CN110118846B

CN110118846B - 桃核承气汤物质基准的建立方法

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Publication number: CN110118846B
Application number: CN201910234669.XA
Authority: CN
Inventors: 李春花; 顿佳颖; 郑鹏; 李佳佳; 王舒淇; 张秀芳
Original assignee: Hebei University of Chinese Medicine
Current assignee: Hebei University of Chinese Medicine
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN110118846A

Abstract

桃核承气汤物质基准的建立方法，属于中药制药技术领域。包括以下步骤，确立提取工艺，采用高效液相法进行有效成分色谱的确定和含量测定，测定出膏率并建立指纹图谱。首先基于传统制剂工艺制备桃核承气汤传统汤剂，测定出膏率确定，采用高效液相色谱法建立指纹图谱共有模式，通过对照品指认色谱峰，在此基础上，测定苦杏仁苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、桂皮醛及甘草酸的含量，可用于进行桃核承气汤质量考察。

Description

桃核承气汤物质基准的建立方法

技术领域

本发明属于中药制药技术领域，具体涉及桃核承气汤物质基准的建立方法。

背景技术

桃核承气汤由大黄、桃仁、炙甘草、桂枝、芒硝五味药组成，原方出自张仲景《伤寒论》辨太阳病脉证并治太阳病证篇：“太阳病不解，热结膀胱，其人如狂，血自下，下者愈。其外不解者，尚未可攻，当先解其外。外解已，但少腹急结者，乃可攻之，宜桃核承气汤”。本方为治疗瘀热互结，膀胱蓄血症的常用方。临床应用以少腹急结，神志异常，脉沉实或涩为辩证要点。组方中有活血化瘀药有桃仁，泻热软坚祛瘀药有大黄、芒硝，通经散瘀药有桂枝，益气药有甘草。方中桃仁与桂枝，属于相使配伍，破血通经；大黄与芒硝，属于相须配伍，泻热祛瘀；桃仁与大黄、芒硝，属于相使配伍，桃仁助大黄、芒硝软坚祛瘀，大黄、芒硝助桃仁破血化瘀；桃仁与甘草，属于相反相使配伍，相反者，补泻同用，桃仁破血，甘草益气，相使者，益气帅血行瘀。方药相互为用，以奏泻热祛瘀，通经益气之效。

现代研究表明桃核承气汤除治疗下焦蓄血证外还可广泛用于其他系统疾病的治疗。王历等研究发现，桃核承气汤有促进修复受损组织结构和促进代谢的功效，对提高盆腔炎大鼠局部免疫能力有一定的作用。谢华等证实桃核承气汤具有抑制血小板聚集和血栓形成作用。杨琴芳等发现桃核承气汤可能通过提高抗凋亡基因表达，而起到减轻

脑出血后的继发性神经元损伤的效果。李慧林等认为桃核承气汤加味方可以改善糖尿病的“三多”症状，控制血压，降低空腹血糖。赵艳明等人发现桃核承气汤可以有效延缓肾小球硬化，减缓脂质过氧化过程，减轻对肾脏的损伤。黄西戎等运用桃核承气汤治疗子宫内膜异位症患者，血浆催乳素，雌二醇含量水平均有明显下降，血液流变学指标多数有不同程度的改善。目前，对桃核承气汤的研究多为药理学的研究，提取工艺、含量测定及指纹图谱研究较少，缺少系统研究。

发明内容

针对现有方法的不足，本发明是建立桃核承气汤物质基准的方法。

桃核承气汤物质基准建立方法，其特征在于，区里提取工艺，如基于古籍确定传统提取工艺，采用高效液相法进行有效成分含量测定，测定出膏率并建立指纹图谱，包括以下步骤：

⑴饮片选取：桃仁15克，大黄60克，桂枝30克，炙甘草30 克，芒硝30克，鉴定符合2015版药典一部相关项下规定；《伤寒论》对甘草的炙法只是在脚注中标上“炙”字。“炙”按其《说文解字》解释为“炮肉也，从肉从火”，是一种直火加热法，即在火上烤。炒甘草，即药房所购生甘草，放入铁锅，炒至颜色变为深黄，即可。

⑵桃核承气汤传统汤剂的制备：取步骤⑴中饮片桃仁、大黄、桂枝、炙甘草，加1400ml水煮至500ml，过滤，加入芒硝，缓慢加热沸腾，得桃核承气汤传统汤剂。

⑶桃核承气汤浓缩液的制备：将步骤⑵中滤液继续浓缩至60ml，得桃核承气汤浓缩液；

⑷出膏率的测定：取步骤⑶中浓缩液，水浴蒸干，冷冻干燥法测定出膏率即所得膏液除以原材料的质量然后乘以100％；

⑸有效成分含量的测定及指纹图谱的建立：采用高效液相色谱法建立指纹图谱共有模式，通过苦杏仁苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、桂皮醛及甘草酸混合对照品液确定指认共有的色谱峰，在此基础上，确定桃核承气汤传统汤剂中对应的成分并测定桃核承气汤传统汤剂中苦杏仁苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、桂皮醛及甘草酸的含量；桃核承气汤传统汤剂和混合对照品液的高效液相色谱法色谱条件均为：Diamonsil C18(5 μm,250×4.6mm)，流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱： 0-5min，15％乙腈；5-10min，15％-20％乙腈；10-30min，20％乙腈； 30-55min，20％-50％乙腈；55-70min，50％乙腈；70-85min，50％-80％乙腈；85-90min，80％-100％乙腈；90-95min，100％乙腈；体积流量 1.0ml/min；进样量10μL；柱温30℃；其中苦杏仁苷检测波长为210nm，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、甘草酸检测波长为250nm，桂皮醛检测波长为290nm；上述梯度洗脱过程中每个时间段内的乙腈占总流动相的体积百分含量是匀速提升的，如0-5min，15％乙腈；5-10min，15％-20％乙腈；表示：在0-5min内，流动相中乙腈的体积百分含量恒定为15％，在5-10min内，流动相中乙腈的体积百分含量从15％逐渐提高的20％；建立对混合对照品液中各物质的浓度或含量与峰面积的线性关系，检测待测桃核承气汤传统汤剂中各物质的峰面积，从而得到各物质的浓度或含量，即得到相应的有效成分的含量。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明提供桃核承气汤物质基准的建立方法及相关工艺参数，“经典名方物质基准”是指古代医籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。物质基准的研究对于经典名方药物的开发至关重要，本发明采用高效液相色谱法同时测定多指标成分，测定出膏率，并建立指纹图谱的测定方法，为经典名方物质基准的研究提供借鉴，同时方便为检测桃核承气汤物质的质量好坏建立标准。

附图说明

图1样品及对照品高效液相色谱图

A.210nm对照品图 B.250nm对照品图 C.290nm对照品图

D.210nm样品图 E.250nm样品图 F.290nm样品图

1.苦杏仁苷 2.桂皮醛 3.甘草酸 4.芦荟大黄素

5.大黄酸 6.大黄素 7.大黄酚 8.大黄素甲醚

图2 HPLC指纹图谱

A.210nm10批样品HPLC叠加指纹图谱；

B.250nm10批样品HPLC叠加指纹图谱；

C.290nm10批样品HPLC叠加指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1桃核承气汤物质基准的建立方法

1.1桃核承气汤的制备

按原方处方称取某产地的原材料桃仁、大黄、桂枝、炙甘草、芒硝五味药材，前四味药加入1400ml水煮至500ml，过滤，收集滤液，加入芒硝，微沸，下火，得桃核承气汤传统汤剂。将桃核承气汤传统汤剂浓缩至50ml，得桃核承气汤浓缩液，备用。

1.2出膏率的测定

取桃核承气汤浓缩液，于80℃水浴蒸干，-25摄氏度冰箱预冻6h，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥至样品呈疏松无水状态，称重，出膏率为17.47％。

1.3色谱条件

Diamonsil C18(5μm,250×4.6mm)，流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱：0-5min，15％乙腈；5-10min，15％-20％乙腈；10-30min， 20％乙腈；30-55min，20％-50％乙腈；55-70min，50％乙腈；70-85min， 50％-80％乙腈；85-90min，80％-100％乙腈；90-95min，100％乙腈；体积流量1.0ml/min；进样量10μL；柱温30℃；苦杏仁苷检测波长为210nm，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、甘草酸检测波长为250nm，桂皮醛检测波长为290nm。

1.4对照品溶液的制备

分别精密称取苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素1.39、2.72、6.17、1.18、1.32、1.29、 1.22、1.21㎎，置于5ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.278、0.554、1.234、0.236、0.264、0.258、0.244、0.242㎎/ml的对照品储备液。依次取上述对照品储备液2、1、2、1、1、1、1、1ml，置于同一10ml容量瓶中，即得混合对照品溶液。

1.5供试品溶液制备

精密吸取浓缩后的水提液1ml，至5ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀静置，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

1.6系统适应性试验

取对照品溶液、供试品溶液按上述色谱条件进样，结果见图1。

1.7线性关系考察

精密量取混合对照品溶液液1、5、10、15、20μl，按所确定的色谱条件进行测定，记录峰面积。以进样量(x，μg)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围

1.8精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，分别在确定的色谱条件下重复进样6 次，记录峰面积。苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素峰面积的RSD分别为0.3909％、0.2585％、0.1192％、0.4162％、0.3072％、0.3370％、0.4550％、0.2369％(n＝6)，表面仪器精密度良好。

1.9稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、12h，按所确定的色谱条件进样，记录峰面积。结果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素峰面积的 RSD分别为0.2766％、0.2460％、0.2250％、0.2030％、0.8584％、0.2624％、0.8573％、0.5912％，表明供试品在12h内稳定。

1.10重复性试验

取同一供试品溶液，按所确定的方法平行制备6份，在确定的色谱条件下进样，记录峰面积。结果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素峰面积的RSD分别为 0.3267％、0.5621％、0.2328％、0.3238％、0.4718％、0.1723％、0.3993％、 0.2713％，表明该方法重复性良好。

1.11加样回收试验

精密量取已知含量供试品溶液6份，每份0.1ml，按照100％分别加入8种化合物对照品，制备供试品溶液，再按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算各成分的加样回收率，结果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的平均加样回收率分别为100.05％、100.40％、100.60％、99.36％、 99.21％、100.37％、100.23％、99.72％，RSD分别为1.28％、1.76％、1.39％、 1.30％、2.48％、2.16％、2.01％、1.64％。

1.12指纹图谱的建立、相似度分析及共有峰的相关分析

1.12.1指纹图谱的建立与相似度分析

取10批桃核承气汤样品，按上述方法制备供试品溶液并进样分析，将所得数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A)对10批样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，并以样品共有模式为对照，进行整体相似度评价。结果显示，10批样品相似度为0.997-1，表明样品批间差异较小，质量稳定性较好，详见表2、表3、表4。

表2 10批样品相似度评价结果(210nm)

表3 10批样品相似度评价结果(250nm)

表4 10批样品相似度评价结果(290nm)

1.12.2共有峰的指认及相关分析

在210nm波长处有16个共有峰，在250nm波长处有18个共有峰，在290nm波长处有18个共有峰，通过与对照品对比指认了8个共有峰，在210nm波长处指认出苦杏仁苷(峰3)，在250nm波长处指认出甘草酸(峰12)、芦荟大黄素(峰14)、大黄酸(峰15)、大黄素(峰16)、大黄酚(峰17)及大黄素甲醚(峰18)，在290nm波长处指认出桂皮醛(峰10)。在样品图谱中分别选择峰面积较大、出峰时间稳定的苦杏仁苷(210nm峰3)、甘草酸(250nm峰12)、桂皮醛(290nm峰10)为参照峰，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，且RSD均小于3％，详见表6-表10。

表5 10批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间(210nm)

表6 10批样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积(210nm)

表7 10批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间(250nm)

表8 10批样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积(250nm)

表9 10批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间(290nm)

表10 10批样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积(290nm)

Claims

1.一种桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

确定提取工艺，采用高效液相法进行有效成分含量测定，测定出膏率并建立指纹图谱，包括以下步骤：

⑴饮片选取：桃仁15克，大黄60克，桂枝30克，炙甘草30克，芒硝30克；

⑵桃核承气汤传统汤剂的制备：取步骤⑴中饮片桃仁、大黄、桂枝、炙甘草，加1400ml水煮至500ml，过滤，加入芒硝，缓慢加热沸腾，得桃核承气汤传统汤剂；

⑶桃核承气汤浓缩液的制备：将步骤⑵中滤液继续浓缩至60ml，得桃核承气汤浓缩液;

⑷出膏率的测定：取步骤⑶中浓缩液，水浴蒸干，冷冻干燥法测定出膏率即所得膏液除以原材料的质量然后乘以100%；

⑸有效成分含量的测定及指纹图谱的建立：采用高效液相色谱法建立指纹图谱共有模式，通过苦杏仁苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、桂皮醛及甘草酸混合对照品液确定指认共有的色谱峰，在此基础上，确定桃核承气汤传统汤剂中对应的成分并测定桃核承气汤传统汤剂中苦杏仁苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、桂皮醛及甘草酸的含量；建立对混合对照品液中各物质的浓度或含量与峰面积的线性关系，检测待测桃核承气汤传统汤剂中各物质的峰面积，从而得到各物质的含量，即得到相应的有效成分的含量；

步骤（5）中桃核承气汤汤剂和混合对照品液的高效液相色谱法色谱条件均为：Diamonsil C18，Diamonsil C18对应的规格为：5μm、250×4.6mm；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0-5min，15%乙腈；5-10min，15%-20%乙腈；10-30min，20%乙腈；30-55min，20%-50%乙腈；55-70min，50%乙腈；70-85min，50%-80%乙腈；85-90min，80%-100%乙腈；90-95min，100%乙腈；体积流量1.0ml/min ；进样量10μL；柱温30℃；其中苦杏仁苷检测波长为210nm，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、甘草酸检测波长为250nm，桂皮醛检测波长为290nm；上述梯度洗脱过程中每个时间段内的乙腈占总流动相的体积百分含量是匀速提升的，如0-5min，15%乙腈；5-10min，15%-20%乙腈；表示：在0-5min内，流动相中乙腈的体积百分含量恒定为15%，在5-10min内，流动相中乙腈的体积百分含量从15%逐渐提高的20%。

2.按照权利要求1所述的一种桃核承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤（5）中对共有色谱峰的指认，在210nm波长处有16个共有峰，在250nm波长处有18个共有峰，在290nm波长处有18个共有峰，通过与对照品对比指认8个共有峰，在210nm波长处指认出苦杏仁苷，在250nm波长处分别指认出甘草酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚，在290nm波长处指认出桂皮醛；在样品图谱中分别选择峰面积较大、出峰时间稳定的苦杏仁苷、甘草酸、桂皮醛为参照峰，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积。