CN116064921A - 一种鉴定忍冬品种的snp位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法 - Google Patents

一种鉴定忍冬品种的snp位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法，涉及基因工程领域，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示。本发明方法方便快捷，能在较短的时间内鉴别忍冬新品种，且成本低廉；灵敏度高，将Sanger测序法与构建好的39个忍冬DNA指纹库结合，可有效检验出待检样品与现存忍冬品种的基因型差异；特异性好，本发明根据15个高质量SNP位点序列设计15对引物，具有较高的特异性。本发明对于忍冬新品种的鉴别具有较高的参考价值，适于推广应用。

Description

一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法。
背景技术
忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)为忍冬科忍冬属多年生半常绿缠绕灌木，原产于中国，主要分布在北半球温带地区，日本、韩国也有少量种植。金银花是忍冬科植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，性甘寒气芳香，清热而不伤胃，可解血毒，自古被誉为清热解毒的良药，在医药、保健品、饮品、化妆品、饲料、香料等方面具有广泛的用途。在此次新冠肺炎防治当中，金银花也发挥了重要作用，市场前景广阔。
我国金银花主要分布于河南密县与封丘、山东平邑和河北巨鹿三个产区。河南金银花种植历史悠久，质量最优，封丘县曾赢得“中原二花甲天下，封丘二花冠中原”的美誉。明代李时珍《本草纲目》中也有“忍冬在处有之，封丘较佳”的字句。2003年3月，封丘金银花荣获国家质检总局颁发的“原产地标记注册证”，在世贸组织成员国内受到知识产权级的保护。随随着市场对金银花需求量日益上涨，如何科学、准确的鉴别银花品种变成了难题。目前，金银花在生产中存在着以下几个问题：(1)金银花种质资源流失严重，种质资源收集保存量少；(2)金银花新品种、良种较少；(3)种植规模不稳定，金银花产量和质量下降。因种植技术落后，管理不规范，病虫害严重以及产业链不健全等问题，导致忍冬种质资源十分混杂，同名异物、同物异名、品种间遗传关系不明确等问题时有发生，这些问题的存在不仅会导致品种间产生知识产权纠纷，还会导致忍冬种质资源的编目与保存、新品种的培育以及忍冬品种的推广与应用变得非常困难。因此，有必要建立一种精准、快速、方便且成本低廉的方法来解决忍冬品种鉴定这一问题。而目前忍冬种质在品种鉴别方面仅限于形态学和化学指纹分析方法，研究大多是使用高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳指纹图谱(CEFP)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)等方法对其指标成分进行分析，利用DNA分子标记技术与DNA指纹图谱构建的研究方法还十分匮乏，不能达到精准、快速、方便区分忍冬新品种的目的。
单核苷酸多态性(Single nuleotide polymorphism,SNP)是以高通量测序技术和DNA芯片技术为核心的分子标记技术，其具有高多态性、高共显性遗传、检测手段高效便捷、成本低廉等优点；聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，便于观察样品特异性。目前尚未有将SNP分子标记技术与PCR技术应用于快速鉴定忍冬新品种。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合、引物组合和鉴定忍冬品种的方法，本发明提供的可有效鉴别忍冬品种的15个高质量SNP位点，并根据期特异性设计15条特异性引物，利用聚合酶链式反应(PCR)与一代测序技术，检测忍冬新品种在15个SNP位点上的基因型，根据与已构建好的忍冬DNA指纹图谱库进行比对分析，来区分是否属于忍冬新品种。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示。
本发明提供了一种扩增上述技术方案所述SNP位点组合的引物组合，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～45所示。
优选的，SEQ ID No.16～17扩增SEQ ID No.1；
SEQ ID No.18～19扩增SEQ ID No.2；
SEQ ID No.20～21扩增SEQ ID No.3；
SEQ ID No.22～23扩增SEQ ID No.4；
SEQ ID No.24～25扩增SEQ ID No.5；
SEQ ID No.26～27扩增SEQ ID No.6；
SEQ ID No.28～29扩增SEQ ID No.7；
SEQ ID No.30～31扩增SEQ ID No.8；
SEQ ID No.32～33扩增SEQ ID No.9；
SEQ ID No.34～35扩增SEQ ID No.10；
SEQ ID No.36～37扩增SEQ ID No.11；
SEQ ID No.38～39扩增SEQ ID No.12；
SEQ ID No.40～41扩增SEQ ID No.13；
SEQ ID No.42～43扩增SEQ ID No.14；
SEQ ID No.44～45扩增SEQ ID No.15。
本发明还提供了一种鉴定忍冬品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用上述技术方案所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在上述技术方案所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱；
3)将所述步骤2)得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的体系为：模板DNA 1μl，浓度为10μM上游引物1μl，浓度为10μM下游引物1μl，Dntp(mix)1μl，Taq Buffer 2.5μl，Taq酶0.2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每循环退火温度降0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃修复延伸10min。
优选的，所述步骤3)已构建好的忍冬DNA指纹库使用39个忍冬品种采用常规方法构建得到。
优选的，所述39个忍冬品种为：封花1号、鲁峰王、巨花1号、亚特1号、亚特立本金银花、密县线花、密县野生、密县大毛花、豫金1号、豫金2号、特蕾1号、封金1号、豫金4号、豫金5号、密花3号、密花2号、密花1号、豫金3号、金翠蕾、白云、龙花、龙瑶、华金2号、华金3号、华金6号、豫金6号、豫金5号1-2、九丰1号、野生线花、长针线花、小鸡爪、大鸡爪、细针观花、亚特良种、亚特5号、亚特4号、丰蕾和淡红金银花。
优选的，提取待检样品的幼嫩叶片的DNA。
本发明的有益效果为：
本发明方法方便快捷，能在较短的时间内鉴别忍冬新品种，且成本低廉；灵敏度高，将Sanger测序法与构建好的39个忍冬DNA指纹库结合，可有效检验出待检样品与现存忍冬品种的基因型差异；特异性好，本发明根据15个高质量SNP位点序列设计15对引物，具有较高的特异性。本发明对于忍冬新品种的鉴别具有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为电泳DNAMarker1；
图2为电泳DNAMarker2；
图3为已构建的39个忍冬DNA指纹图谱库；
图4为DNA检测提取图；
图5为39份忍冬样品PCA主成分分析；
图6为39份忍冬样品进化树；
图7为39份忍冬样品遗传群体分析；
图8为验证实验峰图结果，Marker1-15为SNP位点名称；Type为各样品在位点下的基因型；
图9为验证实验品种DNA指纹图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示，具体如下：
SEQ ID No.1：
CCGAATTGATGGCCAAGGGTGCCGTTGTTGAGATGAACCGAGTTAGGGAGGAGCATGCATTGACCATAGTTTAGTTAAAGGAAATGCATGCCTCCGAAATTTCCCAATTGGGTTCTCGGCATGAATCTGCTTTAATCGACGAGATGAACTATGGTTACAATGAGGCTTTGAGCGACTATGCGTCTGAAATGTCCAAGCTCAAGGATCTCATCTACCAAGGCGGTACAAATTCGGCCTTGAACGTGTTGGTCTCCCACTCGATCATGAACTGTTTGGTCAGGCTGCGCTATGCCCTCATGAT；
SEQ ID No.2：
ACGGGCACATCAGGAGACATATAATAGCCCTCCACAATACTAACAACATGACGTTCCTCATTCTATCATTTCTCAGCCCTCGTAGAACATTCTTAATTAGGGCTCGTTTAGTTCGAGTTTTGGGAATGGAATGGGCATCCTAAATTCCTGGAAACCTTTTATCATAGCATCTAGGTTGCCTTACTAATGTTTGGTTTAGACATGAATTCTTCTTTCCTAAAACGTTAAATTACCTTTCTATATTTAGTTCAATCAAAAATATGAATAAAATACGTGTGGATTATCAAAATATTCTTCATTT；
SEQ ID No.3：
GATCTAAATTGGTATACTCACAATAAAATTCTCTAATAATTTATGTTGAAAGGTTGAATCATAAATTCATGGGGTTGAAATTTTTATATAAAATTACCATTTCGGGTTCCAAGAATGAACAAAAACTCGAACCAAACAAGCATTATGACTGCGTTTGATGTGTGTATGATAAAAGAATTCCATGTCTGGTGTTCGTCAGGATTGGACATCAGGGTGAATTATTTATCCCACTAAAGCTTCCTATCCCACTGAGCGATGATTAACAAATCCCACCTAAGAGGTAAGATTGTTTTATCCTGTT；
SEQ ID No.4：
CTTGCGTAGTCTTAACTCAATATTTGTGGTTTAGTTTGTCTTCTACATTGTTAATGTACAGCATCAAGGTGTTCATAGAACTGTATTTGACACCATTTTATGCCCGAGATACTATCACAGAACCTTACGTATAACCCTGATTGAGAGAGCAAGTGGGCTAGCCTAGTTGGCAAGGCACCCACACGAATTCAAGAGTAGTCCTGAGTTCGAGTCTCATTTGTAGTGGGGGATTTTCTTTATTATTGTACTATTGAAGTAAAGGGAAGAGACGACCTTCCATTTTTATTTTATTTTTTAAAAA；
SEQ ID No.5：
AGGATTTGAGGAGCTGGCTGCATCAGAATTCATGATGAGAGGGGTAATCTCGGTAATTGGGTAAACACAAAGAAGACTGTGTGAGAAGTGTGGGAGAGGTTCATTGAATTTAAAGGGTTTACAAAAGGGTTCAGCTTCTTAAATAGCGATATGGGAAACTTGCTGCTGGGAGACTTGTTGGTGTTGTCTAGAGAAGAAATCTGCAATGACATTATCCTTTCCTTTAACATGCTTGACTTCATAATCCCATTATGAAAACCATTCTGACCAACGTAAGAGCTGGGAATTCGGGATTTGTTTA；
SEQ ID No.6：
GGGACATATTGTATGAAATGAAAAATGTTCTTGTTTTACTAGAACATGGGTTTTAAGTCTTTCACATGAATTATGTTTTATTAACCCGCCGTCAGCAAATGGCACCCGAGATTAACCGGGTCCCTGAGGATAGTTTCTCTTGACGGGATTCAGGGCATCACAGGATAACATTGAAATCTTTGTTGAACGAATTTTAAAATGAGCTATGATAGTAGCTCGGAAGACTATACATGATAGAGCATTTGTAGTGATATGAGCATAGTAGTCCTTCAATGCACGTTCTTCCTCATTTTTGGATGT；
SEQ ID No.7：
TGTTCAAAATACATTAATGTATAAAAGCTAACGTGTAAATTGTATAAGAGGAAAACTATGAACATGTCGTGTAACGACCTTAATGTTGTGGACAGATGTGCCCTGGTGCATGTGGTTCCAATAGATGCTAGCAGGCTATACACTATAGGTGTGTTCGGCAACCCCAATTCTATGCCATAGAATTGGAATTGGGGTATAATTTTAAAATTTCATTGTTTGGATGAACTAATTGATCATAGTTTTGGAATTCTAAAACCATCAATTCTATAAGATTGAATTCTATAAGGGGAGTAGGCAATTC；
SEQ ID No.8：
AAATTATTGGGCTAATTTTTAGTGGTATAATTAATTTTTAGTTAATCCTAGAGACTACTCAAATAAATGTGGGCCAAATGTGTAGATTCTTTATCTGGGCTTGCCAGGGTTTTATGGAAACCCTAACTAGATCCGTGCTGTTATTGTGATCGATTCTCATATTTCGCATTTATTTATCATAGATCCAGGTACGTGGTTTTATCGTGTTTAAATTAGAGAAAATCTATGTTTCTACTCATGTTATAACTTATTTATTAGGACCCAAAAACTATAATCGCCTTGTAAAGTATTTTAGGCGCGT；
SEQ ID No.9：
CTAAAGAGAATGAGGTTGGTCTATTTAAATTTATTTGGCATCAATGTGTTCTTCTTAAATGGTCATTTTTGGTGTGGAGGGCTTTACAACATAGTCTTCCCATTGATGATTGCTTAATCCGTAAAGATTTTTAAATGGCTTCTAAATGTAATTGTTGTGTGGAGGCTAGAGTTGAAACTATTTCTCATGTCTTTGTTACTAGTGATATTGCTCGGAATGTGTGGTCTTTTTTTGAGGACTTGTGCAACATTCAAGGTGCAGGAACACTTCTTCAGAGTAAAATGAATACTTGGTGGATTCA；
SEQ ID No.10：
ATGGTTTTTTTTTATGCTATTTGCACACAATTTTTTACTTGGTTTTACTCAACTTTTTATTCACCCAATAATAAGCGAGTAAGTGCATGTTATTCGTCCAATGATAAACAAATAAAAGCTTGAAAATGCCTTATTTGCTTGTCATTAGGCGAGTAACATGCACTTACTCACCCGATGAAGAGGCACCAGGCCCGGGCAAACAACTGCCACTTGTGAAGGCTCCGGTACCAATAGCAAGCTACTTTGATGGACTTTTTTTGAAACATTAACCCGGTCTTGCCCTTTGATAGTCACATTATTT；
SEQ ID No.11：
CAGAGTCAATCTCACGTTCTTGAGGAGCATGTAGAACAATTGTGGTGGAACCCACAACACACAGAGCACAGCCAAGAACTCCAAAAAGATGTAGCTTCTCTCTCAATATAATATGTGCAAGTACAGCACTGCAATACAGATACAGTACAAGTCATTGATGTAGTCAAGACCGTAGAATTCAGCATGAATAAAGAGTTTTGACTTTCTATCATACCTGATAATAATGCTGAGTGCACCAAGAGGAGTGACAAGAATGGCTGGTGCAAATGCATAGGCAGCAAAATTAGCAATTTCTCCAACA；SEQ ID No.12：
CACCTTGCTCTAAAGTTTGCTCTCCATGTTCTAAGTCAACTTTTCCTTGGTGTTGATCTCTAATTCCCTGCAAATAAGACACAACAAATATAGGCAAAACAGGATTAAGATTGTTAGAACCTTGGAATTCGTCGAAACATACTTTGACCCGTAGTCTATAAACATACTATCTCGGATTGTCTTTCCTAGCCAAGCTAATGGAACTTTGACTCGTAGTCTATAAACATACTAGAACCTTGGAATTCATCGAAAAAGATGGAAGGTGGAAACCTCAACCCAACGCTTAAAAGATCATGAACCT；
SEQ ID No.13：
TGAATCTCCACCATCAATGAGCATTACCGGTGAGTCTAGTAACCGCAAATTTGACCCACATCATCTTGGGAGTTCTTATAACTTCTAGTCGTTCTTTAATTACGAAGAGCTAACCCTCTGCATCCTTGGGTCCCTTTGTTCCATCAAACACTGGAGGCTGAAAACGAGTGAATTCTCGCAGGTAAGTGATTTCATTAGTCTCCCCTCCTGCGGTTCTTGATCCTCCTCCGAATTTTCCAAAATTGCAGGGTCCTCTTGGGCTTGGCCCTTGTTTGCACCCGCTCCATTAGTAGACCTGTGA；
SEQ ID No.14：
ATTCAATCATCTCCGACAAGAAGATATCAATACAGTAATGAAGTCCTCATAAATTGTCATAAGAAATAAGAATTCTTGAAGCATCCAGATACTCTGCCATAAGCATAAGTTATAGATAAAGAGATATAAGCTCCTCGTGAGACAACATCCAAGCCATATGCTATAAGAAAACTCTAGGTGTTGCCAAGATATCATCCGATAGCTGGTTGACACAATTATAATGCACACACTGCAATTCTTACTCTTTATGATAACTAAAGGCAACACATACCACTTAAACTTCACTCATCATACATCTAAG；
SEQ ID No.15：
TCTTGGAATGGCTGTTGTGACTATTTTGTTTGCAGCTCTTGGATTTATGTCCCCAGCTTCTCGTGGAACCCTGATTACAGGTATGCTATTTTCCTACATGATTCTTGGAATTGCAGCCGGTTATGTTGCGGTTCGATTATGGAGAACAATGTGCTGTGGTGATCACAAAGGCTGGGTCTCAGTTTCTTGGAAGGCCGCTTGTTTCTTCCCCGGTATCGCCTTTTTTATTCTAACCACTTTGAATTTCCTTTTGTGGGGTAGTCGTAGTACTGGAGCAATTCCGTTTTCTCTGTTCGTAGTC。
本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述SNP位点组合的引物组合，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～45所示，具体如下：
SEQ ID No.16-F：TTGAGATGAACCGAGTTAGGG；
SEQ ID No.17-R：GCAGCCTGACCAAACAGTTC；
SEQ ID No.18-F：ACGGGCACATCAGGAGAC；
SEQ ID No.19-R：AGAATATTTTGATAATCCACACG；
SEQ ID No.20-F：TCATTCCAGGGATCTAAATTGG；
SEQ ID No.21:1-R：GGTGGGATTTGTTAATCATCG；
SEQ ID No.22-F：GCATCAAGGTGTTCATAGAACTG；
SEQ ID No.23-R：CTTCGACACAATCCATGTCAC；
SEQ ID No.2:4-F：TTGGGAGAGGAGGATTTGAG；
SEQ ID No.25-R：TCCCAGCTCTTACGTTGGTC；
SEQ ID No.26-F：TTGTACTTGGGACCTCATTGGAG；
SEQ ID No.27-R：GTCCATAAATCCGAGTCCAGATTC；
SEQ ID No.28-F：AAGAGGAAAACTATGAACATGTCG；
SEQ ID No.29-R：ATAACATTTAGAATTGCCTACTCCC；
SEQ ID No.30-F：AGAGACTACTCAAATAAATGTGGGC；
SEQ ID No.31-R：CTTTACAAGGCGATTATAGTTTTTG；
SEQ ID No.32-F：CTTCTTGGGATGTGTGTAGGG；
SEQ ID No.33-R：AAGAAGTGTTCCTGCACCTTG；
SEQ ID No.34-F：TTTTATTCACCCAATAATAAGCGAG；
SEQ ID No.35-R：AGTCCATCAAAGTAGCTTGCTATTG；
SEQ ID No.36-F：GCAAGATCCCACACTTCTGTC；
SEQ ID No.37-R：CATTTGCACCAGCCATTC；
SEQ ID No.38-F：CCTGCTTACCAACACCTTGC；
SEQ ID No.39-R：TGAGGTTTCCACCTTCCATC；
SEQ ID No.40-F：GGACTGCTTGCTGAATCTCC；
SEQ ID No.41-R：GTGCAAACAAGGGCCAAG；
SEQ ID No.42-F：TTCAATCATCTCCGACAAGAAG；
SEQ ID No.43-R：AAGTGGTATGTGTTGCCTTTAG；
SEQ ID No.44-F：TTCTTGGAATGGCTGTTGTG；
SEQ ID No.45-R：AGAAAACGGAATTGCTCCAG。
在本发明中，SEQ ID No.16～17扩增SEQ ID No.1；SEQ ID No.18～19扩增SEQ IDNo.2；SEQ ID No.20～21扩增SEQ ID No.3；SEQ ID No.22～23扩增SEQ ID No.4；SEQ IDNo.24～25扩增SEQ ID No.5；SEQ ID No.26～27扩增SEQ IDNo.6；SEQ ID No.28～29扩增SEQ ID No.7；SEQ ID No.30～31扩增SEQ ID No.8；SEQ ID No.32～33扩增SEQ ID No.9；SEQ ID No.34～35扩增SEQ ID No.10；SEQ ID No.36～37扩增SEQ ID No.11；SEQ IDNo.38～39扩增SEQ ID No.12；SEQ IDNo.40～41扩增SEQ ID No.13；SEQ ID No.42～43扩增SEQ ID No.14；SEQ IDNo.44～45扩增SEQ ID No.15。
本发明还提供了一种鉴定忍冬品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用上述技术方案所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在上述技术方案所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱；
3)将所述步骤2)得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
本发明提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用上述技术方案所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物。本发明优选提取待检样品的幼嫩叶片的DNA。本发明对提取DNA的方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规提取植物组织DNA的方法即可。在本发明中，所述PCR扩增的体系优选为：模板DNA 1μl，浓度为10μM上游引物1μl，浓度为10μM下游引物1μl，Dntp(mix)1μl，Taq Buffer 2.5μl，Taq酶0.2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每循环退火温度降0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃修复延伸10min。
本发明将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在上述技术方案所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱。测序完成后，使用Chromas软件或SeqMan软件打开峰图文件(.abl)，利用SeqMan软件将检测样品序列与15snp序列比对，即可获得检测样品基因型。
本发明将得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
本发明对已构建好的忍冬DNA指纹库的构建方法没有特殊限定，采用常规方法构建得到即可，如利用SNP分子标记技术构建，操作方法均为常规。
在本发明具体实施方式中，所述已构建好的忍冬DNA指纹库的构建方法优选包括以下步骤：
(1)DNA提取与文库构建
提取忍冬样品DNA(DNA提取流程与上述方法相同，故不再重复)，使用NanoDrop2000紫外分光光度计测量DNA的质量和浓度，取基因组DNA500 ng，加入0.6UEcoRI(NEB)、T4 DNA连接酶(NEB)、ATP(NEB)和EcoRI接头(含区分样品的Index序列)在37℃下反应3小时，65℃退火1小时。然后加限制性内切酶NlaIII(NEB)和NlaIII接头在37℃下反应3h。反应结束后在65℃PCR仪中放置30分钟失活内切酶；后使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400-600bp回收酶切产物并使用Qubit3.0(Life Technology)对回收产物进行DNA定量，等量混合24个样品，最后，使用Illumina TruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建。
(2)ddRAD简化测序与数据质控
使用Illumina NovaSeq 6000PE150对文库构建后的样本进行测序，并使用软件fastp(版本：0.20.0)过滤原始数据中低质量序列，获取Clean Data数据，参数
设置为：-q 5-n 5，主要去除以下reads：①去除未知碱基数量N<5；②去除Reads的50％长度的碱基质量值小于5；③去除接头序列。
(3)参考基因组比对
使用BWA(Burrows-WheelerAligner,0.7.17-r1188)比对参考基因组(参考基因组名称：GWHAAZE00000000.genome.fasta，下载网址：https://ngdc.cncb.ac.cn/search/？dbId＝gwh&q＝SAMC097356)，参数设置为：-M-R。比对生成的sam文件使用samtools(版本：1.9)软件转换为bam格式。然后使用picard MarkDuplicates(版本：2.21.2)进行PCRduplications标记。然后只保留高质量的properreads进行后续分析。
(4)SNP检测与注释
SNP的检测主要使用GATK(版本：4.1.4.1)软件工具包实现。根据Clean Reads在参考基因组的定位结果，使用GATK进行单核苷酸多态性的检测，并得到最终的SNP位点集，并进行SNP的统计。主要检测过程如下：①对于BWA比对得到的结果，使用Picard(版本：0.7.17-r1188)的MarkDuplicate工具去除重复，屏蔽PCR duplication的影响；②使用GATK进行变异检测(variant calling)，主要包括SNP和InDel；③使用GATK进行变异位点质量值重新校正(VQSR)。
④使用GATK对得到的变异结果进行过滤，选取可靠的变异结果。
(5)群体遗传结构分析
①主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)。基于SNP，通过软件GCTA(版本：1.92.1)(http://cnsgenomics.com/software/gcta/#Overview)，得到39份样品的主元成分聚类情况，把具有不同性状特征的个体聚类成不同的亚群，结果如图5所示。
②系统进化树分析(phylogenetic tree)。使用软件FastTree(版本：2.1.9)中的极大似然法(Maximumlikelihood，ML)构建进化树，以此描述39份样品之间的进化关系，结果如图6所示。
③群体遗传结构分析(Structure)。使用admixture软件(版本：1.3.0)(http://software.genetics.ucla.edu/admixture/)软件进行群体遗传结构分析。观察39份忍冬样品所包含的祖先的个数以及相似率。结果如图7所示。
(6)DNA指纹图谱构建分析。根据DNA指纹图谱构建的原则：用尽量少的标记鉴别尽量多的品种，以达到简单、高效、经济的目的。根据标记的PIC值大小、分布频率等，筛选出15个检出率高、多态性高、能区分所有品种的的核心标记构建DNA指纹图谱。标记鉴定效率如图3所示。
本发明将纯合基因型C/C,A/A,T/T,G/G分别用黄、绿、蓝、紫四种颜色表示，杂合基因型用灰色表示，缺失基因型用白色表示，样品编号对应品种见下表1。
表1忍冬品种和编号
Figure BDA0004012143900000111
Figure BDA0004012143900000121
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.模板DNA提取
(1)将50～100mg的新鲜植物组织在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中；
(2)加入600μl 65℃预热的BufferPCB和12μlβ-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀。；
(3)加入600μl的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中，后使用等体积酚:氯仿(1:1，pH8.0)反复混匀，12,000rpm离心5min，取上清，反复抽提1～3次。
(4)加入与上层水相等体积Buffer BD，颠倒混匀3～5次，再加与上层水相等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min。10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
(5)将吸附柱放回收集管中，加入500μl PW Solution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
(6)将吸附柱放回收集管中，加入500μl Wash Solution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液；
(7)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min；
(8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl TEBuffer，静置3min，12,000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续试验。
2.聚合酶链式反应(PCR)
2.1PCR反应体系
表2 PCR反应体系
组分 浓度 体积(μl)
模板DNA 1
引物F 10μM 1
引物R 10μM 1
Dntp(mix) 10mM 1
Taq Buffer(with MgCl2) 10X 2.5
Taq酶 5U/μl 0.2
<![CDATA[add ddH<sub>2</sub>O to]]> 25
引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16-45所示。
2.2 PCR反应条件
表3 PCR反应条件
序号 程序 温度 时间
1 预变性 95℃ 5min
2 变性 94℃ 30sec
3 退火 63℃(每循环降0.5℃) 30sec
4 延伸 72℃ 30sec
5 循环2to4 10cycles
6 变性 95℃ 30sec
7 退火 58℃ 30sec
8 延伸 72℃ 30sec
9 循环6to8 30cycles
10 修复延伸 72℃ 10min
11 保温 4℃  
2.3电泳检测条带
PCR产物取5μl，l1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数：150V，100mA，10～20min电泳观察(见电泳图)DNA Marker有2种，分别见图1和2。
3.Sanger测序
3.1PCR产物纯化回收
(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重；
(2)根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300-600μl的比例加入BufferB2；
(3)将离心管置于50℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000Xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
(6)向吸附柱中加入300μl BufferB2，9000Xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μl WashSolution，9000Xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
(8)重复步骤7一次；
(9)将空吸附柱和收集管放入离心机，9.000Xq离心1min；
(10)在吸附膜中央加入15-40μl ElutionBuffer，室温静置1-2min，9000Xg离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
3.2数据分析
在result group中寻找结果，并用sequence analysis软件进行分析，利用SeqMan软件将检测样品序列与15snp序列比对，可获得检测样品基因型。
4.结果判断：使用Excel软件，将获得的待检样品在15SNP位点上的基因型绘制DNA指纹图谱，与已构建好的忍冬DNA指纹库(图3)进行比对。待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
实验结果：
选取“亚特立本”、“百农2号”、“魏紫”3个在39个忍冬DNA指纹图谱库之外的忍冬品种，按照上述实验步骤进行验证实验，以检测本方法的真实有效性，实验结果如下：
表4验证实验基因型结果
Figure BDA0004012143900000141
Figure BDA0004012143900000151
注：REF为参考基因组基因型；ALT为验证结果；基因型：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T。
表5与39个忍冬DNA指纹库比对结果
Figure BDA0004012143900000152
Figure BDA0004012143900000161
根据“表5与39个忍冬DNA指纹库比对结果”可知，“亚特立本”、“百农2号”、“魏紫”与指纹库比对后，与库中现有39个品种的差异位点均>3，属于“差异品种”。
通过验证实验，进一步证明本发明方法可在短时间内获得忍冬品种基因型，鉴别忍冬新品种，且成本低廉、灵敏度高、特异性好，对于忍冬新品种的鉴别具有较高的参考价值，适于推广应用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种鉴定忍冬品种的SNP位点组合，其特征在于，所述SNP位点前后150bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1～15所示。
2.一种扩增权利要求1所述SNP位点组合的引物组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～45所示。
3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，SEQ ID No.16～17扩增SEQ ID No.1；
SEQ ID No.18～19扩增SEQ ID No.2；
SEQ ID No.20～21扩增SEQ ID No.3；
SEQ ID No.22～23扩增SEQ ID No.4；
SEQ ID No.24～25扩增SEQ ID No.5；
SEQ ID No.26～27扩增SEQ ID No.6；
SEQ ID No.28～29扩增SEQ ID No.7；
SEQ ID No.30～31扩增SEQ ID No.8；
SEQ ID No.32～33扩增SEQ ID No.9；
SEQ ID No.34～35扩增SEQ ID No.10；
SEQ ID No.36～37扩增SEQ ID No.11；
SEQ ID No.38～39扩增SEQ ID No.12；
SEQ ID No.40～41扩增SEQ ID No.13；
SEQ ID No.42～43扩增SEQ ID No.14；
SEQ ID No.44～45扩增SEQ ID No.15。
4.一种鉴定忍冬品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待检样品的DNA，以所述DNA为模板，使用权利要求2或3所述的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到待检样品在权利要求1所述SNP位点上的基因型，绘制DNA指纹图谱；
3)将所述步骤2)得到的DNA指纹图谱与已构建好的忍冬DNA指纹库进行比对，当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点＝0时，为“相同品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≤2时，为“近似品种”；当待检样品与忍冬DNA指纹库中差异位点≥3时，为“差异品种”。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的体系为：模板DNA1μl，浓度为10μM上游引物1μl，浓度为10μM下游引物1μl，Dntp(mix)1μl，TaqBuffer2.5μl，Taq酶0.2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每循环退火温度降0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃修复延伸10min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)已构建好的忍冬DNA指纹库使用39个忍冬品种采用常规方法构建得到。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述39个忍冬品种为：封花1号、鲁峰王、巨花1号、亚特1号、亚特立本金银花、密县线花、密县野生、密县大毛花、豫金1号、豫金2号、特蕾1号、封金1号、豫金4号、豫金5号、密花3号、密花2号、密花1号、豫金3号、金翠蕾、白云、龙花、龙瑶、华金2号、华金3号、华金6号、豫金6号、豫金5号1-2、九丰1号、野生线花、长针线花、小鸡爪、大鸡爪、细针观花、亚特良种、亚特5号、亚特4号、丰蕾和淡红金银花。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，提取待检样品的幼嫩叶片的DNA。
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