CN105200050B - 鉴别鱼腥草与百部还魂的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴别鱼腥草与百部还魂的分子特异性标记引物及方法，属于生物技术领域。所述引物为：特异识别的鱼腥草的上游特异性引物HtF：5’‑TTTTCTTCGTCATTGATTCC‑3’、特异识别百部还魂的上游特异性引物GcF：5’‑AGGAAGAAGCGAATATTCCG‑3’，以及下游通用引物trnL‑Fr：5’‑TCCTC TGCTCTACCAGCTGAG‑3’。本方法基于遗传背景的进行分子鉴定，不受药材的产地等外在因素的影响，相对于化学方法，更为准确，也更为简单方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb）和百部还魂（Gymnotheca chinensis Decne）的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对鱼腥草和百部还魂的快速鉴别的方法，属于生物技术领域。
背景技术
中药鱼腥草为三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordata Thunb）的新鲜全草或干燥地上部分。中药百部还魂为同科植物裸蒴（Gymnotheca chinensis Decne）的全草或叶。两者功效和主治均不相同，但由于分布相同，常混生，形态相似，因此极易误采误用；是常见的鱼腥草混淆品，应严格区别。鱼腥草与这些常见混淆品的鉴别可从原植物的叶的形态与显微特征等传统手段进行一定程度的鉴定。但是一旦干燥或经过加工，用这些传统方法进行准确鉴别存在一定难度。而利用化学成分的分析进行鉴定，只根据特定化学成分很容易被误导，也难判断是否混杂。因此急需鱼腥草与其常见混淆品相关产品的快速鉴定方法。由于叶绿体DNA 较核基因组DNA具有更高的拷贝数，在植物相关产品中更为稳定，本研究拟全面分析来源于不同居群的鱼腥草与其常见混淆品植物叶绿体DNA trnL-F区的SNP位点，获得相互鉴别稳定的SNP位点，基于这些位点设计引物，建立多重PCR体系，建立快速、有效、稳定鉴定鱼腥草与其常见混淆品植物及其相关加工产品，并确定他们是否相互混杂的方法，以监控这些产品的质量。
随着分子生物学的发展，多种DNA分子标记技术，而植物叶绿体trnL-F基因具有大量拷贝数，因此被广泛用于植物产品的检测，本文拟对鱼腥草和百部还魂 trnL-F区序列进行测定，分析其序列结构和特征，寻找单核苷酸多态性 (single nucleotidepolymorphism SNP)分子标记，设计分别识别鱼腥草和百部还魂的特异识别引物，建立多重PCR技术，可快速简单鉴别鱼腥草和百部还魂的方法。本发明为鱼腥草和百部还魂的分子辅助鉴别提供了可能性，对有效的鉴别和保护2种中药种质资源具有非常重要的意义，检索未见鱼腥草和百部还魂的分子鉴定的发明专利申请。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可准确，快速，简单鉴定鱼腥草和百部还魂的技术，为准确用药提供技术支持。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
分别设计特异识别的鱼腥草的上游特异性引物HtF（5’- TTTTCTTCGTCATTGATTCC-3’）、和特异识别百部还魂的上游特异性引物GcF（5’- AGGAAGAAGCGAATATTCCG- 3’）分别与下游引物trnL-Fr（5’- TCCTC TGCTCTACCAGCTGAG- 3’）构建多重PCR体系：总量为20 μL，从植物中提取1 0 ng的DNA作为扩增模版，加入1μL 1×TransStart TopTaq DNA聚合酶(TransGen 公司)，2μL 10×TransStart TopTaq Buffer,dNTP 2.5mM,0.2μM下游引物trnL-Fr和上游的2个特定的引物HtF、GcF各0.1 μM，其余为无菌水。构建多重PCR体系，反应程序如下： 95℃ 预变性2分钟，95℃ 变性30 s，50℃引物退火30s和72℃ 延伸2分钟，35个循环；最后一个循环在72℃ 延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。只有鱼腥草取得了435bp，而百部还魂生成特定的671bp的条带。
本发明的优点在于：
由于仅根据某些特征活性化学成分的存在进行鉴别，易受植物成长环境等外在条件的影响，很难进行准确鉴别，特别是混合样品的鉴别。本方法基于遗传背景的进行分子鉴定，不受药材的产地等外在因素的影响，相对于化学方法，更为准确，也更为简单方便。
由于叶绿体DNA比基因组DNA的拷贝数更多，在干燥及加工后的产品中更为稳定，本方法利用叶绿体DNA作为检测对象，比利用基因组DNA作为检测对象，更适合用于对在干燥及加工后的产品的鉴定。
附图说明
图1 利用引物trnL-Fr，HtF，GcF多重PCR的产物凝胶电泳（M :2 log DNA ladder；1-5：百部还魂；69-11：鱼腥草；）。
具体实施方式
实施例1
1 仪器
PCR 仪(Eppendorf，型号5332) ，电泳系统( 北京市六一仪器厂，型号DYY-12) ，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R) ，凝胶成像分析仪(BIO-RAD ChemiDoc XRS)，微量移液器(Eppendorf) 。
2试剂
2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲液，琼脂糖( Promega 公司) ，溴化乙锭( Fluka公司) ，TransStart®TopTaq DNA Polymerase ( 北京全式金公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。
3 材料
本研究实验样品是收集的采自不同产地的样品并经鉴定确认是鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb）和百部还魂（Gymnotheca chinensis Decne）。
4 方法
DNA提取：
⑴ 取5 g新鲜鱼腥草和百部还魂植物叶片剪碎，置于经过杀菌的研钵中，加入0.5gPVP粉末，再加入液氮迅速研磨，将粉末收集于袋子中，置于-20 ℃保存，长时间保存则置于-80 ℃中；
⑵ 取10 mLCTAB溶液于65 ℃水中预热，再加0.2 mL(200μL)巯基乙醇于预热的CTAB中（巯基乙醇：CTAB溶液=1:50）；
⑶ 取步骤（1）获得的粉末0.2 g于2 mLEP管（离心管），迅速加入1 mL预热的含有巯基乙醇的CTAB溶液（样品低温时加入），振荡2分钟左右将其放入65 ℃水浴锅，水浴约1小时；（每20分钟振荡一次，可适当多振荡几次）；
⑷ 往管中加入600μL氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比=24:1，必须在通风橱操作），摇匀5分钟，再将其置于15-20 ℃以12000rpm离心10分钟；
⑸ 取600μL上清液，再加入1.2mL（2倍）预冷的无水乙醇或360μL（0.6倍）异丙醇，置于-20 ℃沉淀约3小时或过夜；
⑹ 取出EP管于4 ℃条件下以12000 rmp离心10分钟，去掉上清液，倒置于吸水纸数分钟；
⑺ 再加入700 μL70％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀，后于4 ℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，再重复一遍，最后置于超净台中吹干；（注意：不可吹干过度）
⑻ 在EP管中加入30-50 μL去离子水（ddH2O）或1×TE溶液，于4 ℃放置3小时或过夜，使其充分溶解，若手摇难以溶解，可用混匀机进行混匀，促其溶解；
⑼可用琼脂糖凝胶检测其是否含基因组DNA，后进行纯化。
特异性引物设计：
根据前期测序实验所得的鱼腥草和百部还魂的trnL-F基因序列，分析其特异SNP位点，采用primer premier 5.0软件设计，根据引物设计的原则，通过特异性位点设计鱼腥草和百部还魂相互鉴别的特异性引物。选定鱼腥草的SNPs位点设计草珊瑚特异性引物并命名为HtF。选定百部还魂特有的SNPs位点设计百部还魂特异性引物和并命名为GcF。引物的方向与特异性见表1。
表1 引物
建立多重PCR 鉴定体系
首先利用鱼腥草和百部还魂的特异性引物HtF、GcF 分别与通用引物trnL-Fr构建PCR体系：总量为20 μL，从植物中提取1 0 ng的DNA作为扩增模版，加入1μL 1×TransStartTopTaq DNA聚合酶 (TransGen 公司)，2μL 10×TransStart TopTaq Buffer,dNTP 2.5mM，0.2μM下游引物trnL-Fr和上游的2个特定的引物HtF、GcF各0.1 μM，其余为无菌水。构建多重PCR体系，反应程序如下：95℃ 预变性2分钟，95℃ 变性30 s，50℃引物退火30s和72℃延伸2分钟，35个循环；最后一个循环在72℃ 延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。只有鱼腥草取得了435bp，而只有百部还魂生成特定的671bp的条带，可见该方法能够特异性鉴别鱼腥草与百部还魂。因此，这个方法准确且节省时间，可用于许多商业医药产品的测试。这是第一次运用分子技术识别鱼腥草和百部还魂的混淆品及其混合产品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 鉴别鱼腥草与百部还魂的分子特异性标记引物及方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttcttcgt cattgattcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggaagaagc gaatattccg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcctctgctc taccagctga g 21
Claims (3)
1.鉴别鱼腥草与百部还魂的分子特异性标记引物，其特征在于：所述引物为：特异识别的鱼腥草的上游特异性引物HtF：5’- TTTTCTTCGTCATTGATTCC- 3’、特异识别百部还魂的上游特异性引物GcF：5’- AGGAAGAAGCGAATATTCCG- 3’，以及下游通用引物trnL-Fr：5’-TCCTC TGCTCTACCAGCTGAG- 3’。
2.利用权利要求1所述引物鉴别鱼腥草与百部还魂的PCR方法，其特征在于：利用所述引物构建多重PCR体系：总量为20 μL，从植物中提取10 ng的DNA作为扩增模版，加入1μL 1×TransStart TopTaq DNA聚合酶，2μL 10×TransStart TopTaq Buffer，dNTP 2.5mM，0.2μM下游引物trnL-Fr和上游的2个特定的引物HtF、GcF各0.1 μM，其余为无菌水。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：构建多重PCR体系，反应程序如下： 95℃预变性2分钟，95℃ 变性30 s，50℃引物退火30s和72℃ 延伸2分钟，35个循环；最后一个循环在72℃ 延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。
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| 鱼腥草与其易混淆百部还魂的叶形态-脉序图谱的鉴别特征;陆海琳 等;《中药材》;20121130;第35卷(第1期);第1763-1768页，尤其是摘要、第1763页左栏第一段 * |
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