CN113151558B - 一种基于八爪金龙转录组的ssr分子标记及其鉴定方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法与应用，属于生物技术学领域。本发明的SSR分子标记引物包括BZJL‑44、BZJL‑47和BZJL‑49。该方法操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服现有技术难以揭示八爪金龙基原物种间的亲缘关系，不能全面系统地进行遗传多样性和群体选择分析的问题。本发明提供的SSR分子标记可用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴定，在八爪金龙基原鉴别中具有重要作用，同时可用于八爪金龙指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术学领域，具体涉及一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法，和该SSR分子标记在八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金鉴别中的应用。
背景技术
苗药八爪金龙(Jab bik lik jib，加比利吉)是贵州地区少数民族常用药，性冷，属热经，具有清热解毒、散瘀止痛、祛风除湿的功能，主要用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、心胃气痛、劳伤吐血、跌扑损伤、风湿骨痛等病症，具有较高的临床药用价值。然而，在生产应用中有3个药用植物的干燥根及根茎被当作八爪金龙基原药材使用，包括紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims、百两金Ardisia crispa(Thunb.)A.DC.或红凉伞Ardisiacrenata Sims var.bicolor(Walker)C.Y.Wu et C.Chen。朱砂根、红凉伞和百两金在外观形态、结构上极其相似，但化学成分及含量差异明显，不同基原药材的功效也存在差异。同时原料药材市场充斥各种近缘物种的根茎冒充药材，严重影响了八爪金龙的质量和临床用药安全。
目前，对八爪金龙基原的鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别、DNA条形码等，相关表型鉴定方法难以对八爪金龙基原进行区分。DNA条形码序列分辨率较低，并不能很好地明确物种界限，难以揭示八爪金龙基原物种间的亲缘关系。如现有技术【基于ITS2序列的朱砂根及其混伪品分子鉴定-陈新连等-中国现代中药】利用ITS2序列对朱砂根及其混伪品进行鉴定，ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品，但无法鉴定其变种红凉伞；现有技术【基于ITS2序列的矮地茶药材基因识别-答国政等-中药材】利用ITS2序列对紫金牛属矮地茶药材进行基因识别研究时，发现朱砂根和红凉伞在NJ树中混为一支，无法鉴别分开。目前不同基原八爪金龙遗传进化关系研究还相对较少，尚无高效可靠的鉴别技术公开。
SSR(简单重复序列)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于重复次数和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。SSR分子标记广泛应用于评价种质资源、分析遗传多样性和构建遗传图谱研究，较其他分子标记技术，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。
SSR分子标记目前已被用于研究群体内的遗传变异和群体间的遗传分化。SSR是由2-6个核苷酸重复组成，其重复次数和重复程度不同，呈现出多态性。SSR两端的序列通常为保守的单拷贝序列，可设计相应的特异性引物，对每个位点的微卫星序列进行扩增，经过PCR之后，检测其多态性。如现有技术【三叶青种质资源遗传多样性的SSR荧光标记分析-尹明华等-中草药】利用8个SSR标记对64份三叶青种质的遗传多样性和亲缘关系进行分析，为三叶青种质资源的利用和品种选育提供参考；现有技术【基于叶绿体基因和微卫星的中国西南地区特有种泡核桃谱系地理学和群体结构研究-孙祎蔚-西北大学】利用EST-SSR标记技术，揭示了中国西南地区两个亲缘关系较近的核桃群体结构、遗传多样性和基因交流情况。
本发明利用SSR分子标记技术，通过建立有效的八爪金龙基原鉴定方法，对其遗传样性和遗传结构进行深入分析，明确八爪金龙的起源和亲缘关系，可直接用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴别，为八爪金龙基原鉴定及其近缘物种鉴定提供有力的技术支持，将有利于明确八爪金龙种质间遗传变异关系，优选出质量较好且稳定的居群，实施分子辅助育种，提高育种效率，进而推进药用种质资源有效利用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金鉴别困难、成本高、检测时间长、误差大等问题，提供一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法。将该SSR分子标记技术用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴别，该方法分辨率高、稳定可靠、简单高效，可直接用于八爪金龙基原鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，为八爪金龙基原鉴定及其近缘物种鉴定提供有力的技术支持。
本发明的目的将通过如下技术方案达到：
一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记，所述SSR分子标记引物名称为BZJL-44、BZJL-47和BZJL-49，各引物对应的核苷酸序列为：
如本发明所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，包括如下步骤：
第一步：采用Trinity软件对八爪金龙基原朱砂根和百两金的转录组数据进行组装，利用MIST软件对1kb以上的Unigene进行SSR位点筛选，按照不同重复次数对2～6个碱基重复单元的微卫星片段进行筛选分离。利用Primer3在线软件在微卫星两端的侧翼序列设计特异性SSR引物50对。引物设计的主要原则为：引物长度控制在20bp±2bp，退火温度60℃±2℃，GC含量在40％～60％之间。
所述的特异性引物对应的核苷酸序列如SEQ ID 1～SEQ ID 100所示：
第二步：提取出待测样品八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的DNA，利用紫外分光光度计法检测DNA浓度。
所述样品DNA提取步骤为：
(1)处理材料：取新鲜植物组织100mg，加入液氮充分研磨。再加入400uL缓冲液LP1和6uL RNase A(10mg/mL)，旋涡振荡1min，室温放置10min。
(2)加入130uL缓冲液LP2，充分混匀，漩涡振荡1min。
(3)12000rpm(～13400xg)离心5min，将上清液移至新的离心管中。
(4)加入1.5倍体积的缓冲液LP3(预先加入了无水乙醇)，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW(预先加入了无水乙醇)，12000rmp(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)重复操作步骤(6)。
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，以12000rpm(～13400xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm(～13400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。
第三步：设置PCR扩增体系以及扩增程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的DNA对特异SSR引物进行PCR扩增，筛选多态性SSR标记进行FAM荧光标记。
所述PCR扩增体系为：扩增体系总体积为20μL，含2×Taq PCR Master mix 10μL、上下游引物各0.4μL，1μL DNA，8.2μL ddH2O，混合均匀后置于PCR仪中扩增。
所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min，采用梯度PCR，直至预期产物清晰单一。
多态性荧光标记SSR引物核苷酸序列如SEQ ID 87、SEQ ID 88、SEQ ID 93、SEQ ID94、SEQ ID 97、SEQ ID 98所示：
第四步：设置PCR反应体系以及反应程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对第三步的多态性荧光标记引物进行PCR扩增。
所述PCR扩增体系为：取八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA各1μL，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix10μL，荧光标记EST-SSR引物上下游引物各0.4μL，并通过ddH2O定容至20μL，进行PCR扩增。
所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
第五步：琼脂糖凝胶电泳检测：利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测第四步的PCR扩增产物，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上进行成像分析，检测八爪金龙基原样品的SSR基因序列的PCR扩增情况；
第六步：毛细管电泳检测八爪金龙SSR基因序列分型：采用3730xl设备分别检测PCR扩增后八爪金龙基原样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图，检测出八爪金龙基原SSR基因序列分型。
所述毛细管电泳检测步骤为：取900～1000μL HIDI溶液和5～15μL LIZ500溶液混合均匀，加入到96孔反应板中，每孔加入10μL，在96孔板对应的孔中加入PCR扩增后的八爪金龙基原DNA样品，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1100～1300rmp离心10s，进行毛细管电泳检测。
第七步：SSR标准分型峰值谱图构建：利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
第八步：数据分析：根据PCR检测结果，构建二元矩阵，其中有峰值的标为1，缺失标为0。每个基因座的PIC使用PowerMarker 3.25软件计算，PIC值范围为0.33～0.68，平均值为0.53。通过UPGMA法进行聚类分析，通过聚类分析发现各地区八爪金龙样品遗传相似性系数(GS)范围在0.39～1.00，以0.45位阈值时可分为三组。使用STRUCTURE软件对群体结构进行分析，根据遗传相似性计算K从1变化到10时ln似然平均值，当K＝3时，ΔK值达到最大，则认为该K值为最佳祖先模型。
一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记，所述SSR分子标记应用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴定。
有益效果
1、本发明利用SSR分子标记技术获得了3个多态性八爪金龙SSR分子标记，这3个分子标记能很好地鉴别八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金，本发明操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服现有技术利用性状鉴别、显微鉴别、DNA条形码鉴定方法难以区分八爪金龙基原的缺点，克服了ITS2序列无法鉴别八爪金龙基原红凉伞的缺陷，在不同八爪金龙基原的鉴别中发挥重要作用。
2、本发明的这3个SSR分子标记可用于八爪金龙基原鉴定、近缘物种鉴定及亲缘关系的分析，是具有很好的重复性，高多态性，可靠有效的分子标记，本发明为八爪金龙种质资源保护提供技术支持，能推进药用种质资源的规范化生产和有效利用。
3、本发明的荧光标记SSR分子引物的扩增产物信号清晰，试验所用的87个样品扩增片段大小差异明显，可精确计算片段大小，每个DNA样品电泳峰型各异，易于判断。可方便快速地将朱砂根、百两金和红凉伞分开，具有操作方便、灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。
4、本发明从50对特异性引物中筛选得到三对SSR荧光标记引物，其多态性丰富，特异性强，适用于SSR标准分型峰值谱图的构建。
5、本发明采用峰值谱图对检测结果进行比对，对八爪金龙的鉴别快速准确，每个DNA样品电泳峰型各异，检测灵敏度高，易于判断。
6、本发明方法通过毛细管电泳检测八爪金龙基原植物，比对SSR分型峰值谱图，操作简便易行。
7、本发明提供的荧光标记引物可用于八爪金龙指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，为八爪金龙种质资源保护、规范化生产提供理论和技术支持，应用前景十分广阔。
附图说明
图1为本发明八爪金龙转录组1kb以上Unigene序列中SSR分析结果统计(横坐标轴上c表示复合型重复SSR、p1表示单碱基重复SSR、p2表示双碱基重复SSR、p3表示三碱基重复SSR、p4表示四碱基重复SSR、p5表示五碱基重复SSR、p6表示六碱基重复SSR)。
图2为本发明八爪金龙转录组SSR长度分布。
图3为本发明50对特异性引物琼脂糖凝胶电泳检测图。
图4为本发明基于SSR标记的八爪金龙群体UPGAM法聚类分析图。
图5为本发明基于SSR标记的八爪金龙群体结构分析结果图。
具体实施方式
实施例1
一、八爪金龙SSR分子标记引物设计
第一步：采用Trinity软件对八爪金龙基原朱砂根和百两金的转录组数据进行组装，利用MIST软件对1kb以上的Unigene进行SSR位点筛选，按照不同重复次数对2～6个碱基重复单元的微卫星片段进行筛选分离。利用Primer3在线软件在微卫星两端的侧翼序列设计特异性SSR引物50对，特异引物对应的核苷酸序列如SEQ ID 1～SEQ ID 100所示。引物设计的主要原则为：引物长度控制在20bp±2bp，退火温度60℃±2℃，GC含量在40％～60％之间。
二、样品DNA提取
提取待测样品八爪金龙基原朱砂根(Ardisia crenata Sims)、百两金(Ardisiacrispa(Thunb.)A.DC.)、红凉伞(Ardisia crenata Sims var.bicolor(Walk)C.Y.Wu etC.Chen)的DNA，利用紫外分光光度计法检测DNA浓度。
样品DNA按以下步骤提取：
(1)处理材料：取新鲜植物组织100mg，加入液氮充分研磨。再加入400uL缓冲液LP1和6uL RNase A(10mg/mL)，旋涡振荡1min，室温放置10min。
(2)加入130uL缓冲液LP2，充分混匀，漩涡振荡1min。
(3)12000rpm(～13400xg)离心5min，将上清液移至新的离心管中。
(4)加入1.5倍体积的缓冲液LP3(预先加入了无水乙醇)，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW(预先加入了无水乙醇)，12000rmp(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)重复操作步骤6.
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，以12000rpm(～13400xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm(～13400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。
三、多态性荧光标记引物确定
设置PCR扩增体系以及扩增程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的DNA对特异SSR引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：扩增体系总体积为20μL，含2×Taq PCRMaster mix 10μL、上下游引物各0.4μL，1μL DNA，8.2μL ddH2O，混合均匀后置于PCR仪中扩增。扩增程序为：95℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min，采用梯度PCR，直至预期产物清晰单一。筛选多态性SSR标记进行FAM荧光标记。多态性荧光标记SSR引物核苷酸序列如SEQ ID 87、SEQ ID 88、SEQ ID 93、SEQ ID 94、SEQ ID 97、SEQ ID 98所示。
四、PCR扩增
设置PCR扩增体系以及扩增程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对多态性荧光标记SSR引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：取八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA各1μL，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix10μL，荧光标记EST-SSR引物上下游引物各0.4μL，并通过ddH2O定容至20μL，进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
五、PCR扩增产物检测
琼脂糖凝胶电泳检测：利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测第三步PCR扩增后产物，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上进行成像分析，检测八爪金龙基原的SSR基因序列的PCR扩增情况。
毛细管电泳检测八爪金龙SSR基因序列分型：采用3730xl设备分别检测PCR扩增后八爪金龙基原样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图，检测出八爪金龙基原SSR基因序列分型。
毛细管电泳检测步骤为：取900～1000μL HIDI溶液和5～15μL LIZ500溶液混合均匀，加入到96孔反应板中，每孔加入10μL，在96孔板对应的孔中加入PCR扩增后DNA样品，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1100～1300rmp离心10s，进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LZ500进行比较，确定目标DNA片段的大小。
六、SSR标准分型峰值谱图构建
利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
七、数据分析
根据PCR结果，构建二元矩阵，其中有峰值的标为1，缺失标为0。每个基因座的PIC使用PowerMarker 3.25软件计算，PIC值范围为0.33～0.68，平均值为0.53。通过UPGMA法进行聚类分析，通过聚类分析发现各地区八爪金龙样品遗传相似性系数(GS)范围在0.39～1.00，以0.45位阈值时可分为三组。使用STRUCTURE软件对群体结构进行分析，根据遗传相似性计算K从1变化到10时ln似然平均值，当K＝3时，ΔK值达到最大，则认为该K值为最佳祖先模型。
为了进一步证实本发明的可行性，发明人通过大量的试验进行了验证，部分试验内容摘录如下：
1试验样品
本试验共收集87份样品，包括朱砂根(Ardisia crenata Sims)、百两金(Ardisiacrispa(Thunb.)A.DC.)、红凉伞(Ardisia crenata Sims var.bicolor(Walk)C.Y.Wu etC.Chen)(表1)，由贵州中医药大学魏升华教授鉴定分别为朱砂根、百两金、红凉伞。
表1：87份八爪金龙样品
2八爪金龙SSR分子标记及荧光标记引物的确定
对八爪金龙基原朱砂根和百两金转录组测序得到raw reads后进行数据过滤，去除掉低质量、包含接头和未知碱基N含量过高的reads，得到高质量的clean reads。利用Trinity软件对clean reads进行重头组装，用cd-hit软件去除完全一样的序列，然后使用tgicl进行聚类，合并相似度大于90％，overlap长度大于35的序列，最后得到Unigene。利用鉴定单重复序列的软件MISA(Microsatellite identification tool)对转录组数据中1kb以上的Unigene进行SSR位点的检测(见图1)，然后使用Primer3对检测到的SSR进行引物设计。按照单碱基、双碱基、三碱基重复分别至少12，6，5次，四碱基、五碱基、六碱基都不少于4次的标准进行检索分析。最后对获得的SSR数据进行分类统计分析。利用Primer3在线软件在微卫星两端的侧翼序列设计特异50对EST-SSR引物，引物核苷酸序列如SEQ ID 1～SEQID 100所示。
引物设计的主要原则：引物长度控制在20bp±2bp，退火温度60℃±2℃，PCR产物长度在100～300bp之间，GC含量在40％～60％之间。
利用所述的特异引物对朱砂根、红凉伞和百两金进行PCR扩增，其中：扩增体系总体积为20μL，含2×Taq PCR Master mix 10μL、上下游引物各0.4μL，1μL DNA，8.2μLddH2O，混合均匀后置于PCR仪中扩增。扩增程序为：95℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min，采用梯度PCR，直至预期产物清晰单一。
最后筛选出3个多态性SSR标记，将筛选出的多态性SSR引物进行FAM荧光染料标记，八爪金龙多态性荧光标记引物如表2所示。
表2：开发获得的3个八爪金龙多态性SSR荧光标记引物
3.利用本发明提供的SSR分子标记区分八爪金龙基原
3.1 DNA提取
将本试验的87份八爪金龙基原样品按如下步骤进行DNA提取：
A.处理材料：取新鲜植物组织100mg，加入液氮充分研磨。再加入400uL缓冲液LP1和6uL RNase A(10mg/mL)，旋涡振荡1min，室温放置10min。
B.加入130uL缓冲液LP2，充分混匀，漩涡振荡1min。
C.12000rpm(～13400xg)离心5min，将上清液移至新的离心管中。
D.加入1.5倍体积的缓冲液LP3(预先加入了无水乙醇)，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。
E.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
F.向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW(预先加入了无水乙醇)，12000rmp(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
G.重复操作步骤F.
H.将吸附柱CB3放回收集管中，以12000rpm(～13400xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
I.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm(～13400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。
3.2 PCR扩增
设置PCR反应体系以及反应程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对多态性SSR荧光标记引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：取八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA各1μL，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix10μL，多态性SSR荧光标记引物上下游引物各0.4μL，并通过ddH2O定容至20μL，进行PCR扩增。所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
3.3琼脂糖凝胶电泳检测
利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测第三步PCR扩增后产物，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上进行成像分析，检测八爪金龙基原的SSR基因序列的PCR扩增情况。
3.4毛细管电泳检测
取900～1000μL HIDI溶液和5μL～15μL LIZ500溶液混合均匀，加入到96孔反应板中，每孔加入10μL；在96孔板对应的孔中加入PCR扩增后DNA样品；使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1100～1300rmp离心10s，进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LZ500进行比较，确定目标DNA片段的大小。
3.5数据分析
根据PCR结果，构建二元矩阵，其中有峰值的标为1，缺失标为0。每个基因座的PIC使用PowerMarker 3.25软件计算，PIC值范围为0.33～0.68，平均值为0.53。
通过UPGMA法进行聚类分析(见图4)，通过聚类分析发现各地区八爪金龙样品遗传相似性系数(GS)范围在0.39～1.00，以0.45位阈值时可分为三组。
使用STRUCTURE软件对群体结构进行分析(见图5)，根据遗传相似性计算K从1变化到10时ln似然平均值，当K＝3时，ΔK值达到最大，则认为该K值为最佳祖先模型。
结果显示，百两金的遗传信息来源于同一祖先群体与其他群体的遗传组成拥有较大差异，湖北朱砂根存在与百两金和红凉伞基因交流情况，贵州贵阳白云区、情人谷、开阳、贵州长顺及贵州雷公山的朱砂根和红凉伞来源于同一祖先群体，贵州惠水、江西武功山朱砂根与贵州中医药大学种植的红凉伞来自于同一祖先群体。整体而言，各个八爪金龙群体的遗传信息组成较为复杂。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 贵州中医药大学
<120> 一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记及其鉴定方法与应用
<141> 2021-04-21
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-1 F序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcttggcg taagaggaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-1 R序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagccagaca cggagaagac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-2 F序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctcaaaaca accccaaaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-2 R序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgacacgtc ggatgtagga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-3 F序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaaaagcg aagcaaggag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-3 R序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaagttcca ccctgacagt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-4 F序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacaaaaagc tcgtttgcct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-4 R序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctcagggat tggatttgaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-5 F序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgtatttgt gcattggttg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-5 R序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcaagtcaa acgagaggag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-6 F序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tagaatctct tcagggccga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-6 R序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtcaagagg actggtggaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-7 F序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgggccatg agagagacac 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> BZJL-7 R序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggatcacaca tgcatatcat ca 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-8 F序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccctctctct tgctcgctaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-8 R序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtggccaaga ttcccctatt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-9 F序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttccccaaat caacagcttc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-9 R序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgatcccgat ctctctcatc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> BZJL-10 F序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gggttatgtc atgtgagacc aa 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-10 R序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tttggacaaa ccaagtgtgc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-11 F序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aagtgaatcg gtaagcgtgg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-11 R序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtgagggggt cgtagaatca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-12 F序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aggtcaaaat cgtgcaaacc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-12 R序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aatttgggat gacacggatg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-13 F序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgaagacgcg atctgaagtg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-13 R序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccaatacaac ccatttccca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-14 F序列(Artificial Sequence)
<400> 27
catcacctca aaaccagcct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-14 R序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcgatggaga aatccacctc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-15 F序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cacgaatccg ttcgatcttt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-15 R序列(Artificial Sequence)
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tctcggttgt atccacctcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-16 F序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caccgttcac cacgatgtag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-16 R序列(Artificial Sequence)
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gccctctggc atccatataa 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-17 F序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcaattggga aacacaacga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-17 R序列(Artificial Sequence)
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aaaatgatgc cccaaacaaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-18 F序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aacataaccg tcaaccaggc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-18 R序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aactcctcca gtttccacca 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-19 F序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acagttcacc cgtcctcaac 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-19 R序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cccagaaagc taagatccca 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-20 F序列(Artificial Sequence)
<400> 39
attgcgagca atgaggagtt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-20 R序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcactccttg agaccagtcc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-21 F序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acaaccctcg aactgtgacc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-21 R序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acattctcct cccagcattg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-22 F序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tctccattgc gacttgtgag 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-22 R序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcccaaacat cctgtgagat 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-23 F序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tctccattgc gacttgtgag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-23 R序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ccggtgtcat ctctctcaca 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-24 F序列(Artificial Sequence)
<400> 47
taaaataaag ggagcgccaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-24 R序列(Artificial Sequence)
<400> 48
taaaataaag ggagcgccaa 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-25 F序列(Artificial Sequence)
<400> 49
agtctgagtt gtcgatgggg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-25 R序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gaggtgcagg tcttcctgag 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-26 F序列(Artificial Sequence)
<400> 51
atatggcgga caccgtagag 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-26 R序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttcacagggc ttcttcgttt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-27 F序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcctccgttc ctctttctct 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-27 R序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agaacgatgt tatcgggcac 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-28 F序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agagagaaac cctatcccgc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-28 R序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cgtccgatta aacacacacg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-29 F序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttcccattca tgtccaaagg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-29 R序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gggctgcata agtttggtgt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-30 F序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aagaccttct tcgggtccat 20
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> BZJL-30 R序列(Artificial Sequence)
<400> 60
aagaaatggg agtttcaggg a 21
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-31 F序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gtccccatcg gtcttagtga 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-31 R序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gtgttgtttg tagcgagcca 20
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> BZJL-32 F序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ccctagggtt atcatctcat ctc 23
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-32 R序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgaacttcac gagcctcctt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-33 F序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gctgctcaag aacttgctcc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-33 R序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tagttcccca tcctgcaaag 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-34 F序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tatcctcacc accttcccaa 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-34 R序列(Artificial Sequence)
<400> 68
atgagggaaa attaggggga 20
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> BZJL-35 F序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ccaaaaatct catcaatggc t 21
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-35 R序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gaattcgcct tggtttacga 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-36 F序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tacaaggcca atccaggaag 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-36 R序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cacgcacgag tgtagagagg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-37 F序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cattagcccc tttctctccc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-37 R序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ctccgaagag ctgcgaatag 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-38 F序列(Artificial Sequence)
<400> 75
caggagaatg ggggtttctt 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-38 R序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gaccctgttt gacgaggtgt 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-39 F序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tcgattggga ttttctccag 20
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> BZJL-39 R序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tcaatgagtc gtcctgtcct c 21
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-40 F序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gagctgttcc gaagtcttgc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-40 R序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tttgatttct ccaattcccg 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-41 F序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gtgtacagcg ttgtgttgcc 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-41 R序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ttcggatttc agtgctttcc 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-42 F序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gtgaggaaag gatggtttgg 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-42 R序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gcggcgaaaa tagtaagtgg 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-43 F序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gctctctctc caccaagacg 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-43 R序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tccagtagag gaggtggtgg 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-44 F序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tcgccaccat ctctctctct 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-44 R序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cctgattcag cttcagctcc 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-45 F序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tttcatcttc cccgtctttg 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-45 R序列(Artificial Sequence)
<400> 90
atgtggcttg atgtgctacg 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-46 F序列(Artificial Sequence)
<400> 91
aattccaatc cccttccaac 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-46 R序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gccttggtaa ttcgtggcta 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-47 F序列(Artificial Sequence)
<400> 93
atctctccct ccaatggctt 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-47 R序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gtcgatgaac cggagattgt 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-48 F序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cttccaagat cctccatcca 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-48 R序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ttcccataaa gcgttgaacc 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-49 F序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cctagaatcg ccgcagttag 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-49 R序列(Artificial Sequence)
<400> 98
aaagacgaga tcgaaaccga 20
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> BZJL-50 F序列(Artificial Sequence)
<400> 99
aatcatccct caacctactc ct 22
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> BZJL-50 R序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tcagcagcga gaataccctt 20
Claims (9)
1.一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，SSR分子标记引物名称为BZJL-44、BZJL-47和BZJL-49，各引物对应的核苷酸序列为：
所述鉴定方法包括如下步骤：
1)特异性引物设计：采用Trinity软件对八爪金龙基原朱砂根和百两金的转录组数据进行组装，利用MIST软件进行SSR位点筛选，按不同重复次数对2～6个碱基重复单元的微卫星片段进行筛选分离，利用Primer3软件在微卫星两端的侧翼序列设计出特异性SSR引物；
2)样品DNA提取：提取出待测样品八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的DNA，检测DNA浓度；
3)进行PCR扩增筛选多态性引物，并对特异性引物进行荧光标记：设置PCR扩增体系以及扩增程序，分别以八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对特异SSR引物进行PCR扩增，筛选多态性SSR标记进行FAM荧光标记，FAM荧光标记引物序列如SEQ ID NO. 87、SEQID NO. 88、SEQ ID NO. 93、SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 98所示；
4)利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增：设置PCR反应体系以及反应程序，分别以裂解后的八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA对步骤3)的荧光标记引物进行PCR扩增；
5)琼脂糖凝胶电泳检测：利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤4)PCR扩增产物，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上进行成像分析，检测八爪金龙基原样品的SSR基因序列的PCR扩增情况；
6)毛细管电泳检测八爪金龙SSR基因序列分型：采用3730xl设备分别检测PCR扩增后八爪金龙基原样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图，检测出八爪金龙基原SSR基因序列分型；
7)SSR标准分型峰值谱图构建：利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
2.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，引物设计原则为：引物长度控制在20bp±2bp，退火温度60℃±2℃，GC含量为40％～60％之间。
3.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，设计出特异性SSR引物50对，所述的特异引物如SEQ ID NO. 1～SEQ IDNO. 100所示。
4.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述PCR扩增体系为：扩增体系总体积为20μL，含2×Taq PCR Master mix10μL、上下游引物各0.4μL，1μL DNA，8.2μL ddH2O，混合均匀后置于PCR仪中扩增。
5.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min，采用梯度PCR，直至预期产物清晰单一。
6.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增体系为：取步骤2)裂解后的八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金样品DNA各1μL，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix 10μL、已合成的SSR基因序列荧光标记引物上下游引物各0.4μL，并通过ddH2O定容至20μL，进行PCR扩增。
7.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，35次循环，每个循环包括94℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
8.根据权利要求1所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法，其特征在于，步骤6)中，所述毛细管电泳检测步骤为：取900～1000μL HIDI溶液和5～15μL LIZ500溶液混合均匀，加入到96孔反应板中，每孔加入10μL，在96孔板对应的孔中加入PCR扩增后的八爪金龙基原DNA样品，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1100～1300rmp离心10s，进行毛细管电泳检测。
9.如权利要求1～8任一项所述的一种基于八爪金龙转录组的SSR分子标记的鉴定方法应用于八爪金龙基原朱砂根、红凉伞和百两金的鉴定。
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