CN111443154A

CN111443154A - 一种甘草属药用亲缘关系的研究方法

Info

Publication number: CN111443154A
Application number: CN202010435185.4A
Authority: CN
Inventors: 刘育辰; 刘刚; 袁思文
Original assignee: Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Xinjiang Longhuiyuan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: CN111443154B

Abstract

本发明公开了一种甘草属药用亲缘关系的研究方法。包括有建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量，然后建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱，基于不同基源甘草中化学成分含量和双波长HPLC指纹图谱及相似度确定甘草属药用亲缘关系。本发明具有简单可靠的特点，为我国药用甘草种质资源分类鉴定、收集保存、合理开发利用及优良品种选育提供理论依据，同时希望能够找到野生优质甘草的替代资源，解决野生甘草资源严重匮乏的问题，对甘草资源的保护和可持续利用、促进甘草药材产业化生产的良好发展、保证甘草药材质量以及临床用药的安全性和有效性等方面都具有重要的科学意义和现实意义。

Description

一种甘草属药用亲缘关系的研究方法

技术领域

本发明涉及一种亲缘关系的研究方法，特别是一种甘草属药用亲缘关系的研究方法。

背景技术

甘草，豆科植物多年生草本，多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带。甘草属Glycyrrhiza Linn.全球约20个物种，在亚洲、欧洲、澳洲、美洲等地都有分布，我国有8个种，分为2个组——甘草组Sect.Glycyrrhiza和刺果甘草组Sect.Pseudoglycyrrhiza E.U.Krug.，其中，甘草组Sect.Glycyrrhiza中包含甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.又名洋甘草)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflate Batal.)、无腺毛甘草(Glycyrrhiza eglandulosa X.Y.Li.)和粗毛甘草(Glycyrrhiza aspera Pall.)5个物种，刺果甘草组Sect.PseudoglycyrrhizaE.U.Krug.包含刺果甘草(Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.)、云南甘草(Glycyrrhizayunnanensis Cheng f.et L.K.Dai exP.C.Li)和圆果甘草(Glycyrrhiza squamulosaFranch.)3个物种。甘草根与根状茎粗壮，气微，味甜而特殊，是其主要的药用和化工用部位。2015版《中华人民共和国药典》中明确指出我国药用甘草为甘草(G.uralensisFisch.)、光果甘草(G.glabra L.)及胀果甘草(G.inflata Bat.)的干燥根及根茎。具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。

甘草的药用和商用价值很高。在我国，甘草作为大宗药材，素有“十方九草”之称，且由于其无毒，可以药食同源，被《神农本草经》列为上品。此外，甘草还用于生活、畜牧和化工的多个方面。作为甘草产出大国，我国甘草资源丰富，但也确实存在诸多问题：

甘草全球分布范围较广，在亚洲、欧洲、澳洲、美洲等地均有分布，我国甘草更是遍布了黄河以北的各个省份以及云南四川等地。由于不同地区之间甘草的生存环境差异较大，导致不同地区甘草的遗传差异较大。

甘草广泛的药用和商用价值促使甘草需求量逐年增加，野生甘草资源因大量采挖急剧下降。尽管建国以来，国家对其进行了资源保护的同时，并大力提倡人工种植，但部分研究结果表明，栽培甘草和野生甘草的有效成分含量差异较大，甚至部分栽培甘草的质量根本达不到《中华人民共和国药典》标准。

此外，本发明研究人员还发现：人工种植甘草中存在诸多变异和杂交现象，很难界定它的分类以及明确其是否为药用甘草基源物种，这就使得甘草用药的安全性和有效性受到了很大质疑。

从国外引进优良甘草种质进行选育或直接进口采购也是解决国内甘草市场资源短缺的问题的可行方法之一，但全球甘草属下物种较多，国外甘草种属在我国是否适合药用也是我们需要亟待解决的问题。

除以上原因外，有些地区将非《药典》中规定的其它甘草物种作为甘草收购和使用，如在新疆石河子等地，因为无腺毛甘草根和根茎有甜味，在当地将其作为甘草收购和使用；此外，还有云南甘草、粗毛甘草在当地也有作药用甘草使用的习惯。研究甘草的著名教授李学禹先生也指出民间将刺果甘草作为药用。虽然他同时指出刺果甘草并非商品药材，但甘草作为根茎类药材，属内各物种外形相似，不易区分，故混用现象也屡见不鲜，药用情况混乱，严重影响了临床用药的有效性和安全性。

基于以上原因，我们发现，想要维持甘草市场的稳定发展，甘草属植物资源的保护、优质品种的筛选和属内物种的准确鉴别显得尤为重要。而亲缘关系研究是解决上述问题的基础和有效方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种甘草属药用亲缘关系的研究方法。本发明具有简单可靠的特点，为我国药用甘草种质资源分类鉴定、收集保存、合理开发利用及优良品种选育提供理论依据，同时希望能够找到野生优质甘草的替代资源，解决野生甘草资源严重匮乏的问题，对甘草资源的保护和可持续利用、促进甘草药材产业化生产的良好发展、保证甘草药材质量以及临床用药的安全性和有效性等方面都具有重要的科学意义和现实意义。

本发明的技术方案：一种甘草属药用亲缘关系的研究方法，包括有建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量，然后建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱，基于不同基源甘草中化学成分含量和双波长HPLC指纹图谱及相似度确定甘草属药用亲缘关系。

前述的甘草属药用亲缘关系的研究方法中，所述建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量包括有以下步骤；

(1)对照品溶液的制备：精密称取芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、甘草酸、半甘草异黄酮B、光甘草定、芹糖异甘草苷、异甘草苷、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草香豆素、甘草查尔酮A和甘草酚适量分别于50mL容量瓶中，以50％乙醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为0.0156、0.0319、0.0032、0.0040、0.0816、0.0016、0.0048、0.0101、0.0005、0.0008、0.0040、0.0002、0.0020mg·mL^-1的混合对照品溶液；

(2)分别取不同基源甘草药材粉末0.200g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50mL，密塞，称定重量，超声提取30min，取出，放置至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，通过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，作为试品溶液；

(3)将试品溶液与混合对照品溶液分别进行液相色谱进样测定，将色谱对比后，并分别计算出试品溶液中芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、甘草酸、半甘草异黄酮B、光甘草定、芹糖异甘草苷、异甘草苷、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草香豆素、甘草查尔酮A和甘草酚的含量；

所述建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱包括有以下步骤；

(4)分别取不同基源甘草药材粉末0.200g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50mL，密塞，称定重量，超声提取30min，取出，放置至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，通过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，作为试品溶液；

(5)将试品溶液按进行梯度洗脱，记录色谱图谱，得到265nm HPLC图谱和365nmHPLC图谱，将265nm HPLC图谱和365nm HPLC图谱与国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱进行对比，得到不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱及相似度。

前述的甘草属药用亲缘关系的研究方法中，所述步骤(3)中的色谱条件为：

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MG Ⅱ 250mm×4.6mm ID，5μm；

流动相：

流速：0.8mL·min^-1

检测波长：265nm和365nm

柱温：30℃

进样量：20μL；

前述的甘草属药用亲缘关系的研究方法中，所述步骤(5)中的色谱条件为：

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MG Ⅱ 250mm×4.6mm ID，5μm；

流动相：

流速：0.8mL·min^-1

检测波长：265nm和365nm

柱温：30℃

进样量：20μL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、由亲缘相近的种不但外形相似，由于遗传上的联系，生理生化特性也相似，因而所含的化学成分往往也比较相似，药用植物的生理活性成分大都属于植物次生代谢产物，而次生代谢产物之间的差异和生物合成途径与植物的演化方向息息相关，植物的亲缘关系和化学成分及疗效存在很密切的联系性、相关性，因此从化学成分的角度上运用多指标含量测定结合HPLC指纹图谱的鉴定技术可以快速全面了解不同基源甘草中的化学成分，找出其代谢标识物，对不同基源的甘草进行系统归类，准确鉴定物种之间的亲缘关系是行之有效的方法。

2、甘草中的化学成分是其具药用疗效的物质基础，不同基源甘草中的化学成分在种类和含量应该有所差异。使用液相色谱技术对不同基源甘草中的化学成分进行研究，建立同时测定不同基源甘草中多种指标性成分含量的方法并结合双波长指纹图谱及相似度的方法，从含量和指纹图谱两个方面分别探讨甘草属药用亲缘关系，对甘草后期进行优良品种选育以及扩大药用甘草资源，指导临床安全、有效地用药将具有重要的现实意义。

发明人进行大量的实验研究，以下是部分实验研究：

1、实验例：检测方法研究

第一章建立同时测定不同基源甘草中14种化学成分含量的方法

1.1材料与方法

1.1.1仪器与试剂

试验仪器：日本岛津LC-20AD高效液相色谱仪(二元梯度泵，自动进样器，PDA检测器)；SB-5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；EX 225 DZH十万分之一天平(美国奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

试验试剂：芹糖甘草苷(纯度98％，批号CHB170901，购于成都克洛玛生物科技有限公司)；甘草苷(纯度98％，批号CHB160307，购于成都埃法生物科技有限公司)；芹糖异甘草苷(纯度98％，批号AB17060712，购于成都埃法生物科技有限公司)；芒柄花苷(纯度98％，批号CHB171026，购于成都克洛玛生物科技有限公司)；甘草素(纯度98％，批号AF8052202，购于成都埃法生物科技有限公司)；甘草酸(纯度98％，批号CHB160225，购于成都克洛玛生物科技有限公司)；光甘草定(纯度98％，批号AF8012905，购于成都埃法生物科技有限公司)；半甘草异黄酮B(纯度98％，批号CHB170421，购于成都克洛玛生物科技有限公司)；异甘草苷(纯度98％，批号AF8052203，购于成都埃法生物科技有限公司)；刺甘草查尔酮(纯度98％，批号AF8060603，购于成都埃法生物科技有限公司)；异甘草素(纯度98％，批号AF7070801，购于成都埃法生物科技有限公司)；甘草香豆素(纯度98％，批号CHB170608，购于成都克洛玛生物科技有限公司)；甘草查尔酮A(纯度98％，批号AF8060602，购于成都埃法生物科技有限公司)；甘草酚(纯度98％，批号CHB170609，购于成都克洛玛生物科技有限公司)。乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.1.2液相色谱条件

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MG Ⅱ(250mm×4.6mm ID，5μm)

流动相：

流速：0.8mL·min^-1

检测波长：265nm和365nm

柱温：30℃

进样量：20μL

1.1.3色谱条件的考察

1.1.3.1检测波长的确定

取芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、甘草酸、半甘草异黄酮B、光甘草定的50％乙醇溶液，经PDA检测器在190～400nm处进行全波长扫描，芹糖甘草苷的最大吸收波长为228nm，甘草苷的最大吸收波长为276nm，芒柄花苷的最大吸收波长为249nm，甘草素的最大吸收波长为275nm，甘草酸的最大吸收波长为249nm，半甘草异黄酮B的最大吸收波长为261nm，光甘草定的最大吸收波长为228nm，见图1-7。为了选择同时满足7种成分的检测波长，经过对6种成分紫外吸收图谱的叠加分析，在260～270nm之间，6种成分有着相近的吸收强度，所以选择265nm作为检测波长。

取芹糖异甘草苷、异甘草苷、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草香豆素、甘草查尔酮A及甘草酚的50％乙醇溶液，经PDA检测器在190～400nm处进行全波长扫描，芹糖异甘草苷的最大吸收波长为361nm，异甘草苷的最大吸收波长为361nm，刺甘草查尔酮的最大吸收波长为368nm，异甘草素的最大吸收波长为369nm，甘草香豆素的最大吸收波长为351nm，甘草查尔酮A的最大吸收波长为375nm，甘草酚的最大吸收波长为347nm，见图7-14。为了选择同时满足7种成分的检测波长，经过对7种成分紫外吸收图谱的叠加分析，在360～370nm之间，7种成分有着相近的吸收强度，所以选择365nm作为检测波长。

1.1.3.2流动相的确定

流动相组成考察：经考察，甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.05％醋酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.05％甲酸水中乙腈-0.05％甲酸水的分离效果最好，作为最终洗脱系统。

流动相梯度考察：在以下梯度中，13种色谱峰均可以较好的分开，且色谱峰响应值最大，故梯度洗脱条件确定为：

1.1.3.3柱温的选择

分别考察了不同柱温(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)下色谱图的分离效果，结果表明在30℃时，分离效果最好。

1.1.3.4流速的选择

分别考察了在不同流速(0.6mL·min^-1，0.8mL·min^-1，1.0mL·min^-1，1.2mL·min^-1)下色谱峰的分离情况，结果表明，当流速为0.8mL·min^-1时分离效果好且节约试剂。所以流动相流速确定为0.8mL·min^-1。

1.2正交试验法优选提取方法

通过查阅文献和预实验，在供试品溶液提取过程中，溶剂浓度、溶剂体积和超声时间对所测化合物的含量影响较大，选择甘肃兰州的甘草药材，通过正交试验优选提取条件。

确定正交试验设计的因素与水平(表1-1)，设计L₉(3⁴)的正交试验表设计实验方案如表1-3。甘肃兰州甘草药材粉末按表1-3设计方案进行超声提取，按1.3.2项下方法制备供试品溶液，按1.1.2项下色谱条件测定，试验安排与结果见表1-2～1-4。以乙醇浓度、提取溶剂体积、提取时间为自变量，选择芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、甘草酸、半甘草异黄酮B、光甘草定、芹糖异甘草苷、异甘草苷、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草香豆素、甘草查尔酮A及甘草酚这13种成分提取总量为指标。

表1-1甘草中13种成分提取方法正交试验因素设计

Table 1-1 Design of orthogonal experimental factors for extraction of13 components in G.uralensis

表1-3正交试验设计的结果

Table 1-3 Results of orthogonal test design

表1-4方差分析表

Table 1-4 Analysis of variance

根据对方差和极差的综合分析可以发现，B因素有显著性影响即溶剂体积是甘草中13种化学成分的最主要影响因素，B＞C＞A即溶剂体积＞提取时间＞乙醇浓度。最佳工艺条件为A₂B₃C₁即乙醇浓度为50％，溶剂体积为50mL，提取时间为30min。

对优选的提取方法进行验证，取3份2.000g甘肃兰州甘草药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇500mL，按1.3.2项下方法制备供试品溶液，按1.1.2项下色谱条件测定芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、甘草酸、半甘草异黄酮B、光甘草定、芹糖异甘草苷、异甘草苷、刺甘草查尔酮、异甘草素、甘草香豆素、甘草查尔酮A及甘草酚13种成分的含量，并计算出13种成分的总含量。3次试验中13种成分总含量的平均值为97.18mg·g^-1，RSD为3.24％，优化的提取条件简便、快捷、稳定可靠。

表1-2正交试验方案下甘草中13种成分的含量

Table 1-2 Contents of 13 components in G.uralensis under orthogonaltest protocol

综上所述，本发明具有简单可靠的特点，为我国药用甘草种质资源分类鉴定、收集保存、合理开发利用及优良品种选育提供理论依据，同时希望能够找到野生优质甘草的替代资源，解决野生甘草资源严重匮乏的问题，对甘草资源的保护和可持续利用、促进甘草药材产业化生产的良好发展、保证甘草药材质量以及临床用药的安全性和有效性等方面都具有重要的科学意义和现实意义的有益效果。

附图说明

图1是芹糖甘草苷的紫外吸收图谱；

图2是甘草苷的紫外吸收图谱；

图3是芒柄花苷的紫外吸收图谱；

图4是甘草素的紫外吸收图谱；

图5是甘草酸的紫外吸收图谱；

图6是半甘草异黄酮B的紫外吸收图谱；

图7是光甘草定的紫外吸收图谱；

图8是芹糖异甘草苷的紫外吸收图谱；

图9是异甘草苷的紫外吸收图谱；

图10是刺甘草查尔酮的紫外吸收图谱；

图11是异甘草素的紫外吸收图谱；

图12是甘草香豆素的紫外吸收图谱；

图13是甘草查尔酮A的紫外吸收图谱；

图14是甘草酚的紫外吸收图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种甘草属药用亲缘关系的研究方法，具体如下：包括有建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量，然后建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱，基于不同基源甘草中化学成分含量和双波长HPLC指纹图谱及相似度确定甘草属药用亲缘关系。

所述建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量包括有以下步骤；

所述步骤(3)中的色谱条件为：

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MG Ⅱ 250mm×4.6mm ID，5μm；

流动相：

所述建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱包括有以下步骤；

所述步骤(5)中的色谱条件为：

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MG Ⅱ 250mm×4.6mm ID，5μm；

流动相：

流速：0.8mL·min^-1

检测波长：265nm和365nm

柱温：30℃

进样量：20μL。

Claims

1.一种甘草属药用亲缘关系的研究方法，其特征在于：包括有建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量，然后建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱，基于不同基源甘草中化学成分含量和双波长HPLC指纹图谱及相似度确定甘草属药用亲缘关系。

2.根据权利要求1所述的甘草属药用亲缘关系的研究方法，其特征在于：所述建立同时测定不同基源甘草中化学成分含量包括有以下步骤；

所述建立不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱包括有以下步骤；

(5)将试品溶液按进行梯度洗脱，记录色谱图谱，得到265nm HPLC图谱和365nm HPLC图谱，将265nm HPLC图谱和365nm HPLC图谱与国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱进行对比，得到不同基源甘草双波长HPLC指纹图谱及相似度。

3.根据权利要求2所述的甘草属药用亲缘关系的研究方法，其特征在于：所述步骤(3)中的色谱条件为：

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MGⅡ250mm×4.6mm ID，5μm；

流动相：

流速：0.8mL·min^-1

检测波长：265nm和365nm

柱温：30℃

进样量：20μL。

4.根据权利要求2所述的甘草属药用亲缘关系的研究方法，其特征在于：

所述步骤(5)中的色谱条件为：

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK-C₁₈MGⅡ250mm×4.6mm ID，5μm；

流动相：

流速：0.8mL·min^-1

检测波长：265nm和365nm

柱温：30℃

进样量：20μL。