μl56℃预热的TE缓冲液，室温放置5min，12000rmp离心2min，基因组DNA则存在于离心管中；
14)利用NanoDrop2000紫外分光光度计和凝胶电泳检测DNA提取质量；
15)将检测合格的DNA放入-20℃冰箱保存。
1.2扩增含SNP位点的核苷酸片段
根据GenBank上寻找的牛TRPPC9基因序列，利用primer3.0和Oligo6.0软件进行引物设计。包括正向引物F：5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’和反向引物R：5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’。由于TRPPC9基因比较长，本专利引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。将引物溶解成10pmol/μl。
其中，PCR反应体系以25μl计为：10pmol/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，PreMIX 12.5μl，余量为ddH2O。
PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃35秒，35个循环；72℃10分钟。
1.3检测PCR扩增片段，获得SNP标记
对1.2中的PCR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中265bp处的碱基为C，则待测中国荷斯坦奶牛属于金葡菌乳房炎抗性牛的中国荷斯坦奶牛优势品系。
1.4基因型判定
采用ABI公司的Multiplex SnaPshot微测序技术进行SNP分型。引物设计、合成及分型均有伤害捷瑞生物工程有限公司完成。步骤如下：
1)引物设计
由于待分型的多个核酸片段需要在同一个反应体系中进行多重PCR反应，因此需对目的SNPs进行多重PCR设计，每个SNP设计一对扩增引物(上游引物5’-TTTATCCTGACGATGTCTGCC-3’；下游引物5’-CTGCTGTGAGCCCAAAACTAT-3’)和一个分型延伸引物(5’-AAAATACTTAACAAGTCCAAAG-3’)。
2)多重PCR扩增
反应体系PCR反应体系以15μl计为：模板DNA 1μl，引物混合0.151μl，dNTP mix0.3μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液1.5μl，MgCl21.5μl,ddH2O 10.25μl。
PCR反应条件为：95℃5分钟；94℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，72℃30秒，11个循环；94℃15秒,54℃15秒，72℃30秒，24个循环；72℃3分钟。
3)PCR产物纯化
取3μl PCR产物用Exol和FastAP纯化，其中Exol是用来除反应物中的剩余引物，FastAP用来去除反应中剩余的dNTP。反应体系为33μl PCR产物，0.2μl Exol,0.8μlFastAP,0.7μl Exol buffer,3.3μl ddH2O；反应条件为：37℃，15min,80℃,15min。
4)延伸反应
纯化后预先混好延伸引物，进行延伸反应，反应体系为：2μl PCR产物，1μlSnapshot Mix试剂，2μl延伸引物混合，1μlddH2O：反应条件为96℃1分钟；96℃10秒，52℃5秒，60℃30℃秒。
5)测序
取1μl延伸产物，加10μl上样loading buffer，95℃变性3min,立即冰水浴，上测序仪进行检测。
测待测中国荷斯坦奶牛的基因型；根据混池测序的结果判定SNP位点在检测群体中的基因型。根据样品的信号的分布位置，基因型可分为TT型、TC型和CC型。
1.5上述SNP标记在中国荷斯坦奶牛优势品系选育中的应用
该SNP可作为分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响金葡菌乳房炎抗性和体细胞数数量性状基因座，以对奶牛直接进行基因型选择或标记辅助选择，从而加快中国荷斯坦奶牛优势品系的选育。
实施例2中国荷斯坦奶牛不同基因型中国荷斯坦奶牛对金葡菌抗性的影响
按照实施例1的方法，对采自中国不同地区不同奶牛养殖场的517头中国荷斯坦奶牛进行飞行时间质谱检测，TRAPPC9基因如SEQ ID NO.1所示序列265bp位点的分析结果如表1所示。
表1 SNP基因型在所研究群体中的基因频率及等位基因频率
由表1可知，CC纯合型个体数显著高于TT型，C等位基因为优势基因，卡方适合性检验χ2＝0.0004<χ2 0.05(1)＝3.84,期望值与观测值差异不显著，说明该SNP位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。
表2 卡方独立性检验
从表2的χ2＝6.2>χ2 0.05(2)＝5.99可以得到，金葡菌阴性牛和阳性牛的SNP的基因型分布不同。
表3 不同基因型的体细胞数比较
注：以上所有表中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，表中*表示差异显著(P<0.05)，**表示极显著相关。
从表3可以得到，阴性牛CC基因型的体细胞数显著的低于阳性牛的CT、TT基因型。阴性牛的体细胞数低于阳性牛，可见只考虑体细胞数无法准确的判断奶牛是否感染金葡菌。也得出碱基为T的荷斯坦奶牛感染金葡菌的机会大于C碱基。
实施例3试剂盒
试剂盒中各成分组成如下：
50-100ng/μl牛血液DNA；
引物F；
引物R；
PreMIX；
TaqTM；
ExoI；
FastAP；
ExoI buffer；
Snapshot Mix5U/μl Taq DNA聚合酶；
10×PCR反应缓冲液；
双蒸水。
试剂盒中PCR反应使用的扩增体系以15μl计为：模板DNA 1μl，引物混合0.151μl，dNTP mix 0.3μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液1.5μl，MgCl21.5μl,ddH2O10.25μl。
F：5’-TTTATCCTGACGATGTCTGCC-3’
R：5’-CTGCTGTGAGCCCAAAACTAT-3’。
其中，PCR反应的条件为：95℃5分钟；94℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，72℃30秒，11个循环；94℃15秒,54℃15秒，72℃30秒，24个循环；72℃3分钟。
反应所得产物即为目的核苷酸片段，序列如SEQ ID NO.1所示，检测该序列165bp位点上的碱基，从而判断样本的基因型，对奶牛金葡菌乳房炎抗性做出判断。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记来自奶牛TRAPPC9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第165bp位点处的碱基为T或C。
2.用于扩增权利要求1所述SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对中正向引物F如SEQ ID No.2所示、反向引物R如SEQ ID No.3所示。
3.用于检测权利要求1所述SNP标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有正向引物F如SEQ ID No.2所示、反向引物R如SEQ ID No.3所示和分型延伸引物如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Premix TaqTM、ExoI、FastAP、ExoI buffer和Snapshot Mix。
5.检测权利要求1所述SNP标记的试剂在鉴定中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性优势品系中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA；
(2)以待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA为模版，利用扩增引物，通过PCR反应扩增出中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因345bp片段；
(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中165bp处的碱基为C，则待测中国荷斯坦奶牛属于金葡菌乳房炎抗性高的中国荷斯坦奶牛优势品系。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中PCR反应使用的扩增体系以15μl计为：模板DNA 1μl，引物混合0.151μl，dNTP mix 0.3μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液1.5μl，MgCl2 1.5μl,ddH2O 10.25μl；
F：5’-TTTATCCTGACGATGTCTGCC-3’
R：5’-CTGCTGTGAGCCCAAAACTAT-3’；
PCR反应的条件为：95℃5分钟；94℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，72℃30秒，11个循环；94℃15秒,54℃15秒，72℃30秒，24个循环；72℃3分钟。
8.检测权利要求1所述SNP标记的试剂在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用聚合酶链式反应和测序技术筛选到与中国荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相关的SNP标记；
(2)检测待测中国荷斯坦奶牛的基因型；
(3)根据基因型进行金葡菌乳房炎抗性高的中国荷斯坦奶牛优势品系的选育。
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