WO2023231532A1 - 一种鉴定忍冬品种的snp位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法 - Google Patents

一种鉴定忍冬品种的snp位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法 Download PDF

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Definitions

  • SEQ ID No.28 ⁇ 29 amplifies SEQ ID No.7;
  • Figure 3 shows the constructed DNA fingerprint library of 39 Lonicera japonica
  • Figure 5 shows the PCA principal component analysis of 39 honeysuckle samples
  • the amplification product obtained in step 1) is subjected to Sanger sequencing to obtain the genotype of the sample to be tested at the SNP site described in the above technical solution, and a DNA fingerprint is drawn. After sequencing is completed, use Chromas software or SeqMan software to open the peak map file (.abl), and use SeqMan software to compare the test sample sequence with the 15snp sequence to obtain the test sample genotype.

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Abstract

本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法，涉及基因工程领域，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示。本发明方法方便快捷，能在较短的时间内鉴别忍冬新品种，且成本低廉；灵敏度高，将Sanger测序法与构建好的39个忍冬DNA指纹库结合，可有效检验出待检样品与现存忍冬品种的基因型差异；特异性好，本发明根据15个高质量SNP位点序列设计15对引物，具有较高的特异性。本发明对于忍冬新品种的鉴别具有较高的参考价值，适于推广应用。

Description

一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法 技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法。
背景技术
忍冬(Lonicera japonica Thunb.)为忍冬科忍冬属多年生半常绿缠绕灌木，原产于中国，主要分布在北半球温带地区，日本、韩国也有少量种植。金银花是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，性甘寒气芳香，清热而不伤胃，可解血毒，自古被誉为清热解毒的良药，在医药、保健品、饮品、化妆品、饲料、香料等方面具有广泛的用途。在此次新冠肺炎防治当中，金银花也发挥了重要作用，市场前景广阔。
我国金银花主要分布于河南密县与封丘、山东平邑和河北巨鹿三个产区。河南金银花种植历史悠久，质量最优，封丘县曾赢得“中原二花甲天下，封丘二花冠中原”的美誉。明代李时珍《本草纲目》中也有“忍冬在处有之，封丘较佳”的字句。2003年3月，封丘金银花荣获国家质检总局颁发的“原产地标记注册证”，在世贸组织成员国内受到知识产权级的保护。随随着市场对金银花需求量日益上涨，如何科学、准确的鉴别银花品种变成了难题。目前，金银花在生产中存在着以下几个问题：(1)金银花种质资源流失严重，种质资源收集保存量少；(2)金银花新品种、良种较少；(3)种植规模不稳定，金银花产量和质量下降。因种植技术落后，管理不规范，病虫害严重以及产业链不健全等问题，导致忍冬种质资源十分混杂，同名异物、同物异名、品种间遗传关系不明确等问题时有发生，这些问题的存在不仅会导致品种间产生知识产权纠纷，还会导致忍冬种质资源的编目与保存、新品种的培育以及忍冬品种的推广与应用变得非常困难。因此，有必要建立一种精准、快速、方便且成本低廉的方法来解决忍冬品种鉴定这一问题。而目前忍冬种质在品种鉴别方面仅限于形态学和化学指纹分析方法，研究大多是使用高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳指纹图谱(CEFP)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)等方法对其指标成分进行分析，利用DNA分子标记技术与DNA指纹图谱构建的研究方法还十分匮乏，不能达到精准、快速、方便区分忍冬新品种的目的。
单核苷酸多态性(Single nuleotide polymorphism,SNP)是以高通量测序技术和DNA芯片技术为核心的分子标记技术，其具有高多态性、高共显性遗传、检测手段高效便捷、成本低廉等优点；聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，便于观察样品特异性。目前尚未有将SNP分子标记技术与PCR技术应用于快速鉴定忍冬新品种。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法，本发明提供的可有效鉴别忍冬品种的15个高质量SNP位点，并根据期特异性设计15条特异性引物，利用聚合酶链式反应(PCR)与一代测序技术，检测忍冬新品种在15个SNP位点上的基因型，根据与已构建好的忍冬DNA指纹图谱库进行比对分析，来区分是否属于忍冬新品种。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示。
本发明提供了一种扩增上述技术方案所述SNP位点组合的引物组合，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～45所示。
优选的，SEQ ID No.16～17扩增SEQ ID No.1；
SEQ ID No.18～19扩增SEQ ID No.2；
SEQ ID No.20～21扩增SEQ ID No.3；
SEQ ID No.22～23扩增SEQ ID No.4；
SEQ ID No.24～25扩增SEQ ID No.5；
SEQ ID No.26～27扩增SEQ ID No.6；
SEQ ID No.28～29扩增SEQ ID No.7；
SEQ ID No.30～31扩增SEQ ID No.8；
SEQ ID No.32～33扩增SEQ ID No.9；
SEQ ID No.34～35扩增SEQ ID No.10；
SEQ ID No.36～37扩增SEQ ID No.11；
SEQ ID No.38～39扩增SEQ ID No.12；
SEQ ID No.40～41扩增SEQ ID No.13；
SEQ ID No.42～43扩增SEQ ID No.14；
SEQ ID No.44～45扩增SEQ ID No.15。
本发明还提供了一种鉴定忍冬品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用上述技术方案所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在上述技术方案所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱；
3)将所述步骤2)得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的体系为：模板DNA 1μl，浓度为10μM上游引物1μl，浓度为10μM下游引物1μl，Dntp(mix)1μl，Taq Buffer 2.5μl，Taq酶0.2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每循环退火温度降0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃修复延伸10min。
优选的，所述步骤3)已构建好的忍冬DNA指纹库使用39个忍冬品种采用常规方法构建得到。
优选的，所述39个忍冬品种为：封花1号、鲁峰王、巨花1号、亚特1号、亚特立本金银花、密县线花、密县野生、密县大毛花、豫金1号、豫金2号、特蕾1号、封金1号、豫金4号、豫金5号、密花3号、密花2号、密花1号、豫金3号、金翠蕾、白云、龙花、龙瑶、华金2号、华金3号、华金6号、豫金6号、豫金5号1-2、九丰1号、野生线花、长针线花、小鸡爪、大鸡爪、细针观花、亚特良种、亚特5号、亚特4号、丰蕾和淡红金银花。
优选的，提取待检样品的幼嫩叶片的DNA。
本发明的有益效果为：
本发明方法方便快捷，能在较短的时间内鉴别忍冬新品种，且成本低廉；灵敏度高，将Sanger测序法与构建好的39个忍冬DNA指纹库结合，可有效检验出待检样品与现存忍冬品种的基因型差异；特异性好，本发明根据15个高质量SNP位点序列设计15对引物，具有较高的特异性。本发明对于忍冬新品种的鉴别具有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为电泳DNA Marker1；
图2为电泳DNA Marker2；
图3为已构建的39个忍冬DNA指纹图谱库；
图4为DNA检测提取图；
图5为39份忍冬样品PCA主成分分析；
图6为39份忍冬样品进化树；
图7为39份忍冬样品遗传群体分析；
图8为验证实验峰图结果，Marker1-15为SNP位点名称；Type为各样品在位点下的基因型；
图9为验证实验品种DNA指纹图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示，具体如下：
SEQ ID No.1：
SEQ ID No.2：
SEQ ID No.3：
SEQ ID No.4：
SEQ ID No.5：
SEQ ID No.6：
SEQ ID No.7：
SEQ ID No.8：
SEQ ID No.9：
SEQ ID No.10：
SEQ ID No.11：
SEQ ID No.12：
SEQ ID No.13：
SEQ ID No.14：
SEQ ID No.15：
本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述SNP位点组合的引物组合，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～45所示，具体如下：
SEQ ID No.16-F：TTGAGATGAACCGAGTTAGGG；
SEQ ID No.17-R：GCAGCCTGACCAAACAGTTC；
SEQ ID No.18-F：ACGGGCACATCAGGAGAC；
SEQ ID No.19-R：AGAATATTTTGATAATCCACACG；
SEQ ID No.20-F：TCATTCCAGGGATCTAAATTGG；
SEQ ID No.21:1-R：GGTGGGATTTGTTAATCATCG；
SEQ ID No.22-F：GCATCAAGGTGTTCATAGAACTG；
SEQ ID No.23-R：CTTCGACACAATCCATGTCAC；
SEQ ID No.2:4-F：TTGGGAGAGGAGGATTTGAG；
SEQ ID No.25-R：TCCCAGCTCTTACGTTGGTC；
SEQ ID No.26-F：TTGTACTTGGGACCTCATTGGAG；
SEQ ID No.27-R：GTCCATAAATCCGAGTCCAGATTC；
SEQ ID No.28-F：AAGAGGAAAACTATGAACATGTCG；
SEQ ID No.29-R：ATAACATTTAGAATTGCCTACTCCC；
SEQ ID No.30-F：AGAGACTACTCAAATAAATGTGGGC；
SEQ ID No.31-R：CTTTACAAGGCGATTATAGTTTTTG；
SEQ ID No.32-F：CTTCTTGGGATGTGTGTAGGG；
SEQ ID No.33-R：AAGAAGTGTTCCTGCACCTTG；
SEQ ID No.34-F：TTTTATTCACCCAATAATAAGCGAG；
SEQ ID No.35-R：AGTCCATCAAAGTAGCTTGCTATTG；
SEQ ID No.36-F：GCAAGATCCCACACTTCTGTC；
SEQ ID No.37-R：CATTTGCACCAGCCATTC；
SEQ ID No.38-F：CCTGCTTACCAACACCTTGC；
SEQ ID No.39-R：TGAGGTTTCCACCTTCCATC；
SEQ ID No.40-F：GGACTGCTTGCTGAATCTCC；
SEQ ID No.41-R：GTGCAAACAAGGGCCAAG；
SEQ ID No.42-F：TTCAATCATCTCCGACAAGAAG；
SEQ ID No.43-R：AAGTGGTATGTGTTGCCTTTAG；
SEQ ID No.44-F：TTCTTGGAATGGCTGTTGTG；
SEQ ID No.45-R：AGAAAACGGAATTGCTCCAG。
在本发明中，SEQ ID No.16～17扩增SEQ ID No.1；SEQ ID No.18～19扩增SEQ ID No.2；SEQ ID No.20～21扩增SEQ ID No.3；SEQ ID No.22～23扩增SEQ ID No.4；SEQ ID No.24～25扩增SEQ ID No.5；SEQ ID No.26～27扩增SEQ ID No.6；SEQ ID No.28～29扩增SEQ ID No.7；SEQ ID No.30～31扩增SEQ ID No.8；
SEQ ID No.32～33扩增SEQ ID No.9；SEQ ID No.34～35扩增SEQ ID No.10；SEQ ID No.36～37扩增SEQ ID No.11；SEQ ID No.38～39扩增SEQ ID No.12；SEQ ID No.40～41扩增SEQ ID No.13；SEQ ID No.42～43扩增SEQ ID No.14；SEQ ID No.44～45扩增SEQ ID No.15。
本发明还提供了一种鉴定忍冬品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用上述技术方案所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在上述技术方案所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱；
3)将所述步骤2)得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
本发明提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用上述技术方案所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物。本发明优选提取待检样品的幼嫩叶片的DNA。本发明对提取DNA的方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规提取植物组织DNA的方法即可。在本发明中，所述PCR扩增的体系优选为：模板DNA 1μl，浓度为10μM上游引物1μl，浓度为10μM下游引物1μl，Dntp(mix)1μl，Taq Buffer 2.5μl，Taq酶0.2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每循环退火温度降0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃修复延伸10min。
本发明将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在上述技术方案所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱。测序完成后，使用Chromas软件或SeqMan软件打开峰图文件(.abl)，利用SeqMan软件将检测样品序列与15snp序列比对，即可获得检测样品基因型。
本发明将得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
本发明对已构建好的忍冬DNA指纹库的构建方法没有特殊限定，采用常规方法构建得到即可，如利用SNP分子标记技术构建，操作方法均为常规。
在本发明具体实施方式中，所述已构建好的忍冬DNA指纹库的构建方法优选包括以下步骤：
(1)DNA提取与文库构建
提取忍冬样品DNA(DNA提取流程与上述方法相同，故不再重复)，使用NanoDrop2000紫外分光光度计测量DNA的质量和浓度，取基因组DNA500ng，加入0.6UEcoRI(NEB)、T4DNA连接酶(NEB)、ATP(NEB)和EcoRI接头(含区分样品的Index序列)在37℃下反应3小时，65℃退火1小时。然后加限制性内切酶NlaIII(NEB)和NlaIII接头在37℃下反应3h。反应结束后在65℃PCR仪中放置30分钟失活内切酶；后使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400-600bp回收酶切产物并使用Qubit3.0(Life Technology)对回收产物进行DNA定量，等量混合24个样品，最后，使用Illumina TruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建。
(2)ddRAD简化测序与数据质控
使用Illumina NovaSeq 6000 PE150对文库构建后的样本进行测序，并使用软件fastp(版本：0.20.0)过滤原始数据中低质量序列，获取Clean Data数据，参数
设置为：-q 5-n 5，主要去除以下reads：①去除未知碱基数量N<5；②去除Reads的50％长度的碱基质量值小于5；③去除接头序列。
(3)参考基因组比对
使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner,0.7.17-r1188)比对参考基因组(参考基因组名称：GWHAAZE00000000.genome.fasta，下载网址：https://ngdc.cncb.ac.cn/search/？dbId＝gwh&q＝SAMC097356)，参数设置为：-M-R。比对生成的sam文件使用samtools(版本：1.9)软件转换为bam格式。然后使用picard MarkDuplicates(版本：2.21.2)进行PCR duplications标记。然后只保留高质量的proper reads进行后续分析。
(4)SNP检测与注释
SNP的检测主要使用GATK(版本：4.1.4.1)软件工具包实现。根据Clean Reads在参考基因组的定位结果，使用GATK进行单核苷酸多态性的检测，并得到最终的SNP位点集，并进行SNP的统计。主要检测过程如下：①对于BWA比对得到的结果，使用Picard(版本：0.7.17-r1188)的Mark Duplicate工具去除重复，屏蔽PCR duplication的影响；②使用GATK进行变异检测(variant calling)，主要包括SNP和InDel；③使用GATK进行变异位点质量值重新校正(VQSR)。
④使用GATK对得到的变异结果进行过滤，选取可靠的变异结果。
(5)群体遗传结构分析
①主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。基于SNP，通过软件GCTA(版本：1.92.1)(http://cnsgenomics.com/software/gcta/#Overview)，得到39份样品的主元成分聚类情况，把具有不同性状特征的个体聚类成不同的亚群，结果如图5所示。
②系统进化树分析(phylogenetic tree)。使用软件FastTree(版本：2.1.9)中的极大似然法(Maximum likelihood，ML)构建进化树，以此描述39份样品之间的进化关系，结果如图6所示。
③群体遗传结构分析(Structure)。使用admixture软件(版本：1.3.0)(http://software.genetics.ucla.edu/admixture/)软件进行群体遗传结构分析。观察39份忍冬样品所包含的祖先的个数以及相似率。结果如图7所示。
(6)DNA指纹图谱构建分析。根据DNA指纹图谱构建的原则：用尽量少的标记鉴别尽量多的品种，以达到简单、高效、经济的目的。根据标记的PIC值大小、分布频率等，筛选出15个检出率高、多态性高、能区分所有品种的的核心标记构建DNA指纹图谱。标记鉴定效率如图3所示。
本发明将纯合基因型C/C,A/A,T/T,G/G分别用黄、绿、蓝、紫四种颜色表示，杂合基因型用灰色表 示，缺失基因型用白色表示，样品编号对应品种见下表1。
表1忍冬品种和编号
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.模板DNA提取
(1)将50～100mg的新鲜植物组织在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中；
(2)加入600μl 65℃预热的Buffer PCB和12μlβ-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀。；
(3)加入600μl的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中，后使用等体积酚:氯仿(1:1，pH8.0)反复混匀，12,000rpm离心5min，取上清，反复抽提1～3次。
(4)加入与上层水相等体积Buffer BD，颠倒混匀3～5次，再加与上层水相等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min。10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
(5)将吸附柱放回收集管中，加入500μl PW Solution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
(6)将吸附柱放回收集管中，加入500μl Wash Solution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液；
(7)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min；
(8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl TE Buffer，静置3min，12,000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续试验。
2.聚合酶链式反应(PCR)
2.1 PCR反应体系
表2 PCR反应体系
引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16-45所示。
2.2 PCR反应条件
表3 PCR反应条件
2.3电泳检测条带
PCR产物取5μl，l1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数：150V，100mA，10～20min电泳观察(见电泳图)DNAMarker有2种，分别见图1和2。
3.Sanger测序
3.1 PCR产物纯化回收
(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重；
(2)根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300-600μl的比例加入BufferB2；
(3)将离心管置于50℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000Xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
(6)向吸附柱中加入300μl BufferB2，9000Xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μl WashSolution，9000Xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
(8)重复步骤7一次；
(9)将空吸附柱和收集管放入离心机，9.000Xq离心1min；
(10)在吸附膜中央加入15-40μl ElutionBuffer，室温静置1-2min，9000Xg离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
3.2数据分析
在result group中寻找结果，并用sequence analysis软件进行分析，利用SeqMan软件将检测样品序列与15snp序列比对，可获得检测样品基因型。
4.结果判断：使用Excel软件，将获得的待检样品在15SNP位点上的基因型绘制DNA指纹图谱，与已构建好的忍冬DNA指纹库(图3)进行比对。待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
实验结果：
选取“亚特立本”、“百农2号”、“魏紫”3个在39个忍冬DNA指纹图谱库之外的忍冬品种，按照上述实验步骤进行验证实验，以检测本方法的真实有效性，实验结果如下：
表4验证实验基因型结果
注：REF为参考基因组基因型；ALT为验证结果；基因型：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T。
表5与39个忍冬DNA指纹库比对结果

根据“表5与39个忍冬DNA指纹库比对结果”可知，“亚特立本”、“百农2号”、“魏紫”与指纹库比对后，与库中现有39个品种的差异位点均>3，属于“差异品种”。
通过验证实验，进一步证明本发明方法可在短时间内获得忍冬品种基因型，鉴别忍冬新品种，且成本低廉、灵敏度高、特异性好，对于忍冬新品种的鉴别具有较高的参考价值，适于推广应用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

  1. 一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合，其特征在于，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示。
  2. 一种扩增权利要求1所述SNP位点组合的引物组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～45所示。
  3. 根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，SEQ ID No.16～17扩增SEQ ID No.1；
    SEQ ID No.18～19扩增SEQ ID No.2；
    SEQ ID No.20～21扩增SEQ ID No.3；
    SEQ ID No.22～23扩增SEQ ID No.4；
    SEQ ID No.24～25扩增SEQ ID No.5；
    SEQ ID No.26～27扩增SEQ ID No.6；
    SEQ ID No.28～29扩增SEQ ID No.7；
    SEQ ID No.30～31扩增SEQ ID No.8；
    SEQ ID No.32～33扩增SEQ ID No.9；
    SEQ ID No.34～35扩增SEQ ID No.10；
    SEQ ID No.36～37扩增SEQ ID No.11；
    SEQ ID No.38～39扩增SEQ ID No.12；
    SEQ ID No.40～41扩增SEQ ID No.13；
    SEQ ID No.42～43扩增SEQ ID No.14；
    SEQ ID No.44～45扩增SEQ ID No.15。
  4. 一种鉴定忍冬品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
    1)提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用权利要求2或3所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
    2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在权利要求1所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱；
    3)将所述步骤2)得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
  5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的体系为：模板DNA 1μl，浓度为10μM上游引物1μl，浓度为10μM下游引物1μl，Dntp(mix)1μl，Taq Buffer 2.5μl，Taq酶0.2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。
  6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每循环退火温度降0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃修复延伸10min。
  7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)已构建好的忍冬DNA指纹库使用39个忍冬品种采用常规方法构建得到。
  8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述39个忍冬品种为：封花1号、鲁峰王、巨花1号、亚特1号、亚特立本金银花、密县线花、密县野生、密县大毛花、豫金1号、豫金2号、特蕾1号、封金1号、豫金4号、豫金5号、密花3号、密花2号、密花1号、豫金3号、金翠蕾、白云、龙花、龙瑶、华金2号、华金3号、华金6号、豫金6号、豫金5号1-2、九丰1号、野生线花、长针线花、小鸡爪、大鸡爪、细针观花、亚特良种、亚特5号、亚特4号、丰蕾和淡红金银花。
  9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，提取待检样品的幼嫩叶片的DNA。
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