CN110638990B - 一种桂枝芍药知母处方制剂提取物的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桂枝芍药知母处方制剂活性成分的提取方法，它包括如下步骤：1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片，粉碎，混匀；2)加12‑16倍量水提取，提取时间1‑2h，提取次数3‑4次。本发明通过出膏率、桂枝中的桂皮醛、白芍中的芍药苷、知母中的芒果苷、甘草中的甘草酸以及炎症因子IL‑6作为提取工艺的评价指标，并采用信息熵赋权法确定各指标的客观权重，进行综合评价，得到的桂枝芍药知母处方制剂的最佳提取工艺，该工艺稳定可行，重复性好，制备得到的提取物药效成分含量高，抗炎作用显著，可用于大批量生产。

Description

一种桂枝芍药知母处方制剂提取物的提取工艺
技术领域
本发明具体涉及一种桂枝芍药知母处方制剂提取物的提取工艺。
背景技术
桂枝芍药知母处方制剂是由桂枝、白芍、知母、甘草、防风、白术、生姜、麻黄和附子(炮)等9味饮片组成的复方制剂，处方出自《金匮要略·中风历节病脉证治篇》，为治疗痹症的经典名方，具有祛风除湿、温经散寒、滋阴清热的功效。
中药制剂一般是复方，处方中的药味组成少则几味，多则十几味，甚至几十味，成分构成极其复杂，而复方中药的临床疗效往往又体现在复方配伍的综合作用和整体效应上，欲制成疗效高、体积小、浓度大、规格统一的制剂，必须经过提取及精制处理，以去粗取精，去伪存真。如何能够将药味中有效成分最大限度地提取出来，同时尽可能将无效物质除去，是中药现代化的一个重要问题。
而目前桂枝芍药知母处方制剂的提取工艺一般采用煎煮提取的方式，同时在提取时提取溶剂的用量和提取时间控制不当，使有效成分损失大，无效杂质不能被去除，无法达到去粗取精的目的，药效欠佳。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种桂枝芍药知母处方制剂提取物的提取工艺，它包括如下步骤：
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片，粉碎，混匀；
2)加12-16倍量水回流提取1-2h，共提取3-4次。
进一步地，步骤2)所述加16倍量水回流提取1-1.5h，共提取3～4次。
更进一步地，步骤2)所述加16倍量水回流提取1h，共提取3～4次；
或：
加16倍量水回流提取1.5h，共提取3次。
更进一步地，步骤2)所述加16倍量水回流提取1h，共提取3次或4 次；
进一步地，步骤2)所述加14倍量水回流提取1h或2h，共提取4次；
或：
加12倍量水回流提取2h，共提取3次。
进一步地，所述桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片是由如下重量份的原料药组成：
桂枝8.4-15.6份、白芍6.3-11.7份、知母8.4-15.6份、防风8.4-15.6份、白术10.5-19.5份、麻黄5.2-7.8份、甘草5.2-7.8份、生姜10.5-19.5份、附子 5.2-7.8份。
更进一步地，所述桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片是由如下重量份的原料药组成：
桂枝12份、白芍9份、知母12份、防风12份、白术15份、麻黄6份、甘草6份、生姜15份、附子6份。
更进一步地，所述附子是经河砂炮制后的附子。
进一步地，所述回流提取温度为98-100℃。
本发明还提供了一种前述的提取工艺制备的桂枝芍药知母处方制剂提取物。
本发明通过出膏率、桂枝中的桂皮醛、白芍中的芍药苷、知母中的芒果苷、甘草中的甘草酸以及炎症因子IL-6作为提取工艺的评价指标，并采用信息熵赋权法确定各指标的客观权重，进行综合评价，得到的桂枝芍药知母处方制剂的最佳提取工艺，该工艺稳定可行，重复性好，制备得到的提取物药效成分含量高，抗炎作用显著，可用于大批量生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1样品及桂皮醛HPLC色谱图
图2样品及芍药苷HPLC色谱图
图3样品及芒果苷HPLC色谱图
图4样品及甘草酸HPLC色谱图
图5不同给药浓度对细胞存活率的影响
图6不同给药浓度对炎症因子IL-6含量的影响
具体实施方式
实施例1、桂枝芍药知母处方制剂提取物制备
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片：桂枝12g、白芍9g、知母12g、防风12g、白术15g、麻黄6g、甘草6g、生姜15g、附子(河沙炮制)6g，粉碎，混匀；
2)加16倍量水100℃回流提取1h，共提取次数3次，过滤，合并滤液，即得。
实施例2、桂枝芍药知母处方制剂提取物制备
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片：桂枝12g、白芍9g、知母12g、防风12g、白术15g、麻黄6g、甘草6g、生姜15g、附子(河沙炮制)6g，粉碎，混匀；
2)加16倍量水100℃回流提取1h，共提取次数4次，过滤，合并滤液，即得。
实施例3、桂枝芍药知母处方制剂提取物制备
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片：桂枝12g、白芍9g、知母12g、防风12g、白术15g、麻黄6g、甘草6g、生姜15g、附子(河沙炮制)6g，粉碎，混匀；
2)加16倍量水100℃回流提取1.5h，共提取次数3次，过滤，合并滤液，即得。
实施例4、桂枝芍药知母处方制剂提取物制备
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片：桂枝12g、白芍9g、知母12g、防风12g、白术15g、麻黄6g、甘草6g、生姜15g、附子(河沙炮制)6g，粉碎，混匀；
2)加14倍量水100℃回流提取1h，共提取次数4次，过滤，合并滤液，即得。
实施例5、桂枝芍药知母处方制剂提取物制备
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片：桂枝12g、白芍9g、知母12g、防风12g、白术15g、麻黄6g、甘草6g、生姜15g、附子(河沙炮制)6g，粉碎，混匀；
2)加14倍量水99℃回流提取2h，共提取次数4次，过滤，合并滤液，即得。
实施例6、桂枝芍药知母处方制剂提取物制备
1)取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片：桂枝12g、白芍9g、知母12g、防风12g、白术15g、麻黄6g、甘草6g、生姜15g、附子(河沙炮制)6g，粉碎，混匀；
2)加12倍量水98℃回流提取2h，共提取次数3次，过滤，合并滤液，即得。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
1仪器与材料
岛津LC-2030C3D高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；FA1204C电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；UPH-I-10T优普超纯水器(成都超纯科技有限公司)； SB-3200DT超声波清洗机(宁波新艺超声波设备有限公司)；DZTW电子调温电热套(邦西仪器科技(上海)有限公司)；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；Agilent Eclipse Plus C18色谱柱 (4.6mm×250mm，5μm)；SHIMADZU Shim-pack GIST-C18色谱柱 (4.6mm×150mm，5μm)；Emax Plus酶标仪(BiochromLtd Cambrigde)。
本研究中所用的饮片均由好医生医药集团有限公司提供，如表1所示，经成都中医药大学黄勤挽教授鉴定，按2015年版《中国药典》方法检测，均符合相关项下规定，对照品桂皮醛(批号：110710-201821，纯度：99.6％)、对照品芍药苷(批号：110736-201842，纯度：97.4％)、对照品芒果苷(批号： 111607-201704，纯度：98.1％)、对照品甘草酸铵(批号：110731-201619，纯度：93.0％)均购于中国食品药品检定研究院，乙腈(色谱纯，Sigma公司)，其他试剂均为分析纯，试验用水为实验室自制超纯水。IL-6ELISA试剂盒(批号：A30690153)、MTT Cell Proliferation Assay Kit(批号：A86710643)均购于杭州联科生物技术有限公司。
表1桂枝芍药知母处方制剂的饮片来源
Figure BDA0002233121890000041
Figure BDA0002233121890000051
2方法与结果
2.1桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸的定量测定
2.1.1对照品溶液的制备
分别精密称取桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸铵(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为105.06μg.mL-1、 268μg.mL-1、182μg.mL-1和0.291mg.mL-1的对照品储备液。分别精密移取对照品储备液适量，加甲醇稀释成系列浓度的对照品溶液，备用。
2.1.2供试品溶液的制备
精密量取复方水提液25mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀， 0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.3阴性样品溶液的制备
精密量取缺桂枝、缺白芍、缺知母、缺甘草的阴性提取液25mL，置于 100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.4色谱条件
色谱条件见表2；色谱图见图1-4。
表2各指标成分色谱条件
Figure BDA0002233121890000052
Figure BDA0002233121890000061
2.1.5线性关系考察
分别精密吸取对照品系列浓度的溶液，按“2.1.4”项下色谱条件进样检测分析，以各对照品浓度为横坐标(X)，各自峰面积为纵坐标(Y)，分别进行线性回归，得各成分线性回归方程、相关系数(R2)及线性范围分别为桂皮醛Y＝76166X+31265，R2＝0.9999，线性范围为3.27～104.64μg.mL-1；芍药苷 Y＝14.031X+9.2517，R2＝1.0000，线性范围为8.16～261.03μg.mL-1；芒果苷 Y＝44122X+19406，R2＝0.9999，线性范围为1.39～89.27μg.mL-1；甘草酸 Y＝6385.4X+1.7756，R2＝1.0000，线性范围为0.001～0.033mg.mL-1。结果表明，在相应进样范围内各成分线性关系良好。
2.1.6仪器精密度试验
取对照品溶液按“2.1.4”项下色谱条件连续进样6次，测定各成分色谱峰峰面积。结果桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸峰面积的RSD分别为 0.12％，1.47％，0.89％，0.35％，表明仪器精密度良好。
2.1.7稳定性试验
取供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24h进样分析，测定桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸各成分峰面积，计算各成分含量，结果桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸RSD分别为1.01％，0.72％，0.36％，1.44％，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.1.8重复性试验
按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1.4”项下色谱条件测定。计算求得桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸的平均含量(n＝6)分别为0.505， 2.595，0.705，1.414mg.g-1，RSD分别为1.42％，1.62％，1.69％，0.05％，表明该方法重复性良好。
2.1.9加样回收率实验
精密吸取已经测定的供试品溶液1mL，共6份，分别置于10mL量瓶中，精密加入对照品溶液1mL，甲醇2mL，依次测定峰面积并计算各成分加样回收率。结果桂皮醛、芍药苷、芒果苷和甘草酸加样回收率分别为99.29％， 101.09％，102.33％和103.03％；RSD分别为0.54％，1.17％，1.53％和0.54％，表明该方法回收率良好。
2.2出膏率测定
精密吸取水溶液25mL，置已恒重的蒸发皿中，蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，精密称定重量，计算出膏率。结果见表4。
2.3炎症因子IL-6的测定
2.3.1供试品制备
取按照实施例1制备的桂枝芍药知母汤复方水提掖200mL，真空冷冻干燥，制得桂枝芍药知母汤物质基准冻干粉。精密称取物质基准冻干粉0.25g，加蒸馏水配制成浓度为0.125g.mL-1的溶液作为储备液。
2.3.2 MTT检测
消化离心，细胞重悬，计数，5000个每孔种于96孔板；用DMEM培养基(含有10％FBS)培养12h后，细胞贴壁，吸弃培养基，换上含有 50ng.mL-1TNF-α和不同浓度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg.mL-1)的含药培养基(100μL/孔)，培养24h；避光条件下，每孔加入20μL 5mg/mL的 MTT液体，继续培养4h后弃上清液，每孔加入150μL Formazan溶液，轻轻震荡至formazan全部溶解，在570nm测定吸光度。
结果如图5所示，桂枝芍药知母提取液具有抑制MH7A(由TNF-α造模) 增殖的作用，IC50为1.02mg.mL-1，故确定后续给药浓度为0.125～1mg.mL-1。
2.3.3 IL-6试剂盒测定炎症因子
消化离心，细胞重悬，计数，5000个每孔种于96孔板；用DMEM培养基(含有10％FBS)培养12h后，细胞贴壁，吸弃培养基，换上含有 50ng.mL-1TNF-α和不同浓度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg.mL-1)的含药培养基(100μL/孔)，培养24h后取上清液，按Elisa试剂盒操作说明书进行测定，结果见图6。
从图6可知桂枝芍药知母提取液具有抗炎活性，且呈剂量依赖性，且给药浓度为1mg·mL-1时，抗炎活性最强，故以该给药浓度进行后续不同工艺提取液中IL-6炎症因子的测定。结果见表4。
2.4优化桂枝芍药知母处方制剂提取工艺
2.4.1试验方案
根据药物性质、结合生产实际及前期预实验，以料液比(A)，提取时间(B)，提取次数(C)为考察因素，设计Box-Behnken试验设计，结果见表4。
2.4.2试验结果
按“2.1.4”项下色谱条件测定4种成分的含量，按“2.2”项下条件测定出膏率，按“2.3.3”条件测定IL-6，结果见表4。
2.4.3信息熵方法对数据的分析
信息熵是系统不确定性和无序程度的度量，除了度量数据包含的信息量，还可用于在多指标评价系统中用来确定各指标权重。该法是将每个评价指标作为1个随机变量，计算该指标的熵权系数，其取值变异程度越大，越无序，提供的信息量越多，该指标就越重要；反之该指标就越不重要。用熵权法确定权重的计算步骤如下。
(1)原始数据矩阵归一化，建立原始评价指标矩阵；设m个评价指标n 个评价对象的原始数据矩阵为A＝(aij)mn，对其归一化后得到R＝(xij)mn，对大者为优的指标而言，按照以下公式归一化： Xij＝(aij-min{aij,...,anj})/(max{a1j,...,anj}-min{a1j,...,anj})。Xij表示第i次试验时第j 个评价指标的取值，i＝1，2，3，…，m；j＝1，2，3，…，n。
(2)将原始数据阵(Xij)mn转换为概率矩阵(Pij)mn；在信息熵公式中 Pi为某个信息的概率，满足0≤Pi≤1，因此必须先对矩阵(Xij)mn做归一化处理，经处理后的矩阵可视为指标的概率矩阵。其中Pij表示第j次试验在第i个评价指标下的概率。
Figure BDA0002233121890000081
(3)计算指标的熵值，确定第i个评价指标的信息熵(Hi)。
Figure BDA0002233121890000082
(4)计算指标的熵权系数(Wj)。
Figure BDA0002233121890000083
由此公式可知，当信息熵值越小，熵权系数越大，即当Xij值相差越大，表明该指标传递的信息量越多，作用越大，其权重值越大。通过计算，结果见表3。
表3各成分相关指标数据
Figure BDA0002233121890000084
表4试验方案及结果
Figure BDA0002233121890000091
从表4可见：用多成分为指标的综合比较加体外细胞实验方式的评价手段得到：当料液比为12，提取时间2h，提取次数3次时，桂枝芍药知母提取物中的有效成分相对较高，其中甘草酸的含量最高；当料液比为16，提取时间1.5h，提取次数3次时，桂枝芍药知母提取物中的桂皮醛含量相对较高，抗炎活性最强；当料液比为16，提取时间1h，提取次数3或4次，或料液比为14，提取时间1或2h，提取次数4次时，桂枝芍药知母提取物的综合评分大于90，有效成分最大限度地被提取出来，药效显著，为最优提取工艺，该工艺简单可行、提取物质量稳定，效果显著。
综上，本发明通过出膏率、桂枝中的桂皮醛、白芍中的芍药苷、知母中的芒果苷、甘草中的甘草酸以及炎症因子IL-6作为提取工艺的评价指标，并采用信息熵赋权法确定各指标的客观权重，进行综合评价，得到的桂枝芍药知母处方制剂的最佳提取工艺，该工艺稳定可行，重复性好，可用于大批量生产。

Claims (3)

1.一种桂枝芍药知母处方制剂提取物的提取工艺，其特征在于：它包括如下步骤：
1) 取桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片，粉碎，混匀；
2）加16倍量水回流提取1h，共提取3或4次；
或：加14倍量水回流提取1h或2h，共提取4次；
所述桂枝芍药知母处方制剂的配方饮片是由如下重量份的原料药组成：
桂枝12份、白芍9份、知母12份、防风12份、白术15份、麻黄6份、甘草6份、生姜15份、附子6份；
所述附子是经河砂炮制后的附子。
2.根据权利要求1所述提取工艺，其特征在于：所述回流提取温度为98 - 100℃。
3.权利要求1~2任意一项所述的提取工艺制备的桂枝芍药知母处方制剂提取物。
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