CN112899393B - 党参属物种cpSSR分子标记及其应用 - Google Patents

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种党参属物种cpSSR分子标记及其应有；本发明的内容是基于分析党参属植物叶绿体基因组序列并设计开发出5对特异性cpSSR标记，并公开了上述标记可对轮叶党参属物种进行快速鉴定；由于不同党参属物种在植株、果实、种子及根部形态上难以进行准确区分，利用本发明开发的cpSSR分子标记可对多个党参属物种进行快速、准确的鉴定。本专利具有开发效率高、周期低、费用低的优点，同时填补了党参目前无细胞质基因组分子标记的空白。

Description

党参属物种cpSSR分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种党参属物种cpSSR分子标记及其应有。
背景技术
党参属(Codonopsis Wall.)为被子植物门桔梗科党参属多年生草本植物，我国有39种且多数种类的根部具有药用价值。在目前临床应用中，各种党参、珠子参、鸡蛋参等均具有不同程度补脾、生津、催乳、祛痰、止咳、止血、益气、固脱等功效，还具有增加血色素、红血球、白血球，收缩子宫、抑制心动过速等作用。本属中目前利用最为广泛的是党参，现已普遍应用并已形成大宗药材商品的包括川党参、管花党参、灰毛党参、球花党参及新疆党参，由于需要量逐渐增多，本属中可利用的种类不断增多。
尽管党参属物种在医药行业的应用越来越多，但是不同种之间在药用成分及功效上仍有较大差异，又由于党参属物种均具有乳汁，茎直立或缠绕，叶互生、对生、簇生或假轮生，花单生于主茎与侧枝顶端，与叶柄相对，花冠上位，阔钟状、钟状、漏斗状、管状钟形或管状，果为蒴果，带有种子多数，椭圆状、长圆状或卵状，根肥大呈纺锤状或纺锤状圆柱形等相似的表型特征。因此，建立党参属物种准确、有效的鉴定方法是保证党参属药材临床用药的关键。
叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，具有广泛分布着微卫星序列(Chloroplast simplesequence repeats，cpSSR)的独立基因组。与核基因组相比，cpSSR具有进化速度慢、分子量小、相对保守、结构简单和单亲遗传等特点。当前，党参属物种分子标记开发方面主要涉及转录组序列和EST序列基础上开发的SSR标记，有关cpSSR分子标记开发方面仍属于空白状态，因此，进行基于党参cpSSR序列分析、标记开发和标记的有效利用对党参属物种的鉴定、遗传多样性分析等工作可起到重要的推动作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有党参属物种细胞质标记的缺乏，提供一种党参属物种cpSSR分子标记及其应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：党参属物种cpSSR分子标记，特异性扩增所述cpSSR分子标记的PCR引物包括以下五对引物序列：
DSY4-F：5'-CATCCCTTCAATTAGCCT-3'
DSY4-R：5'-GTTCCGTTCCATCTTTCA-3'；
DSY6-F：5'-TGAACCGACGACTTACGC-3'
DSY6-R：5'-GCCGCTATGAGTTTACTGGAT-3'；
DSY9-F：5'-CATCCCTTCAATTAGCCT-3'
DSY9-R：5'-TTCCGTTCCATCTTTCATA-3'；
DSY11-F：5'-CTGACAAGTCGCACTATAAGT-3'
DSY11-R：5'-ATGATGCCTGTTGGTGTT-3'；
DSY8–F：5'-GATAGGCTGGTTCGCTTGA-3'
DSY8–R：5'-GGTCGGGTCGGTAGTTAG-3'。
上述的cpSSR分子标记在筛选或鉴别党参属物种中的应用，利用该标记将轮叶党参物种与其它党参物种区别开。
进一步的，上述应用，包括以下步骤：
1)提取待测党参属物种材料的基因组DNA；
2)以待测党参属物种材料的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的cpSSR分子标记的五个引物对中的任意一对进行PCR扩增；
3)然后通过电泳检测PCR扩增产物；
当引物选择DSY4-F和R，若能够扩增出220bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
当引物选择DSY6-F和R，若能够扩增出200bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
当引物选择DSY9-F和R，若能够扩增出220bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
当引物选择DSY11-F和R，若能够扩增出170bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种；
当引物选择DSY8-F和R，若能够扩增出490bp大小的特异条带，则待测党参属物种为轮叶党参物种。
进一步的，步骤2)中的PCR反应总体系为15μL，包括1×Taq DNA聚合酶Buffer，25mMMgCl2，1.5U Taq酶，15mM dNTPs，cpSSR标记上下游引物各0.2μM、模板DNA40 ng，双蒸水补齐到15μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃～60℃退火45s，72℃延伸1.5min，34个循环，最后72℃延伸5min，
当引物选择DSY4-F和R，退火温度为55℃；
当引物选择DSY6-F和R，退火温度为56℃；
当引物选择DSY9-F和R，退火温度为54℃；
当引物选择DSY11-F和R，退火温度为56℃；
当引物选择DSY8-F和R，退火温度为55℃。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：
l、小党参和秦岭党参叶绿体全基因组序列均为0.17Mb，最近刚公布的轮叶党参核基因组为1273.26Mb。与核基因组序列相比，叶绿体基因组结构简单、分子量小，在位点分析和标记设计方面具周期短、费用低的优点。
2、党参cpSSR标记既具有核基因组SSR标记的共显性和多态性等特点，又具有多拷贝、单亲遗传、不易发生重组等特点。本发明可以填补当前党参无细胞质遗传分子标记的空白，并丰富党参分子标记的类型。
3、由于叶绿体基因组中的简单重复序列主要分布于非编码区，研究表明叶绿体DNA的非编码区序列在不同种群间也存在物种特异性，因此，本发明开发的党参特异性cpSSR标记能全面的反映检测物种的遗传信息，可用于对党参属物种进行准确鉴定和遗传多样性分析。
附图说明
图1为实施例2五对引物在3份党参属材料中的扩增结果(电泳图)；图中M：Marker；1：山西陵川县野生党参；2：轮叶党参；3：大同市栽培党参；箭头表示特异条带。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
小党参cpSSR位点分析
利用MISA软件搜索小党参和秦岭党参叶绿体基因组中的SSR位点，软件设置标准为：basepair，bp 1、2、3、4、5、6bp，重复次数依次不少于10、6、5、5、5、5、5次，复合SSR小于100bp。结果表明，在小党参叶绿体基因组中有29个cpSSR位点，其中，单核苷酸重复基元A/T位点25个，占位点总数的86.20％；二核苷酸重复基元(AT/AT)和三核苷酸重复基元(AAG/CTT)的cpSSR位点各为2个，分别占cpSSR位点总数的6.9％(表1)。
表1党参中不同SSR重复基序
Figure GDA0004056956940000041
党参cpSSR引物设计
利用primer 5.0进行cpSSR标记设计，结合手动对引物进行调整。引物的设计标准为：GC含量在30％～70％，产物大小为100～300bp，Tm值在55℃～65℃之间，上下游引物Tm值差异不超过5℃，引物长度为18～22bp，引物GC含量30％～70％。共设计出120对cpSSR引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
党参cpSSR标记筛选与验证
设计出的引物选取山西陵川县野生党参、轮叶党参、大同市栽培党参3个党参属材料进行PCR反应，PCR扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测，结果发现有5对cpSSR-PCR在各材料间能扩增出特异条带，说明开发的cpSSR-PCR可进行党参属材料的鉴定分析。
实施例2
利用本发明提供的cpSSR分子标记的五对引物进行轮叶党参属物种快速鉴定，包括以下步骤：
(1)材料收集和DNA提取
实验所用材料分别采自山西陵川县野生党参、轮叶党参、大同市栽培党参三个党参属材料，以改良SDS法提取基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度。
(2)党参cpSSR-PCR反应
cpSSR-PCR反应总体系为15μL，包括1×Taq DNA聚合酶Buffer、25mM MgCl2、1.5UTaq酶、15mM dNTPs、cpSSR标记上下游引物各0.2μM、模板DNA40 ng，双蒸水补齐到15μL。cpSSR-PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min、50℃～60℃复性45s、72℃延伸1.5min，34个循环，最后72℃延伸5min。
Figure GDA0004056956940000042
Figure GDA0004056956940000051
(3)党参cpSSR-PCR反应电泳检测
取扩增产物2.5μL与等量6×上样液混合，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180V恒压1h，银染显色。
(4)分析
如图1所示，轮叶党参的材料能够扩增出特异条带，说明本发明开发的cpSSR-PCR可进行党参属材料的鉴定分析。
<110>山西中医药大学
<120>轮叶党参属物种cpSSR分子标记及其应用
<160>10
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY4-F
<400>1
CATCCCTTCAATTAGCCT
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY4-R
<400>2
GTTCCGTTCCATCTTTCA
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY6-F
<400>3
TGAACCGACGACTTACGC
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY6-R
<400>4
GCCGCTATGAGTTTACTGGAT
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY9-F
<400>5
CATCCCTTCAATTAGCCT
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY9-R
<400>6
TTCCGTTCCATCTTTCATA
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY11-F
<400>7
CTGACAAGTCGCACTATAAGT
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY11-R
<400>8
ATGATGCCTGTTGGTGTT
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY8-F
<400>9
GATAGGCTGGTTCGCTTGA
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>轮叶党参属物种cpSSR分子标记的引物DSY8-R
<400>10
GGTCGGGTCGGTAGTTAG

Claims (3)

1.一种党参属物种cpSSR分子标记引物对在筛选或快速鉴定轮叶党参物种中的应用，所述党参属物种cpSSR分子标记引物对碱基序列如下：
DSY4-F：5'-CATCCCTTCAATTAGCCT-3'
DSY4-R：5'-GTTCCGTTCCATCTTTCA-3'；
DSY6-F：5'-TGAACCGACGACTTACGC-3'
DSY6-R：5'-GCCGCTATGAGTTTACTGGAT-3'；
DSY9-F：5'-CATCCCTTCAATTAGCCT-3'
DSY9-R：5'-TTCCGTTCCATCTTTCATA-3'；
DSY11-F：5'-CTGACAAGTCGCACTATAAGT-3'
DSY11- R：5'-ATGATGCCTGTTGGTGTT-3'。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测党参属物种材料的基因组DNA；
2）以待测党参属物种材料的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的cpSSR分子标记引物对中的任意一对进行PCR扩增；
3）然后通过电泳检测PCR扩增产物；
当引物选择DSY4-F和 R，若能够扩增出220bp大小的特异条带，则待测党参属物种材料为轮叶党参物种；
当引物选择DSY6-F和 R，若能够扩增出200bp大小的特异条带，则待测党参属物种材料为轮叶党参物种；
当引物选择DSY9-F和 R，若能够扩增出220bp大小的特异条带，则待测党参属物种材料为轮叶党参物种；
当引物选择DSY11-F和 R，若能够扩增出170bp大小的特异条带，则待测党参属物种材料为轮叶党参物种。
3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2) 中的PCR反应总体系为15 μL，包括1×Taq DNA聚合酶Buffer，25 mM MgCl2，1.5 U Taq酶，15 mM dNTPs，cpSSR标记上下游引物各0.2 μM、模板DNA40 ng，双蒸水补齐到15 μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5 min， 94℃变性1 min，50℃～60℃退火45s，72℃延伸1.5 min，34个循环，最后72℃延伸5 min，
当引物选择DSY4-F和 R，退火温度为55℃；
当引物选择DSY6-F和 R，退火温度为56℃；
当引物选择DSY9-F和 R，退火温度为54℃；
当引物选择DSY11-F和 R，退火温度为56℃。
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