CN113981120B - 鉴别“仙斛系列”铁皮石斛的特异性分子标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鉴别“仙斛系列”铁皮石斛品系的特异性分子标记引物，以及利用该引物对“仙斛系列”铁皮石斛品系进行快速鉴定的方法，所述引物序列如下：上游引物DK001‑F：5’‑AACTGACATGCAAGAGTCGC‑3’；下游引物DK001‑R：5’‑ATCTGCCAGCAAGGATGAGG‑3’。本发明的有益效果主要体现在：采用本发明的特异性分子标记引物(DK001‑F/R)，可快速鉴别仙斛系列铁皮石斛，方法简单、只需要进行PCR和电泳判断条带的有无即可，准确高效、灵敏度高，是表观特征鉴别仙斛系列铁皮石斛所不能替代的分子手段。
Description
技术领域
本发明涉及用于一种鉴别“仙斛系列”铁皮石斛品系的特异性分子标记引物，以及利用该引物对“仙斛系列”铁皮石斛品系进行快速鉴定的方法。
背景技术
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），是兰科石斛属多年生草本植物，别名黑节草、铁皮兰等。生长在海拔达1600米以上半阴湿的山地岩石上，主要分布于我国浙江、安徽、福建等地。铁皮石斛是我国常用中药材植物，李时珍在《本草纲目》上记载：“石斛除痹下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴益精，久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定志除惊，轻身延年”，具滋阴清热、益胃生津、抗癌和免疫调节等功效，1987年我国将其列入国家重点保护植物名录。因其显著的医疗价值和市场价值，在上个世纪八、九十年代遭到了无节制的采挖，加上在野生条件下铁皮石斛繁育率低，导致我国铁皮石斛野生资源已濒临灭绝。从古至今，石斛属名贵药材主要来源于自然的野生资源，但野生资源繁殖率低，加上人为过多采挖，现在石斛类野生资源濒临灭绝，导致其产量和内在质量不稳定，从而影响药材的质量。
随着人民生活水平的提高，对高品质铁皮石斛的需求越来越大，现代药理研究证实铁皮石斛主要的功效成分是石斛多糖，其含量的多少直接决定了药效好坏。《药典》（2010版）规定，铁皮石斛中多糖（以无水葡萄糖C6H1206计）含量应≥25%。目前国内铁皮石斛品种的石斛多糖含量从百分之十几到三十几不等。
“仙斛1号”（浙认药2008003），经权威部门测定，其多糖含量高达47.1%，高于野生铁皮石斛，同时比“云南软脚”和"广西硬脚”分别提高了117.1%和187.2%，是国家药典规定（25%） 的1.88倍，为铁皮石斛行业的巅峰之作。而“仙斛2号”和“仙斛3号”是在“仙斛1号”之后培育的优质铁皮石斛品种，“仙斛2号”多糖含量达58%，是现行药典25%的标准的2倍，堪称石斛中的“超级稻”。该品种于2011年通过了国家相关部门的新品种认证（浙（非）审药2011001）。“仙斛1号”和“仙斛2号”，也是如今国内仅有的两个达到国家药典标准2倍左右的铁皮石斛品种。而“仙斛3号”比“仙斛1号”增产26.8%，“仙斛4号”的产量又显著高于“仙斛1号”，“仙斛2号”和“仙斛3号”，且全年平均多糖含量能达到40%以上。
通过近10年的培育和推广种植结果表明，“仙斛”系列铁皮石斛品种具有生物学特性纯正度和稳定性明显，有效成分和抗逆、抗病能力强，产量高，商品性好等几大优势。为了规范铁皮石斛种质保藏和种苗生产，从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记是实现“仙斛”系列铁皮石斛品种准确快速鉴定的科学途径。
发明内容
本发明目的是提供一种用于鉴别“仙斛系列”铁皮石斛品系的特异性分子标记引物，以及利用该引物对“仙斛系列”铁皮石斛品系进行快速鉴定的方法。
本发明采用的技术方案是：
用于鉴别“仙斛系列”铁皮石斛品系的特异性分子标记引物，其引物序列如下：
上游引物DK001-F：5’- AACTGACATGCAAGAGTCGC -3’；
下游引物DK001-R：5’- ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’。
上述特异性分子标记引物（DK001-F/R）是通过利用SSR引物，对铁皮石斛样品DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，筛选获得特异性条带之后进行测序，再针对特异性条带进行引物设计，再经多次筛选和验证，最终获得的特异性分子标记引物。这对引物对具有极高的专一性，用它们对仙斛系列铁皮石斛进行特异性扩增，“仙斛1号”在250bp~1500bp之间无DNA条带，“仙斛2号”在250bp和1500bp左右有2条DNA条带，“仙斛3号”在1500bp左右有1条DNA条带，“仙斛4号”在250bp左右有1条DNA条带，需要说明的是，本发明特异性分子标记引物仅限于“仙斛系列”铁皮石斛品系的快速鉴定，即待测样品仅限于“仙斛系列”铁皮石斛。
本发明还涉及一种利用所述引物对“仙斛系列”铁皮石斛品系进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测铁皮石斛样品的基因组DNA作为模板，以所述特异性分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果250bp和1500bp之间无DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛1号”；若电泳结果同时出现250bp和1500bp左右的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛2号”；若电泳结果出现唯一1500bp左右的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛3号”；若电泳结果出现唯一250bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛4号”；所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物DK001-F：5’- AACTGACATGCAAGAGTCGC -3’；
下游引物DK001-R：5’- ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’。
该方法的关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系以及反应条件的确定，以及电泳检测步骤，均可按照本领域常规方法进行。
所述PCR扩增条件如下：92~98℃预变性200~500s；92~98℃变性40~60 s，58~64℃退火30~40 s，68~72℃延伸60~90s，共30~35个循环；最后于68~72℃延伸400~600s。
具体的，所述方法如下：
（1）取待测铁皮石斛种质0.3~0.5g，利用CTAB法提取待测样本的基因组DNA；
（2）以步骤（1）所得的基因组DNA为模板，以分子特异性标记引物为扩增引物，进行PCR扩增；
所PCR反应体系组成如下：
2*Taq MasterMix（Dye） 10μL
10 μmol/L 上游引物 1~2μL
10 μmol/L 下游引物 1~2μL
50ng/μL DNA模板 2~4μL
ddH2O 补足至20μL；
PCR扩增条件如下：94℃预变性300s；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸90s，共30~35个循环；最后于72℃延伸600s；
（3）用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测步骤（2）所得的PCR扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照；若电泳结果250bp和1500bp之间无DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛1号”；若电泳结果出现250bp和1500bp左右的两条特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛2号”；若电泳结果出现唯一1500bp左右的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛3号”；若电泳结果出现唯一250bp左右的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛4号”。
本发明的有益效果主要体现在：采用本发明的特异性分子标记引物（DK001-F/R），可快速鉴别仙斛系列铁皮石斛，只需一对引物即可鉴别出四种仙斛系列铁皮石斛品种；方法简单、只需要进行PCR和电泳判断条带的有无即可，准确高效、灵敏度高，是表观特征鉴别仙斛系列铁皮石斛所不能替代的分子手段。
附图说明
图1为采用本发明的特异性分子标记DK001-F/R对仙斛系列铁皮石斛DNA进行PCR扩增后的电泳图；其中通道M为DNA标准分子量Marker DL2000；通道1：“仙斛1号”铁皮石斛，通道2：“仙斛2号”铁皮石斛，通道3：“仙斛3号”铁皮石斛，通道4：“仙斛4号”铁皮石斛。
图2为采用本发明的特异性分子标记DK001-F/R对同一批次的3个不同重复的仙斛系列铁皮石斛DNA进行PCR扩增后的电泳图；其中通道M为DNA标准分子量Marker DL2000；通道1~3：“仙斛1号”铁皮石斛；通道4~6：“仙斛2号”铁皮石斛；通道7~9：“仙斛3号”铁皮石斛；通道10~12：“仙斛4号”铁皮石斛。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：1.待测铁皮石斛种质基因组DNA提取
取待测铁皮石斛种质0.3~0.5g，使用CTAB法提取待测铁皮石斛种质基因组DNA，用1.5%琼脂糖凝胶对所得DNA进行电泳以检测纯度，并利用美国赛默飞世尔公司的NanoDropTM 1000型超微量紫外分光光度计检测DNA浓度，然后稀释至50ng/μL，4度冰箱放置备用。
2.合成特异性分子标记引物
基于铁皮石斛特异序列的分子标记引物，上游引物DK001-F：5’-AACTGACATGCAAGAGTCGC -3’和下游引物DK001-R：5’-ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’，由上海生工合成。
3.特异性分子标记引物（DK001-F/R）的PCR扩增
PCR扩增体系（总体积20μL）：2*Taq MasterMix（Dye）10μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL， DNA模板（50ng/μL）2μL，ddH2O 6μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；33个循环（94℃变性40秒，退火温度（58℃）复性40秒，72℃延伸90秒）；最后72℃延伸10分钟。
4.电泳检测
取步骤（3）PCR扩增产物5~10 μL，利用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1所示。
按照上述方法，利用特异性分子标记DK001对铁皮石斛种质进行检测，电泳图见图1，其中编号为1的为“仙斛1号”铁皮石斛个体，250bp和1500bp之间未扩增出的特异性DNA条带；编号为2的为“仙斛2号”铁皮石斛个体，同时扩增出250bp和1500bp左右的DNA条带；其中编号为3的为“仙斛3号”铁皮石斛个体，只扩增出一条1500bp左右的DNA条带；编号为4的为“仙斛4号”铁皮石斛个体，只扩增出一条250bp左右的DNA条带。
这表明本发明的特异性分子标记DK001具有极高的专一性，因此可以用于快速区分“仙斛系列”铁皮石斛品系。
实施例2：稳定性试验
按照实施例1方法，利用特异性分子标记DK001对同一批次的4个品种（系）不同重复的“仙斛系列”铁皮石斛种质进行检测，结果见图2，得到一致性结果：
编号为1~3的为“仙斛1号”铁皮石斛个体，250bp和1500bp之间未扩增出的特异性DNA条带；编号为4~6的为“仙斛2号”铁皮石斛个体，同时扩增出250bp和1500bp左右的DNA条带；其中编号为7~9的为“仙斛3号”铁皮石斛个体，只扩增出一条1500bp左右的DNA条带；编号为10~12的为“仙斛4号”铁皮石斛个体，只扩增出一条250bp左右的DNA条带。
这表明本发明的特异性分子标记DK001确实可以用于快速区分“仙斛系列”铁皮石斛品系。
序列表
<110> 浙江寿仙谷医药股份有限公司
金华寿仙谷药业有限公司
浙江寿仙谷植物药研究院有限公司
<120> 鉴别“仙斛系列”铁皮石斛的特异性分子标记引物及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (4)
1.用于鉴别“仙斛系列”铁皮石斛品系的特异性分子标记引物，其引物序列如下：
上游引物DK001-F：5’- AACTGACATGCAAGAGTCGC -3’；
下游引物DK001-R：5’- ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’
其中，所述“仙斛系列”铁皮石斛品系为“仙斛1号”、“仙斛2号” “仙斛3号” 和“仙斛4号”。
2.一种利用权利要求1所述引物对“仙斛系列”铁皮石斛品系进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测铁皮石斛样品的基因组DNA作为模板，以所述特异性分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果250bp和1500bp之间无DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛1号”；若电泳结果出现250bp和1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛2号”；若电泳结果出现唯一1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛3号”；若电泳结果出现唯一250bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛4号”；所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物DK001-F：5’- AACTGACATGCAAGAGTCGC -3’；
下游引物DK001-R：5’- ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’。
3.如权利要求2所述的方法， 其特征在于所述PCR扩增条件如下：92~98℃预变性200~500s；92~98℃变性40~60 s，58~64℃退火30~40 s，68~72℃延伸60~90s，共30~35个循环；最后于68~72℃延伸400~600s。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）取待测铁皮石斛种质0.3~0.5g，利用CTAB法提取待测样本的基因组DNA；
（2）以步骤（1）所得的基因组DNA为模板，以分子特异性标记引物为扩增引物，进行PCR扩增；
所PCR反应体系组成如下：
2*Taq MasterMix（Dye） 10μL
10 μmol/L 上游引物 1~2μL
10 μmol/L 下游引物 1~2μL
50ng/μL DNA模板 2~4μL
ddH2O 补足至20μL；
PCR扩增条件如下：94℃预变性300s；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸90s，共30~35个循环；最后于72℃延伸600s；
（3）用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测步骤（2）所得的PCR扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照；若电泳结果250bp和1500bp之间无DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛1号”；若电泳结果出现250bp和1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛2号”；若电泳结果出现唯一1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛3号”；若电泳结果出现唯一250bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛4号”。
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| CN110878376A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-03-13 | 安徽师范大学 | 用于鉴定霍山石斛的ssr分子标记引物及其应用 |
| CN113502348A (zh) * | 2021-08-10 | 2021-10-15 | 浙江寿仙谷医药股份有限公司 | 一种用于鉴定“仙芝系列”灵芝菌种的分子标记glmi001引物对和应用 |
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
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| 李明焱等.铁皮石斛新品种"仙斛1号"的选育及其特征特性研究.《中国现代应用药学》.2011,第28卷(第4期),全文. * |
| 李明焱等.铁皮石斛新品种"仙斛2号"的选育和特征特性研究.《中国药学杂志》.2013,第48卷(第19期),全文. * |
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