CN112029891A

CN112029891A - 一种快速鉴定伊犁贝母的特异性核酸探针、方法及用途

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Publication number: CN112029891A
Application number: CN202010945627.XA
Authority: CN
Inventors: 周嘉裕; 廖海; 王微微; 李冉郡; 张田; 邹萌; 罗定
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2020-09-10
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明提供一种快速鉴定伊犁贝母的特异性核酸探针、方法及用途，属中药材来源品种鉴定技术领域。本发明首次发现以该Taqman探针为核心的Taqman荧光定量PCR方法能够特异性鉴定伊犁贝母，仅有伊犁贝母显示阳性结果，其它贝母品种显示为阴性结果。可用于伊犁贝母基原植物、药材与药材饮片的特异性分子鉴定。本发明具有以下优点：①特异性好，仅有伊犁贝母在Taqman荧光定量PCR中显示出阳性扩增典线；②灵敏度高，Taqman荧光定量PCR的最低检测浓度(DNA)为0.01925ng/μL；③步骤少、检测周期短：操作时间仅需2‑3小时；④重现性好：已经进行了10次以上的生物学重复，重现性达到100％。

Description

一种快速鉴定伊犁贝母的特异性核酸探针、方法及用途

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定伊犁贝母的特异性 Tagmen探针、方法及用途。

背景技术

以植物、动物来源的中药材在生物学上物种的确定，称之为基原。如果中药材标准来源项下收载有两个及以上基原的情况称之为多基原中药材。尽管多基原缓解了中药材的市场空缺，然而多基原的混合使用严重影响中药临床疗效的有效性、安全性与质量可控性。为此，国家食品药品监督管理总局于2016年颁布《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》规定：“对栽培、养殖或野生采集的药用动植物，应准确鉴定其物种，包括亚种、变种或品种，不同种的中药材不可相互混用”。

贝母是典型的多基原药材，极易混淆与掺杂。伊犁贝母(Fritillariapallidiflora Schrenk)为百合科(Liliaceae)贝母属Fritillaria L.植物，主要分布于新疆伊犁河流域，栽培量大、面积广。2020年版《中国药典》与《维吾尔药志》收载的中药与维药“伊贝母”的基原包括伊犁贝母与新疆贝母(Fritillaria walujewii Regel)，其中伊犁贝母为“伊贝母”的主流品种，其鳞茎入药，味苦、甘，性微凉，归肺、心经，含有较高含量的贝母类生物碱，在临床上是用于治疗呼吸系统疾病的良药。

除“伊贝母”外，2020年版《中国药典》还收载川贝母、浙贝母(Fritillariathunbergii)、平贝母(Fritillaria ussuriensis)与湖北贝母等品种。其中，川贝母含有6种基原(包括卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa)、暗紫贝母(F.unibracteata P.K.Hsiao &K.C.Hsia)、甘肃贝母(F.przewalskii)、梭砂贝母(F.delavayi)、太白贝母(F.taipaiensis P.Y.Li)或瓦布贝母(F.unibracteata Hsiaoet K.C.Hsia var.wabuensis)。由于基原较多，一旦发生不同品种或不同基原贝母混用，会严重影响临床疗效与安全性，极大地危害消费者及病患者利益，因此急需建立适合于不同基原贝母的准确、高效鉴定方法。目前， 2020版《中国药典》中“川贝母”项下以有PCR-RFLP分子鉴定方法，但缺少对伊贝母的分子鉴定方法。基于此目的，本发明拟建立一种能够准确鉴定伊犁贝母的分子生物学方法。

伊犁贝母的鉴定目前主要依赖于传统的性状鉴定方法，此法主要从样品的鳞茎色泽、脐点形状、鳞叶数量、抱合紧密度、顶端开合、长短以及气味等特征进行观察比较，需要丰富的鉴定经验，且栽培品形态标准性较差。再加上人为干预栽培导致不同贝母的相似度不断上升，鉴别难度不断增加，一般需要结合其他分析鉴定技术进行鉴别。化学方法如高效液相色谱以及液质联用技术，耗费材料多，且需要大型仪器支持，推广难度大。此外，DNA条形码技术作为近年来生物分类和鉴定的研究热点，其标准操作流程包含DNA提取、PCR扩增、电泳、核酸测序、数据分析及结果判定等，缺点是步骤多，耗时长(2天)，未能实现对待检样品的“即时与定量”监测，因此，仍需开发更加便捷、快速的检测方法以满足药材市场监控需求。公开号为CN1487092A的专利，使用PCR-RFLP与PCR方法用于鉴定伊贝母 (Fritillariapallidiflora Schrenk)，但PCR-RFLP方法存在周期长，开管操作易污染等缺点；常规PCR方法存在检测灵敏度不高、无法实现精确定量检测的缺陷。

发明内容

发明人基于不同基原贝母的ITS1序列信息，通过分析比对，发现伊犁贝母ITS1中含有一段伊犁贝母特征异性的DNA序列。发明人据此设计特异Taqman探针及相应的Taqman荧光PCR检测技术，能够快速准确区分伊犁贝母与其它种类贝母，至少有以下三个方面的应用：①伊犁贝母基原植物的鉴定；②药材的鉴定；③药材饮片的鉴定。

本发明第一个目的在于提供一条用于Taqman荧光定量PCR的特异性Taqman探针，其二，是提供一种能快速鉴定伊犁贝母的测试方法；其三是应用所述探针与方法，以解决目前快速鉴定伊犁贝母存在的技术缺陷。

实现本发明目的之技术措施如下：一种用于快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针，所述特异性Taqman探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1，如下所示：

5′-TGTTCGCGATTGCCTCAGG-3′。

所述探针是根据伊犁贝母的18S rRNA基因与5.8S rRNA基因间的内转录1区，Internal Transcribed Spacer-1即ITS1序列所设计的。

一种用于快速鉴定伊犁贝母的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

3.1)提取待测样品基因组DNA；

3.2)以待测样品基因组DNA为模板，利用其ITS1扩增引物及所述的特异性Taqman探针进行Taqman荧光定量PCR扩增；

3.3)PCR反应结束后，利用PCR仪自带的扩增曲线即可判定样本是否为伊犁贝母。

进一步的，所述快速鉴定伊犁贝母的荧光定量PCR检测方法，所述其ITS1扩增引物的

上游引物核苷酸序列为：5′-AGGATCATTGTCGAGAACCG-3′；

下游引物核苷酸序列为：5′-TGCGTTCATAGACTCGATGG-3′。

进一步的，所述一种快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针及方法的用途，用于伊犁贝母基原植物的快速分子鉴定。

更进一步的，所述一种快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针及方法的用途，用于伊犁贝母药材与药材饮片的快速分子鉴定。

与针对鉴定伊犁贝母的现有技术比较，本发明有如下的优点与积极效果：

1、本发明首次发现以该Taqman探针为核心的Taqman荧光定量PCR方法能够特异性鉴定伊犁贝母，仅有伊犁贝母显示阳性结果，其它贝母品种显示为阴性结果并运用本发明对伊犁贝母基原植物、药材与药材饮片的特异性分子检测鉴定；具有很高的可行性与应用前景，对中草药贝母市场的健康稳定发展具有重要的意义。

2、所说的本发明具有以下优点：

①特异性好，仅有伊犁贝母在Taqman荧光定量PCR中显示出阳性扩增曲线；

②灵敏度高，Taqman荧光定量PCR的最低检测浓度(DNA)为0.01925ng/μL。

③步骤少、检测周期短：Taqman荧光定量PCR操作步骤包含DNA提取、PCR扩增与扩增曲线结果分析，操作时间仅需2-3小时；

④“即时与定量”，本发明涉及的Taqman荧光定量PCR能够实时、定性及定量鉴定，可为用户提供不同层次的鉴定要求，具有更广泛的应用；

⑤重现性好：已经进行了10次以上的生物学重复，重现性达到100％。

附图说明

图1本发明实施例试验检测过程流程示意图。

图2本发明所用Taqman荧光定量PCR的反应灵敏度检测结果示意图。

图3本发明对伊犁贝母基原植物与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

图4本发明对伊犁贝母药材与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

图5本发明对伊犁贝母药材饮片与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

图6本发明所述探针设计的依据即ITS1序列图。

具体实施方式

结合实施例与附图对本发明作进一步说明：

从图1可知，实施本发明历经伊犁贝母基原植物、药材与药材饮片、基因组DNA提取、Tagmen探针实时荧光PCR、采用Roche lightGycler96 system、扩增曲线结果分析阶段，整个步骤耗时2～3小时。

一种用于快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针，所述特异性Taqman探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1，所示：5′-TGTTCGCGATTGCCTCAGG-3′。

所述探针是根据伊犁贝母的18S rRNA基因与5.8S rRNA基因间的内转录1区Internal Transcribed Spacer-1即ITS1序列所设计的。如附图6。

利用其ITS1扩增引物及所述的特异性Taqman探针。本发明基于不同基原贝母的ITS1 序列信息，通过实验分析比对，发现伊犁贝母ITS1中含有一段伊犁贝母特征异性的DNA序列。本发明据此设计了特异Taqman探针及相应的Taqman荧光PCR检测技术，能够快速准确区分伊犁贝母与其它种类贝母。

一种用于伊犁贝母鉴定的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)以待测样品基因组DNA为模板，利用ITS1扩增引物(上游引物：

5′-AGGATCATTGTCGAGAACCG-3′；下游引物：

5′-TGCGTTCATAGACTCGATGG-3′)及所述的特异性Taqman探针进行Taqman荧光定量PCR扩增；

3)根据扩增曲线来判定样品是否为伊犁贝母。

其中，步骤1)中所述待测样品基因组DNA提取包括以下步骤：取伊犁贝母干燥鳞茎样品、或药材、或药材饮片(50～60mg)，用75％的酒精和无菌超纯水擦拭干净，加入液氮研磨成极细粉，采用北京天根生化有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)，按照说明书提取样品基因组DNA。将提取的DNA使用Bio-Tek酶标仪检测，用灭菌超纯水作空白对照，检测DNA的浓度。

步骤2)中Taqman荧光定量PCR的反应体系与反应参数

步骤2)所述Taqman荧光定量PCR反应体系：2×T5 Fast qPCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)为10μL，步骤2中的ITS1扩增上、下游引物(浓度为10μM)

各1.0μL，Taqman探针(浓度10μM)1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积20μL。

步骤2)中的Taqman荧光定量PCR反应条件参数：95℃预变性2min，1次循环；95℃变性10s，60℃退火延伸1min，收集荧光信号，40次循环。变性步骤

循环数可以为30～50个；优选为40个循环。

所述荧光定量PCR反应采用Roche LightCycler96荧光定量PCR仪完成。

图2给出了本发明所用Taqman荧光定量PCR的反应灵敏度检测结果，显示该鉴定方法有较高的反应灵敏度，最低检测浓度可达0.0193ng/μL(具体结果可见表1)。

图3、图4、图5给出本发明所用Taqman荧光定量PCR对不同种类贝母样品的检测结果，检测的样品为伊犁贝母(包括基原植物、药材及药材饮片，见表2)与其它近缘贝母品种(表3)。揭示本发明特异性Taqman探针用于伊犁贝母及其近缘贝母品种鉴别的荧光定量PCR检测的用途。

实施例1：以伊犁贝母基原植物、药材及药材饮片为样品的实验及结果

1)伊犁贝母样品的DNA提取

取1份伊犁贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)样品，取贝母干燥鳞茎样品、药材及饮片各约50～60mg，用75％的酒精和无菌超纯水洗净，晾干，加入液氮研磨成极细粉，采用北京天根生化有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)，按照说明书提取样品基因组DNA。将提取的DNA使用Bio-Tek酶标仪检测，用灭菌超纯水作空白对照，检测DNA的浓度。

2)Taqman荧光定量PCR的反应体系与反应参数

Taqman荧光定量PCR反应体系为：2×T5 Fast qPCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)为10μL，步骤2中的ITS1通用上、下游引物(浓度为10μM)各1.0μL，Taqman探针(浓度10μM)1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积20μL。

Taqman荧光定量PCR反应条件参数：95℃预变性2min，1次循环；95℃变性10s，60℃延伸1min，收集荧光信号，40次循环。

3)Taqman荧光定量PCR的反应灵敏度

将上述伊犁贝母基因组DNA用灭菌超纯水按10倍稀释成5个梯度，每个浓度梯度各取 1μL作为模板，检测荧光定量PCR反应灵敏度。

检测结果显示，采用Roche LightCycler96荧光定量PCR仪，在模板DNA质量浓度为192.499～0.01925ng/μL时，均可能产生良好的特异性荧光扩增曲线，Cq值最大为34.35(表1，附图2)。综上，该鉴定方法灵敏度高。

表1不同浓度DNA荧光定量PCR结果

4)Taqman荧光定量PCR对伊犁贝母基原植物、药材与药材饮片等不同形式(表2)的适用度。由附图3-5可知，无论伊犁贝母基原植物、药材与药材饮片，在Taqman荧光定量 PCR中均能特异性显示出S型扩增曲线，为典型的阳性反应，表明本发明能够适用于伊犁贝母基原植物、药材与药材饮片，有较广阔的应用范围。

表2伊犁贝母的基原植物、药材与药材饮片信息

实施例2：其它种类贝母样品的实验及结果

1)其它种类贝母样品的基因组DNA提取

基本同实施例1，所不同的是本实施例共收集不同贝母基原品种共12种(表3)，包括：暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)、太白贝母(Fritillaria taipaiensis)、卷叶贝母 (Fritillaria cirrhosa)、梭砂贝母(Fritillaria delavayi)、瓦布贝母(Fritillaria wabuensis)、甘肃贝母(Fritillaria przewalskii)、康定贝母(Fritillaria cirrhosa var.ecirrhosa Franch)、浓蜜贝母(Fritillaria mellea)、中华贝母(Fritillaria sinica)、浙贝母 (Fritillaria thunbergii)、平贝母(Fritillariaussuriensis)、湖北贝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)共12种32份样品，进行基因组DNA提取。提取到的基因组DNA直接用于后续荧光定量PCR实验，以检测荧光定量PCR反应特异性。

表3其它种类贝母样品

2)荧光定量PCR反应

基本步骤同实施例1。

3)Taqman荧光定量PCR的反应特异性

由附图3可知，12种其它贝母品种，包括暗紫贝母、太白贝母、卷叶贝母、梭砂贝母、瓦布贝母、甘肃贝母、康定贝母、浓蜜贝母、中华贝母、湖北贝母、浙贝母与平贝母均未见特异性扩增曲线，未检测到荧光信号增加，为典型的阴性反应。综上，该鉴定方法特异性强，能够有效鉴定伊犁贝母及其常见易混品。

实施例3

本发明应用实施例操作步骤：

1、分别取伊犁贝母(包括基原植物、药材与药材饮片)及其它贝母品种样品50～70mg；

2、加入液氮研磨成细粉，采用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)完成基因组 DNA提取；

3、利用BioTek酶标仪测定DNA浓度；

4、分别取DNA2×T5 Fast qPCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)10μL，ITS1扩增上、下游引物(浓度为10μM)各1.0μL，Taqman探针(浓度10μM)1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积20μL；

5、采用Roche LightCycler96 sestem荧光定量PCR仪,进行Taqman荧光定量PCR；

反应参数为95℃预变性2min，1次循环；95℃变性10s，60℃退火延伸1min，收集荧光信号，循环数可以为30～50个；

6、利用仪器自带分析软件分析扩增曲线；

7、出现阳性扩增曲线的即为伊犁贝母。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南交通大学

<120> 一种快速鉴定伊犁贝母的Taqman探针

<130> 伊犁贝母

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora Schrenk）

<400> 1

tgttcgcgat tgcctcagg 19

Claims

1.一种用于快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针，其特征在于，所述特异性Taqman探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1，如下所示：

5′-TGTTCGCGATTGCCTCAGG-3′。

2.根据权利要求1所述的特异性Taqman探针，其特征在于，所述探针是根据伊犁贝母的18S rRNA基因与5.8S rRNA基因间的内转录1区，Internal Transcribed Spacer-1即ITS1序列所设计的。

3.一种用于快速鉴定伊犁贝母的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

3.1)提取待测样品基因组DNA；

4.根据权利要求3所述快速鉴定伊犁贝母的荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述其ITS1扩增引物的

上游引物核苷酸序列为:5′-AGGATCATTGTCGAGAACCG-3′；

下游引物核苷酸序列为：5′-TGCGTTCATAGACTCGATGG-3′。

5.根据权利要求1或2所述一种快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针及方法的用途，其特征在于，用于伊犁贝母基原植物的快速分子鉴定。

6.根据权利要求1或2所述一种快速鉴定伊犁贝母的特异性Taqman探针及方法的用途，其特征在于，用于伊犁贝母药材与药材饮片的快速分子鉴定。