CN108998554B - 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 - Google Patents
鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。该检测试剂盒包括金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的特异引物和特异探针，以及石斛属通用引物和通用探针，其序列如SEQ No.1‑12所示。本发明以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，为2015版药典中记载的3种药用石斛的品质和真实性提供有力的保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
石斛为兰科石斛属多年生草本植物，主要分布在热带及亚热带地区，全球约有1500种。在我国大约有76种，多分布在北纬30度以南地区。该属植物中的一些种类是常用的中药材，具有益胃生津、滋阴清热的功效，既可以用来泡茶、泡酒、作药膳等，也可直接食用、观赏，价值较高。
由于石斛属种类繁杂、分布广，分类混乱，不同种类的石斛药材，外观相似，但药效存有差异。目前常用的鉴定方法有组织鉴定、显微鉴定、光谱鉴定、色谱鉴定、分子生物学技术鉴定等，但是这些方法会存在感官检测局限性、准确性低、仪器配套成本高、鉴别操作复杂等问题。近年来实时荧光PCR技术检测的灵敏度、特异性和准确性，受到了很多研究领域的一致认可。本发明将该技术应用于2015版药典中的3种药用的石斛：金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)、鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)和流苏石斛(Dendrobium fimbriatum Hook.)的鉴定中，对石斛类药材及其基源植物的鉴定起到重要作用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种在一个PCR反应中可同时鉴别金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。本发明的试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。
本发明的技术方案是：一种鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，它包括金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的特异引物和特异探针，以及石斛属通用引物和通用探针，其中：
金钗石斛(JC)特异上游引物JCF：5’-AGAGACGAACACAATGAGCGA-3’(SEQ No.1)；
金钗石斛(JC)特异下游引物JCR：5’-CACCCAATCCCACAAAACC-3’(SEQ No.2)；
金钗石斛(JC)特异探针JCP：FAM-CGGTGCCTGTAGTGCTGCGAT-BHQ2(SEQ No.3)；
鼓槌石斛(GC)特异上游引物GCF：5’-GCAGCGAAATGCGATACG-3’(SEQ No.4)；
鼓槌石斛(GC)特异下游引物GCR：5’-GGCACGAGGAGCCACTGT-3’(SEQ No.5)；
鼓槌石斛(GC)特异探针GCP：CY5-ATCGACGGGTGGCTGGACAC-BHQ1(SEQ No.6)；
流苏石斛(LS)特异上游引物LSF：5’-TGTTATTGTGTCGTGTATGCCC-3’(SEQ No.7)；
流苏石斛(LS)特异下游引物LSR：5’-TCCTCGTAAGTTTCTTCTCCTCC-3’(SEQ No.8)；
流苏石斛(LS)特异探针LSP：NED-CAGGTGATCCTGAATCATGCGTC-BHQ1(SEQ No.9)；
石斛属(USH)通用上游引物USHF：5’-ACGATGGATATCTCGGCTC-3’(SEQ No.10)；
石斛属(USH)通用下游引物USHR：5’-CAGTTGCGTTCAAAGACTCG-3’(SEQ No.11)；
石斛属(USH)通用探针USHP：ROX-CGAATTGCAGAATCCC-BHQ2(SEQ No.12)。
以上所有特异探针的5’端修饰有报告基团FAM、CY5、ROX或者NED，3’端修饰有淬灭基团BHQ2或者BHQ1。
进一步的，本发明的荧光PCR检测试剂盒，其中各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。
进一步的，本发明的荧光PCR检测试剂盒，它还包括：2×TaqMan Master Mix、DNA模板和双蒸水。
进一步优选的，上述的荧光PCR检测试剂盒，其20μL PCR扩增体系为：2×TaqManMasterMix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL，其配制方法如表1所示。
表1 多重PCR反应扩增体系
备注：引物组和探针组合物浓度指的是每条引物和每个探针的浓度均是此浓度。
进一步的，上述的荧光PCR检测试剂盒，还包括金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
本发明还提供了一种鉴别药典中3种药用石斛(金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛)的荧光PCR检测方法，其特征是，具体步骤如下：
1)提取待测样本的模板DNA；
2)PCR扩增
使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增，需要在4通道甚至以上的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；68℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整；
3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值；
4)结果判定：当FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为金钗石斛；当CY5、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为鼓槌石斛；当NED、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为流苏石斛；仅ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属样品；其余为非石斛属样品。
本发明的有益效果：与现有的技术相比：本发明以石斛属的一对通用引物和金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛特异引物对待测样本DNA提取物进行PCR扩增，以四条特异性荧光探针及石斛属通用探针，以4色荧光对金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛加以鉴别。本发明以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，为2015版药典中记载的3种药用石斛的品质和真实性提供有力的保障。
附图说明
图1为不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为金钗石斛；当CY5、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为鼓槌石斛；当NED、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为流苏石斛；仅ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属样品；其余为非石斛属样品；
图2为当金钗石斛模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.08ng。
图3为当鼓槌石斛模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.08ng。
图4为当流苏石斛模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.08ng。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：
实验材料：金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、铁皮石斛、紫皮石斛、竹叶石斛、石豆石斛、铜皮石斛、喉红石斛、竹枝石斛、霍山米斛、翅梗石斛、蝴蝶兰(红花)、蝴蝶兰(黄花)、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡、平贝母、白术、人参。
所用试剂：植物DNA提取试剂盒，DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。
所用仪器：QuantStudioTM 7 Flex实时荧光定量PCR仪为赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
实施例1
1、药典中3种药用石斛及其他中药样本DNA提取：
采用植物DNA提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
2、靶基因的选择和引物的设计：基于DNA条形码技术，选择ITS2基因作为靶基因，设计石斛通用引物和通用探针、设计药典中3种药用石斛特异引物和特异探针。引物及探针的核苷酸序列见表2。
表2 引物及探针的核苷酸序列
3.荧光检测：
优先选用20μL的实时荧光PCR扩增体系，反应体系见表1。
4、PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃，10s，68℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
5、结果分析：每次试验设立3种药用石斛阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品是否为铁皮石斛。结果见图1，当FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为金钗石斛；当CY5、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为鼓槌石斛；当NED、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为流苏石斛；仅ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属样品，其余为非石斛属样品。
实施例2：特异性验证
利用本发明设计的引物和探针，分别以金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、铁皮石斛、紫皮石斛、竹叶石斛、石豆石斛、铜皮石斛、喉红石斛、竹枝石斛、霍山米斛、翅梗石斛、蝴蝶兰(黄花)、蝴蝶兰(红花)、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡、平贝母、白术、人参的总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表3及图1，结果表明：本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。
表3 特异性验证试验
实施例3：灵敏度实验
将金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的基因组DNA分别定量到5ng/μL，按5×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量(即：10ng、2ng、0.4ng、0.08ng)进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。实验结果见图2、3、4，结果表明本方法定量检测限为0.08ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。
实施例4：实际样本测试
使用本发明提供的试剂盒及检测方法对随机抽取的11份石斛及非石斛样品进行采用多重实时荧光PCR检测方法检测与测序结果进行验证，结果显示本方法与测序结果完全一致，相比形态学及液相方法更加准确可靠，灵敏快速。统计结果见表4。从表4可以看出：金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛得到有效的鉴定。
表4 实际样品检测结果
备注：上述3个铁皮石斛来自于3个不同的产地。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用
<130> 0
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagacgaac acaatgagcg a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacccaatcc cacaaaacc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggtgcctgt agtgctgcga t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagcgaaat gcgatacg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggcacgagga gccactgt 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atcgacgggt ggctggacac 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgttattgtg tcgtgtatgc cc 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcctcgtaag tttcttctcc tcc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caggtgatcc tgaatcatgc gtc 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgatggata tctcggctc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cagttgcgtt caaagactcg 20
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgaattgcag aatccc 16
Claims (7)
1.一种鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，它包括金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的特异引物和特异探针，以及石斛属通用引物和通用探针，其中：
金钗石斛特异上游引物JCF：5’-AGAGACGAACACAATGAGCGA-3’；
金钗石斛特异下游引物JCR：5’-CACCCAATCCCACAAAACC-3’；
金钗石斛特异探针JCP：FAM-CGGTGCCTGTAGTGCTGCGAT-BHQ2；
鼓槌石斛特异上游引物GCF：5’-GCAGCGAAATGCGATACG-3’；
鼓槌石斛特异下游引物GCR：5’-GGCACGAGGAGCCACTGT-3’；
鼓槌石斛特异探针GCP：CY5-ATCGACGGGTGGCTGGACAC-BHQ1；
流苏石斛特异上游引物LSF：5’-TGTTATTGTGTCGTGTATGCCC-3’；
流苏石斛特异下游引物LSR：5’-TCCTCGTAAGTTTCTTCTCCTCC-3’；
流苏石斛特异探针LSP：NED-CAGGTGATCCTGAATCATGCGTC-BHQ1；
石斛属通用上游引物USHF：5’-ACGATGGATATCTCGGCTC-3’；
石斛属通用下游引物USHR：5’-CAGTTGCGTTCAAAGACTCG-3’；
石斛属通用探针USHP：ROX-CGAATTGCAGAATCCC-BHQ2。
2.如权利要求1所述的一种鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述荧光PCR检测试剂盒，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。
3.如权利要求2所述的一种鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述荧光PCR检测试剂盒还包括：2×TaqMan Master Mix、DNA模板和双蒸水。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，还包括金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
5.采用权利要求4所述的检测试剂盒鉴别药典中3种药用石斛的荧光PCR检测方法，其特征是，具体步骤如下：
1)提取待测样本的模板DNA；
2)PCR扩增
使用荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增，需要在4通道甚至以上的荧光定量PCR仪上进行；
3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值；
4)结果判定：当FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为金钗石斛；当CY5、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为鼓槌石斛；当NED、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为流苏石斛；仅ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属样品。
6.如权利要求5所述的荧光PCR检测方法，其特征是，所述检测试剂盒20μL PCR扩增体系为：2×TaqMan Master Mix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL。
7.如权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征是，所述步骤(2)的扩增程序为：95℃，2min；95℃，10s；68℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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