CN112359135B - 太白贝母的Indel标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速鉴定太白贝母的Indel标记引物、方法及用途，属中药材来源品种鉴定技术领域。本发明首次发现以该Indel标记引物为核心的PCR方法能够特异性鉴定太白贝母，仅有太白贝母在302bp位置显示阳性结果，其它贝母品种显示为阴性结果。可用于太白贝母基原植物与药材的特异性分子鉴定。本发明具有以下优点：①特异性好，仅有太白贝母在302bp位置显示出阳性结果；②灵敏度高，PCR的最低检测浓度(DNA)为0.239ng/μL；③步骤少、检测周期短：操作时间仅需2‑3小时；④重现性好：已经进行了10次以上的生物学重复，重现性达到100％。

Description

太白贝母的Indel标记引物及其应用

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，公开了一种太白贝母的InDel标记引物及利用该标记引物建立的PCR方法，能够准确区分太白贝母与其它基原贝母品 种，有效保证药材基原的准确性与质量安全。

技术背景

以植物、动物来源的中药材在生物学上物种的确定，称之为基原。如果中药材 标准来源项下收载有两个及以上基原的情况称之为多基原中药材。尽管多基原缓解 了中药材的市场空缺，然而多基原的混合使用严重影响中药临床疗效的有效性、安 全性与质量可控性。为此，国家食品药品监督管理总局于2016年颁布《中药配方颗 粒管理办法(征求意见稿)》规定：“对栽培、养殖或野生采集的药用动植物，应准 确鉴定其物种，包括亚种、变种或品种，不同种的中药材不可相互混用”。

贝母是典型的多基原药材，极易混淆与掺杂。《中国植物志》中收载，太白贝 母(Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li)为百合科(Liliaceae)贝母属Fritillaria L.植 物，主要分布于陕西(秦岭及其以南地区)、甘肃(东南部)、四川(东北部)和 湖北(西北部)，生于海拔1100-3150米的山坡草丛中或水边。2020年版《中国药 典》收载川贝母、伊贝母、浙贝母、平贝母与湖北贝母等药材品种。太白贝母属于 川贝母药材的6种基原之一，其余川贝母药材的基原还包括卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa)、暗紫贝母(F.unibracteataP.K.Hsiao&K.C.Hsia)、甘肃贝母(F. przewalskii)、梭砂贝母(F.delavayi)和瓦布贝母(F.unibracteata Hsiaoet K.C. Hsia var.wabuensis)。目前，2020版《中国药典》中“川贝母”项下以有PCR- RFLP分子鉴定方法，该方法优点是能够区分川贝母与伊贝母等其余5种贝母药 材，但缺点是不能区分川贝母的6种基原，并且也不能区分川贝母与浓蜜贝母、中华贝母和康定贝母等川贝母近缘物种。以致市场上出现了不同基原贝母、不同基原 川贝母、川贝母与一些近缘混淆品混用的现象。以上情况，均会严重影响临床疗效 与安全性，极大地危害消费者及病患者利益，因此急需建立适合于单基原的准确、 高效鉴定方法。公开号为CN 201410064966的专利，使用叶绿体基因组测序方法用 于鉴定太白贝母，但该方法存在测序周期长，成本高、样本必需新鲜等缺点。基于 此目的，本发明建立一种能够准确鉴定太白贝母的分子生物学方法，能够有效区分 太白贝母与非太白贝母(包括其余5种川贝母基原、非川贝母及一些川贝母近缘易 混种)。

太白贝母的鉴定主要依赖于传统的性状鉴定方法，此法主要从样品的鳞茎色 泽、脐点形状、鳞叶数量、抱合紧密度、顶端开合、长短以及气味等特征进行观察 比较，需要丰富的鉴定经验，且栽培品形态标准性较差。再加上人为干预栽培导致 不同贝母的相似度不断上升，鉴别难度不断增加，一般需要结合其他分析鉴定技术 进行鉴别。化学方法如高效液相色谱以及液质联用技术，耗费材料多，且需要大型 仪器支持，推广难度大，因此，开发更加便捷、快速的检测方法以满足药材市场监 控需求是刻不容缓的。

发明内容

发明人基于川贝母(6种基原)、伊贝母(2种基原，分别为伊犁贝母与新疆贝 母)、浙贝母、平贝母与湖北贝母等不同贝母的叶绿体基因组的序列信息，通过分 析比对，发现太白贝母在accD-psaI基因区间中有一段长度为137bp的DNA片段缺 失，这段缺失即作为太白贝母特异性的Indel标记。本发明据此Indel标记，设计 Indel标记上下游引物，用于太白贝母的鉴定，至少有以下应用：①太白贝母基原植 物的鉴定；②药材的鉴定。

本发明第一个目的在于提供可供太白贝母分子鉴定的Indel标记引物，其二，是提供一种能快速鉴定太白贝母的测试方法；其三是应用所述标记与方法，以解决目 前快速鉴定太白贝母贝母存在的技术缺陷。

实现本发明目的之技术措施如下：一种太白贝母的Indel标记引物，所述特异性Indel标记引物的核苷酸序列SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：1，如下所示：

SEQ ID NO：1的核苷酸序列：5′-GCGAACGAGTATTTAGTTCATC-3′

SEQ ID NO：2的核苷酸序列：5′-AGGGTTCTTTCACTCCTTTCT-3′。

所述的Indel标记引物是根据太白贝母的Indel标记设计的。该Indel标记的获得是通过13种不同贝母属植物的叶绿体基因组序列比对，发现太白贝母的accD-psaI 基因区间缺失一段长度为137个bp的序列设计的。

一种基于该Indel标记引物用于太白贝母鉴定的PCR方法，包括如下步骤：

3.1)提取待测样品基因组DNA；

3.2)以待测样品基因组DNA为模板，利用上述Indel标记引物进行PCR扩增；

3.3)根据凝胶电泳结果是否出现302bp位置的条带来判定样品是否为太白贝母。进一步的，所述太白贝母的Indel标记引物及其应用，用于太白贝母基原植物的快速 分子鉴定。

更进一步的，所述太白贝母的Indel标记引物及其应用，用于太白贝母药材的快速分 子鉴定。

与针对鉴定太白贝母的现有技术比较，本发明有如下的优点与积极效果：

1、本发明首次发现以该Indel标记为核心的PCR方法能够特异性鉴定太白贝母，仅有太白贝母的PCR扩增产物在302bp位置显示为阳性结果，其它贝母品种在302bp位 置均显示为阴性结果，并运用本发明对太白贝母基原植物、药材的特异性分子检测 鉴定；具有很高的可行性与应用前景，对中草药贝母市场的健康稳定发展具有重要 的意义。

2、所说的本发明具有以下优点：

①操作步骤少，成本低、检测周期短，其操作步骤包含：DNA提取、PCR扩 增、凝胶电泳、凝肽成像与结果分析，操作时间仅需2-3小时；

②特异性好，仅有太白贝母在302bp位置显示为阳性结果；

③重现性好：我们已进行了10次以上的生物学重复，重现性达到100％；

④灵敏度高：本方法最低检测(DNA)浓度检测为0.239ng/μL。

附图说明

图1本发明实施例试验检测过程流程示意图。

图2本发明所用PCR的反应灵敏度检测结果示意图。

图3本发明所用PCR的最优Tm检测结果示意图、及对太白贝母基原植物与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

图4本发明对太白贝母药材与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

具体实施方式

结合实施例与附图对本发明作进一步说明：

从图1可知，实施本发明历经太白贝母基原植物、药材、基因组DNA提取、 PCR、凝胶电泳、凝胶成像及结果分析阶段，整个步骤耗时2～3小时。

一种太白贝母的Indel标记引物及其应用的特异性Indel标记引物，所述特异性Taqman探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2，如下所示：

SEQ ID NO：1的核苷酸序列：5′-GCGAACGAGTATTTAGTTCATC-3′

SEQ ID NO：2的核苷酸序列：5′-AGGGTTCTTTCACTCCTTTCT-3′

所述的Indel标记引物是根据太白贝母的Indel标记设计的。该Indel标记的获得是通过13种贝母属植物的叶绿体基因组序列比对，发现太白贝母的accD-psaI基因 区间缺失一段长度为137个bp的序列设计的。

基于川贝母(6种基原)、伊贝母(2种基原，分别为伊犁贝母与新疆贝母)、 浙贝母、平贝母与湖北贝母等不同贝母的叶绿体基因组的序列信息，发现太白贝母 在accD-psaI基因区间中有一段长度为137bp的DNA片段缺失，这段缺失即作为太 白贝母特异性的Indel标记。本发明据此设计了Indel标记引物及相应的PCR检测技 术，能够快速准确区分太白贝母与其它种类贝母。

一种用于太白贝母鉴定的PCR检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)以待测样品基因组DNA为模板，利用上述Indel标记引物(SEQ ID NO：1与 SEQID NO：2)进行PCR扩增；

3)根据凝胶电泳结果是否出现302bp位置的条带来判定样品是否为太白贝母。 其中，步骤1)中所述待测样品基因组DNA提取包括以下步骤：取伊犁贝母干燥鳞 茎样品、或药材、或药材饮片(50～60)mg，用75％的酒精和无菌超纯水擦拭干 净，加入液氮研磨成极细粉，采用北京天根生化有限公司的植物基因组DNA提取 试剂盒(DP305)，按照说明书提取样品基因组DNA。将提取的DNA使用Bio- Tek酶标仪检测，用灭菌超纯水作空白对照，检测DNA的浓度。

步骤2)中PCR的反应体系与反应参数

步骤2)所述PCR反应体系：2×Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)为 12.5μL，步骤2)，Indel标记引物上、下游引物(浓度均为10μM)各1.0μL，DNA模 板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积25μL。

步骤2)中的PCR反应条件参数：95℃预变性10min，1次循环，(95℃变性 30S，，58℃退火。30S，72℃延伸，50S，35次循环)，72℃延伸，7min。

所述PCR反应采用Thermo Fisher 96-Well Thermal Cycler PCR仪完成。

步骤3)中所述的凝胶电泳优选为3％琼脂糖电泳，恒定电压100V，步骤2)中的PCR产物8μL。

图2给出了本发明所用PCR的反应灵敏度检测结果，显示该鉴定方法有较高 的反应灵敏度，最低检测浓度可达0.239ng/μL(具体结果可见表1)。图2注释：M 为核酸分子量Marker；1-8代表DNA模板浓度(ng/μL)为238.54，23.854，2.39， 0.239，0.0239，0.00239，0.000239与0.0000239时的PCR结果。

图3给出了本发明所用PCR的最优Tm检测结果，显示该鉴定方法在Tm值为 55～59℃均有较好的扩增效果，优选为58℃。图3注释：所有样品除湖北贝母为药材 粉末外，均为基原植物叶片。A为Tm等于55℃时的PCR结果图；B为Tm等于56℃时 的PCR结果图；C为Tm等于57℃时的PCR结果图；D为Tm等于58℃时的PCR结果 图；E为Tm等于59℃时的PCR结果图；F为Tm等于60℃时的PCR结果图。

M为核酸分子量Marker；1道为暗紫贝母；2道为梭砂贝母；3为卷叶贝母；4为 太白贝母；5为甘肃贝母；6为瓦布贝母；7为中华贝母；8为康定贝母；9为伊犁贝 母；10为浓蜜贝母；11为浙贝母；12为平贝母；13为新疆贝母；14为湖北贝母。

图4注释：M为核酸分子量Marker；1为市售松贝药材；2为市售青贝药材；3为 市售炉贝药材；4为太白贝母干燥鳞茎药材；5为瓦布贝母干燥鳞茎药材；6为中华 贝母干燥鳞茎药材；7为康定贝母干燥鳞茎药材；8为伊犁贝母干燥鳞茎药材；9为 浓蜜贝母干燥鳞茎药材；10为浙贝母干燥鳞茎药材；11为平贝母干燥鳞茎药材；12 为新疆贝母干燥鳞茎药材；13为湖北贝母干燥鳞茎粉末药材

图3、图4给出本发明所用PCR对不同种类贝母样品的检测结果，检测的样品 为太白贝母(包括基原植物、药材，见表2)与其它近缘贝母品种(表3)。揭示本 发明Indel标记引物用于太白贝母及其近缘贝母品种鉴别的PCR检测的用途。

实施例1：以太白贝母基原植物、药材为样品的实验及结果

1)太白贝母样品的DNA提取

取1份太白贝母(Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li)样品，取贝母叶片、干燥鳞茎药材各约50～60mg，用75％的酒精和无菌超纯水洗净，晾干，加入液氮研磨成极细 粉，采用北京天根生化有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)，按照说 明书提取样品基因组DNA。将提取的DNA使用Bio-Tek酶标仪检测，用灭菌超纯水 作空白对照，检测DNA的浓度。

2)PCR的反应体系与反应参数

PCR反应体系为：2×Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)为12.5μL，步 骤2中的Indel标记引物上、下游引物(浓度均为10μM)各1.0μL，DNA模板2.0μL， 用灭菌超纯水补足体积至总体积25μL。

PCR反应条件参数：95℃预变性10min，1次循环，(95℃变性30S，，58℃退 火。30S，72℃延伸，50S，35次循环)，72℃延伸，7min。

3)PCR的反应灵敏度

将上述太白贝母基因组DNA用灭菌超纯水按10倍稀释成8个梯度，每个浓度梯 度各取2μL作为模板，检测PCR反应灵敏度。

检测结果显示，采用Thermo Fisher 96-Well Thermal Cycler PCR仪，在模板DNA质量浓度为238.54～0.239ng/μL时，均可能产生良好的PCR扩增效果，凝胶电 泳条带清晰可见(表1，附图2)。综上，该鉴定方法灵敏度高。

表1不同浓度DNA的PCR结果

4)PCR对太白贝母基原植物与药材等不同形式(表2)的适用度。由附图3-4可 知，无论太白贝母基原植物与药材，经过PCR扩增后，均能产生长度为302bp位置 的阳性条带，表明本发明能够适用于太白贝母基原植物与药材，有较广阔的应用范 围。

表2太白贝母的基原植物与药材信息

实施例2：其它种类贝母样品的实验及结果

1)其它种类贝母样品的基因组DNA提取

基本同实施例1，所不同的是本实施例共收集不同贝母基原品种共13种(表 3)，包括：暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)、太白贝母(Fritillaria taipaiensis)、卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa)、梭砂贝母(Fritillaria delavayi)、 瓦布贝母(Fritillaria wabuensis)、甘肃贝母(Fritillaria przewalskii)、康定贝母(Fritillaria cirrhosa var.ecirrhosa Franch)、浓蜜贝母(Fritillaria mellea)、中华贝母(Fritillaria sinica)、浙贝母(Fritillaria thunbergii)、平贝母(Fritillariaussuriensis)、湖北贝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)、新疆贝母(Fritillaria walujewii Regel)共13种26份样品，进行基因组DNA提取。提取到的基 因组DNA直接用于后续PCR实验，以检测PCR反应特异性。

表3其它种类贝母样品

2)PCR反应

基本步骤同实施例1。

3)PCR的反应特异性

由附图3-4可知，12种其它贝母品种，包括暗紫贝母、太白贝母、卷叶贝母、 梭砂贝母、瓦布贝母、甘肃贝母、康定贝母、浓蜜贝母、中华贝母、湖北贝母、浙 贝母、新疆贝母的PCR扩增产物长度为450bp左右，平贝母未检测到PCR产物，在 302bp位置均显示为阴性结果，与太白贝母的PCR扩增结果有明显差别。综上，该 鉴定方法特异性强，能够有效鉴定太白贝母及其常见易混品。

实施例3

本发明应用实施例操作步骤：

1、分别取太白贝母(包括基原植物与药材)及其它贝母品种样品50～70mg；

2、加入液氮研磨成细粉，采用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)完成基因组 DNA提取；

3、利用BioTek酶标仪测定DNA浓度；

4、分别取DNA 2×Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)为12.5μL，步骤2中的Indel标记引物上、下游引物(浓度均为10μM)各1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌 超纯水补足体积至总体积25μL。

5、采用Thermo Fisher 96-Well Thermal Cycler PCR仪,进行PCR；

反应参数为95℃预变性10min，1次循环，(95℃变性30S，，58℃退火。30S，72 ℃延伸，50S，35次循环)，72℃延伸，7min；

6、利用琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像分析PCR扩增结果；

7、出现长度为302bp位置的阳性条带的即为太白贝母。

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 太白贝母的Indel标记引物及其应用

<130> 发明

<140> 20201210

<141> 2020-12-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li

<400> 1

gcgaacgagt atttagttca tc 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li

<400> 2

agggttcttt cactcctttc t 21

Claims (5)

1.一种用于鉴定太白贝母的Indel标记引物，其特征在于，所述的Indel标记引物的核苷酸序列SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2，如下所示：

SEQ ID NO：1的核苷酸序列：5′-GCGAACGAGTATTTAGTTCATC-3′；

SEQ ID NO：2的核苷酸序列：5′-AGGGTTCTTTCACTCCTTTCT-3′。

2.根据权利要求1所述的Indel标记引物，其特征在于，该Indel标记的获得是通过13种贝母属植物的叶绿体基因组序列比对，发现太白贝母的accD-psaI基因区间缺失一段长度为137个bp的序列设计的。

3.一种权利要求1所述太白贝母的Indel标记引物用于太白贝母鉴定的PCR检测方法，包括如下步骤：

3.1)提取待测样品基因组DNA；

3.2)以待测样品基因组DNA为模板，利用上述Indel标记引物进行PCR扩增；

3.3)根据凝胶电泳结果是否出现302bp位置的条带来判定样品是否为太白贝母。

4.根据权利要求1、2及3任一所述太白贝母的Indel标记引物的应用，其特征在于，用于太白贝母基原植物的快速分子鉴定。

5.根据权利要求4所述太白贝母的Indel标记引物的应用，其特征在于，用于太白贝母药材的快速分子鉴定。

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