CN115508463A - 唐古特大黄产品的检测方法和质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种唐古特大黄产品的检测方法和质量控制方法。本发明提供的唐古特大黄产品的检测方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇‑磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，选用特定的洗脱程序，得到18个共有特征峰，不仅显著提升了特征峰的数量，还实现了这些共有特征峰的良好分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，各特征峰峰形好、各特征峰之间分离度高，因此该检测方法能够有效提升唐古特大黄产品特征图谱的精确度，能够充分反应唐古特大黄产品的整体性和特征性，这有利于更加全面地监控唐古特大黄产品的质量。

Description

唐古特大黄产品的检测方法和质量控制方法

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种唐古特大黄产品的检测方法和质量控制方法。

背景技术

药典规定人用药品大黄应来自掌叶大黄(Rheum palmatumL.)、药用大黄(RheumoffcinaleBaill.)、唐古特大黄 (Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)的干燥根和根茎。秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖，除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥。

其中，唐古特大黄味苦性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、清热除湿、逐瘀通经之功效,用于治疗实热便秘、积滞腹痛、泻痢不爽、湿热黄疸、目赤、咽肿、肠痈腹痛、痈肿疔疮、瘀血经闭，外治水火烫伤、风火牙痛、跌打损伤等症。

唐古特大黄作为药品大黄中的重要基源品种，用途广泛，需要一种能够全面、快速地对其进行检测的检测方法，以便能够更好地对唐古特大黄产品进行质量控制。

特征图谱检测法是常用的中药质量控制方法，然而，现有的唐古特大黄产品特征图谱检测法有效分离的化学成分较少，且各成分的分离效果较差，所得特征图谱的特征峰数量较少，不能全面监控唐古特大黄产品的质量。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有唐古特大黄产品特征图谱检测法中相关特征图谱因特征峰数量较少、分离度较低而不能全面监控唐古特大黄产品的质量的缺陷，从而提供一种唐古特大黄产品的检测方法和质量控制方法。

为此，本发明提供一种唐古特大黄产品的检测方法，包括如下步骤：

取供试品溶液，采用超高效液相色谱法进行检测；其中，所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A、体积百分含量0.03～0.20％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或乙酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～1min，流动相中甲醇的体积百分比为5％→20％； 1～9min，流动相中甲醇的体积百分比为20％→35％；9～17min，流动相中甲醇的体积百分比为35％→37％；17～ 21min，流动相中甲醇的体积百分比为37％→48％；21～24min，流动相中甲醇的体积百分比为48％→60％；24～30min，流动相中甲醇的体积百分比为60％→100％；30～35min，流动相中甲醇的体积百分比为100％。

可选的，所述超高效液相色谱法的色谱条件还包括如下条件中的至少一项：

1)检测波长为260～270nm；

2)柱温为30～40℃；

3)流速为0.20～0.30mL/min；

4)进样量为0.5～2μL；

5)色谱柱为CORTECS T3色谱柱，内径2.1mm，柱长100mm，粒径1.6μm。

可选的，所述唐古特大黄产品包括唐古特大黄药材、唐古特大黄饮片和唐古特大黄制剂中的至少一种；

可选的，所述唐古特大黄饮片包括大黄(唐古特大黄)、熟大黄(唐古特大黄)和酒大黄(唐古特大黄)中的至少一种；

可选的，所述唐古特大黄制剂包括大黄(唐古特大黄)配方颗粒、熟大黄(唐古特大黄)配方颗粒和酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒中的至少一种。

可选的，在所述唐古特大黄产品为唐古特大黄制剂的情况下，所述供试品溶液的制备过程包括：

取唐古特大黄制剂粉末，加提取溶剂，提取，固液分离，取液体；其中，所述提取溶剂选自水、甲醇或甲醇水溶液中的任意一种，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量不小于60％；

可选的，相对于1g所述唐古特大黄制剂粉末，所述提取溶剂的加入量为50～150ml；

可选的，所述提取为超声提取，超声功率为200W～300W，超声时间为15～45min。

可选的，在所述唐古特大黄产品为唐古特大黄药材和/或饮片的情况下，所述供试品溶液的制备过程包括：

取唐古特大黄药材和/或饮片，加水，加热回流，固液分离，所得液体浓缩至干，得浓缩残渣；

在所述浓缩残渣中加入提取溶剂，提取，固液分离，取液体；所述提取溶剂选自水、甲醇或甲醇水溶液中的任意一种，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量不小于60％；

可选的，相对于1g所述唐古特大黄药材和/或饮片，水的加入量为25～75ml；

可选的，所述加热回流的温度为80～100℃，时间为20～60min；

可选的，在向所述唐古特大黄药材和/或饮片的浓缩残渣中加入提取溶剂时，相对于1g所述唐古特大黄药材和/ 或饮片，所述提取溶剂的加入量为25～75ml；

可选的，所述提取为超声提取，超声功率为200W～300W，超声时间为15min～45min。

可选的，所述检测方法还包括采用没食子酸对照品、儿茶素对照品、番泻苷A对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品和芦荟大黄素对照品制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一项所述的检测方法中的超高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；

可选的，所述检测方法还包括采用唐古特大黄对照药材制备对照药材溶液的步骤，以及按照上述任一项所述的检测方法中的超高效液相色谱法检测对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。

本发明还提供了上述任一项所述的检测方法在唐古特大黄产品的质量控制中的用途和/或在唐古特大黄产品的鉴别中的用途。

本发明还提供了一种唐古特大黄产品的质量控制方法，包括按照上述任一项所述的检测方法获得待测唐古特大黄产品的特征图谱，并采用该特征图谱与对照特征图谱进行比对的步骤；

其中，对照特征图谱为使用至少一批唐古特大黄产品的标准品按照上述任一项所述的检测方法得到的特征图谱通过平均值或中位数法拟合后得到。

可选的，所述对照特征图谱包括18个特征峰，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为表儿茶素-3-O- 没食子酸酯峰，峰4为异莲花掌苷峰，峰5为莲花掌苷峰，峰6为芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰7为白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)葡萄糖苷峰，峰8为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰9为番泻苷A峰，峰10为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰11为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰12为大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰，峰13 为大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰14为芦荟大黄素峰，峰15为大黄酸峰，峰16为大黄素峰，峰17为大黄酚峰，峰18为大黄素甲醚峰，以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰，各特征峰与第一参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.29(峰3)、0.32(峰4)、0.33(峰5)、0.37(峰6)、0.44(峰7)、0.46(峰8)、 0.81(峰10)、0.83(峰11)、0.86(峰12)、0.93(峰13)。

可选的，在所述对照特征图谱中，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰，峰5、峰7、峰8和峰9与第二参比峰的相对峰面积在规定范围之内，规定范围为：不低于0.9(峰5)、不低于1.4(峰7)、不低于13.0(峰8)和不低于 1.7(峰9)。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的唐古特大黄产品的检测方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，选用特定的洗脱程序，得到18个共有特征峰，不仅显著提升了特征峰的数量，还实现了这些共有特征峰的良好分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，各特征峰峰形好、各特征峰之间分离度高，因此该检测方法能够有效提升唐古特大黄产品特征图谱的精确度，能够充分反应唐古特大黄产品的整体性和特征性，这有利于更加全面地监控唐古特大黄产品的质量。

2.本发明提供的唐古特大黄产品的检测方法，检测得到的特征图谱中含有18个特征峰，准确定位了芦荟大黄素峰、大黄酸峰、大黄素峰、大黄酚峰和大黄素甲醚峰的峰位置，并对其余每个特征峰均进行了指认，为唐古特大黄产品的质量检测和控制提供了依据。

3本发明提供的唐古特大黄产品的检测方法，采用特定的供试品溶液制备方法，制备过程简单、快速，且能够全面、足量地提取出唐古特大黄产品中的化学成分，这能够进一步提升唐古特大黄产品特征图谱的精确度，能够更加全面地监控唐古特大黄产品的质量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中供试品色谱、对照药材色谱和对照品色谱的图谱比对图；

图2是本发明实施例2中21批唐古特大黄产品的色谱图；

图3是本发明实施例2中唐古特大黄产品对照特征图谱；

图4是本发明实施例3中专属性验证阴性对照色谱图；

图5是本发明实施例3中专属性验证大黄(唐古特大黄)对照药材色谱图；

图6是本发明实施例3中专属性验证大黄(唐古特大黄)配方颗粒色谱图；

图7是本发明实施例3中精密度验证色谱图；

图8是本发明实施例3中重复性验证色谱图；

图9是本发明实施例3中中间精密度验证色谱图；

图10是本发明实施例3中稳定性考察色谱图；

图11-13是本发明实施例3中不同柱温考察色谱图；

图14-16是本发明实施例3中不同流速考察色谱图；

图17-19是本发明实施例3中不同色谱柱考察色谱图；

图20-22是本发明实施例3中不同编号的同一类型色谱柱考察色谱图；

图23-25是本发明实施例3中不同磷酸浓度流动相系统考察色谱图；

图26是本发明实施例4中柱温为30℃时的色谱图；

图27是本发明实施例4中柱温为35℃时的色谱图；

图28是本发明实施例4中柱温为40℃时的色谱图；

图29是本发明实施例5中甲醇-0.1％磷酸作流动相时的色谱图；

图30是本发明实施例5中甲醇-0.1％甲酸作流动相时的色谱图；

图31是本发明实施例5中甲醇-0.1％乙酸作流动相时的色谱图；

图32是本发明实施例6中甲醇-0.05％磷酸作流动相时的色谱图；

图33是本发明实施例6中甲醇-0.1％磷酸作流动相时的色谱图；

图34是本发明实施例6中甲醇-0.2％磷酸作流动相时的色谱图；

图35是本发明实施例7中使用水为提取溶剂时的色谱图；

图36是本发明实施例7中使用甲醇为提取溶剂时的色谱图；

图37是本发明实施例7中使用乙醇为提取溶剂时的色谱图；

图38是本发明实施例7中使用60％甲醇溶液为提取溶剂时的色谱图；

图39是本发明实施例7中使用80％甲醇溶液为提取溶剂时的色谱图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明实施例中涉及的仪器、试剂及试药如下所示：

仪器：色谱仪为Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS色谱系统，包括四元溶剂管理器(ACQ-QSM)、自动进样器(ACQ-FTN)、原装进口色谱柱温箱(ACQ-CM)、二极管阵列紫外检测器(ACQ-PDA)、Empower色谱管理系统；

XS204、XS205、XSE205万分之一天平(瑞士梅特勒)、ME36S百万分之一天平(瑞士梅特勒)、超声仪(上海科导超声仪器有限公司)、水浴锅；

色谱柱：(1)YMC-Triart C18，2.1mm×100mm，1.9μm；(2)capcell pak C18，2.0mm×100mm，2μm；(3) CORTECS T3，2.1mm×100mm，1.6μm。

试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

试药：

大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y、2108002Y、2108003Y，来源：华润三九医药股份有限公司)；

大黄(唐古特大黄)饮片标准汤剂(冻干粉)(批号：2005001Y、2005002Y、2005003Y、2005004Y、2005005Y、 2005006Y、2005007Y、2005008Y、2005009Y、2005010Y、2005011Y、2005012Y、2005013Y、2005014Y、2005015Y、 210401Y、210402Y、210403Y，来源：华润三九医药股份有限公司)；

没食子酸(批号：110831-201605，供含量测定用，以90.8％计算，购于中国食品药品检定研究院)、儿茶素(批号：110877-201604，供含量测定用，以99.2％计算，购于中国食品药品检定研究院)、芦荟大黄素(批号：110795-202011，供含量测定用，以97.5％计算，购于中国食品药品检定研究院)、大黄酸(批号：110757-201607，供含量测定用，以99.3％计算，购于中国食品药品检定研究院)、大黄素(批号：110756-201913，供含量测定用，以96.0％计算，购于中国食品药品检定研究院)、大黄酚(批号：110796-201922，供含量测定用，以99.4％计算，购于中国食品药品检定研究院)、大黄素甲醚(批号：110758-201616，供含量测定用，以99.0％计算，购于中国食品药品检定研究院)、番泻苷A(批号：110824-202003，购于中国食品药品检定研究院)；

大黄(唐古特大黄)对照药材(批号：120902-201912，购于中国食品药品检定研究院)；

大黄(唐古特大黄)配方颗粒的制备方法为：取大黄(唐古特大黄)药材，除去杂质，洗净，浸泡半小时，取出，闷润至透心，切厚片，50℃条件下，干燥，即可。炮制得到符合要求的大黄(唐古特大黄)饮片。取大黄(唐古特大黄)饮片，加水煎煮2次，第一次加9倍水浸泡30分钟，煎煮60分钟，用200目的滤布滤过，第二次加7 倍水，煎煮30分钟，用200目的滤布滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.06～1.12g/mL(60～80℃)的流膏，喷雾干燥，加麦芽糊精适量，混匀，干法制粒，分装，即得；

大黄(唐古特大黄)饮片标准汤剂(冻干粉)的制备方法为：取饮片约100g，置砂锅中，加入900mL纯化水浸泡30分钟，先武火(500W)煮沸，再文火(300W)煎煮20分钟，200目滤布趁热过滤，滤液迅速冷却至室温；药渣再加700mL纯化水，武火(500W)煮沸后，再文火(300W)煎煮15分钟，200目滤布趁热过滤，滤液迅速冷却至室温，合并两次滤液，称定滤液重量。

滤液采用减压浓缩(50℃～65℃)成相对密度为1.06g/ml～1.12g/ml(60℃±5℃)的浓浸膏，取浓浸膏置于冷冻干燥机中，冷冻干燥(-80℃，0Mpa)至干燥状态，取出，称重，粉碎，分装于西林瓶中，即得大黄(唐古特大黄) 饮片标准汤剂(冻干粉)；

大黄(唐古特大黄)配方颗粒阴性样品的制备方法为：取麦芽糊精辅料，干法制粒，制粒参数即辊轮转速：4～7rpm；挤压压力：5～9Mpa；送料转速：20～30rpm。

实施例1

大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y、2108002Y、2108003Y)的检测方法，包括：

(1)供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、番泻苷A、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液分别制成每1mL含没食子酸140μg、儿茶素20μg、番泻苷A 20μg、大黄酸16μg、大黄素16μg、大黄酚16μg、大黄素甲醚16μg、芦荟大黄素8μg的溶液，即得对照品溶液；

(3)对照药材溶液的制备：取大黄(唐古特大黄)对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

(4)超高效液相色谱法检测：

色谱柱为CORTECS T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.6μm)；以甲醇为流动相A、体积百分含量0.05％的磷酸水溶液为流动相B，按照表1进行梯度洗脱；流速为0.25mL/min；柱温为35℃；检测波长为265nm；进样量为1μL。理论板数按大黄酸色谱峰计算应不低于2000。

分别精密吸取各对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

表1梯度洗脱表

检测结果如图1所示，图1是供试品色谱、对照药材色谱和对照品色谱的图谱比对图，其中S1为供试品色谱色谱图，S2为对照药材色谱图，S3为对照品色谱图。所得供试品色谱中呈现18个特征峰，并与对照药材色谱中的 18个特征峰保留时间相对应，其中，峰1、峰2、峰9、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18应分别与相对应没食子酸、儿茶素、番泻苷A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品的参照物峰保留时间相对应。以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰，各特征峰与第一参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为： 0.29(峰3)、0.32(峰4)、0.33(峰5)、0.37(峰6)、0.44(峰7)、0.46(峰8)、0.81(峰10)、0.83(峰11)、0.86 (峰12)、0.93(峰13)；以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰，峰5、峰7、峰8和峰9与第二参比峰的相对峰面积在规定范围之内，规定范围为：不低于0.9(峰5)、不低于1.4(峰7)、不低于13.0(峰8)和不低于1.7(峰9)。

实施例2

本实施例用于说明唐古特大黄产品对照特征图谱的建立过程：

取上述3批大黄(唐古特大黄)配方颗粒和上述18批大黄(唐古特大黄)饮片标准汤剂(冻干粉)，分别按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液。

利用上述所得的21批供试品溶液，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，分别得到液相图谱，如图2所示。图2中，S1～S3为3批大黄(唐古特大黄)配方颗粒的液相图谱，S4～S21为18批大黄(唐古特大黄)饮片标准汤剂(冻干粉)的液相图谱，对应的产品批号依次为：S1：2108001Y、S2:2108002Y、S3：2108003Y、S4：2005001Y、S5：2005002Y、S6：2005003Y、S7：2005004Y、S8：2005005Y、S9：2005006Y、S10：2005007Y、 S11：2005008Y、S12:2005009Y、S13：2005010Y、S14：2005011Y、S15：2005012Y、S16：2005013Y、S17：2005014Y、 S18：2005015Y、S19：210401Y、S20：210402Y、S21：210403Y。

将图2中21批唐古特大黄产品的色谱图导入药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用“多点校正、MARK峰匹配”模式进行拟合，生成对照特征图谱，得到唐古特大黄产品对照特征图谱中共显示18个共有特征峰，如图3所示。

利用对照品，采用HPLC和LC/MS/MS对18个特征峰进行识别和指认，确定峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为表儿茶素-3-O-没食子酸酯、峰4为异莲花掌苷、峰5为莲花掌苷、峰6为芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰 7为白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)葡萄糖苷、峰8为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰9为番泻苷A、峰10为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷、峰11为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰12为大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、峰13为大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰14为芦荟大黄素、峰15为大黄酸、峰16为大黄素、峰17为大黄酚、峰18为大黄素甲醚。

通过LC/MS/MS对峰1～18进行分析，确认其分子结构式分别与没食子酸、儿茶素、表儿茶素-3-O-没食子酸酯、异莲花掌苷、莲花掌苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)葡萄糖苷、大黄酸 -8-O-β-D-葡萄糖苷、番泻苷A、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品分子结构式一致。

在上述确定的18个特征峰中，仅有没食子酸、儿茶素、番泻苷A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚可通过法定单位中国食品药品检定研究院获得，其中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为含量测定指标成分，因此，采用五个蒽醌类成分作为参照峰，以更好地评价各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。其中，以大黄酸的响应值较高，并且保留时间相对较适中，因此，将以大黄酸峰(峰15)作第一参比峰为 S1峰，计算各特征峰的相对保留时间，并且结合多批次样品的检测结果、不同基原样品的区分研究以及不同炮制品的区分研究，以大黄酚(峰17)为第二参比峰S2峰，计算峰5(莲花掌苷)、峰7(白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)葡萄糖苷)、峰8(大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷)以及峰9(番泻苷A)的相对峰面积比值，用于不同基原样品的区分，提高对配方颗粒的控制水平。

特征图谱相对保留时间根据研究结果确定：确定大黄(唐古特大黄)配方颗粒特征图谱共有18个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中18个特征峰相对应，其中，峰1、峰2、峰9、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18应分别与相对应没食子酸、儿茶素、番泻苷A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品参照物峰保留时间相对应；考虑到已知成分中，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为含量测定指标成分，其中以大黄酸的含量水平和峰面积占比较高，并且大黄酸在特征峰中的保留时间位置相对较适中，无杂质峰的干扰，选择其为参比峰，能更好评价其它特征峰的相对保留时间和相对峰面积情况。因此，选取其中与大黄酸参照物峰(峰 15)相应的峰为S1峰，计算各特征峰与S峰1的相对保留时间规定值为：0.29(峰3)、0.32(峰4)、0.33(峰5)、 0.37(峰6)、0.44(峰7)、0.46(峰8)、0.81(峰10)、0.83(峰11)、0.86(峰12)、0.93(峰13)。并且结合唐古特大黄产品特征图谱方法验证结果，规定特征峰的相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。选取大黄酚峰(峰 17)为第二参比峰S2，计算峰5、峰7、峰8和峰9与第二参比峰的相对峰面积在规定范围之内，规定范围为：不低于0.9(峰5)、不低于1.4(峰7)、不低于13.0(峰8)和不低于1.7(峰9)。

实施例3

本实施例用于对本发明的检测方法进行方法学验证：

(1)专属性验证

取大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)和上述大黄(唐古特大黄)配方颗粒阴性样品，分别按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液和阴性对照溶液，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，检测结果如图4-图6所示，图4为阴性对照色谱图，图5为大黄(唐古特大黄)对照药材色谱图，图6为大黄(唐古特大黄)配方颗粒色谱图，结果显示阴性对照溶液无干扰，表明本发明方法的系统适应性和专属性良好，可以作为唐古特大黄产品特征图谱的检测方法。

(2)精密度验证

取同一份大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，重复进样6次，获得每次检测的特征图谱，如图7所示。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表2和3所示。

表2精密度验证保留时间及相对保留时间表

表3精密度验证峰面积及相对峰面积表

由表2和表3可知，本发明方法的精密度良好。

(3)重复性验证

取同一批次大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法重复制备6 份供试品溶液，分别按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得6份供试品的特征图谱，如图8所示。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表4和5所示。

表4重复性验证保留时间及相对保留时间表

表5重复性验证峰面积及相对峰面积表

由表4和表5可知，本发明方法的重复性良好。

(4)中间精密度(不同操作人员)验证

取同一批次大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，分别由三名检验员在不同的时间按照实施例1 中步骤(1)的方法制备供试品溶液，并按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图9所示。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表6和7所示。

表6中间精密度验证保留时间及相对保留时间表

表7中间精密度验证峰面积及相对峰面积表

由表6和表7可知，本发明方法的中间精密度良好。

(5)稳定性考察

取大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液，分别在供试品溶液配制完成后的第0、4、8、12、16、24小时等时间点，并按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图10所示。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表8和9所示。

表8稳定性考察保留时间及相对保留时间表

表9稳定性考察峰面积及相对峰面积表

由表8和表9可知，本发明方法中使用的供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。

(6)不同柱温考察

取大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液，然后分别设置柱温为33℃、35℃、37℃，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图11-13所示，其中图11为柱温33℃时的色谱图，图12为柱温35℃时的色谱图，图13为柱温37℃时的色谱图。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表10和11所示。

表10不同柱温考察保留时间及相对保留时间表

表11不同柱温考察峰面积及相对峰面积表

由表10和11可知，柱温发生变化时，各特征色谱峰保留时间会发生一定的变化，说明各特征色谱峰的保留时间受柱温影响，但是影响程度在可接受的范围之内，综合考虑个别峰的分离度及峰形，本发明方法的最佳柱温为 35℃。

(7)不同流速考察

取大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液，然后分别设置流速为0.20ml/min、0.25ml/min、0.30ml/min，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图14-16所示，其中图14为流速0.20ml/min时的色谱图，图15为流速0.25ml/min时的色谱图，图16为流速0.30ml/min时的色谱图。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表12和13所示。

表12不同流速考察保留时间及相对保留时间表

表13不同流速考察峰面积及相对峰面积表

由表12和表13可知，流速发生变化时峰4、峰9相对峰面积的偏差较大；由图14-16可知，流速不同会对各峰的保留时间和峰面积，以及各特征峰与周围小峰的分离情况，但在0.20-0.30ml/min的范围内，影响程度在允许的范围内；结合不同流速的考察结果以及柱压，本发明方法的最佳流速为0.25ml/min。

(8)不同色谱柱考察

取大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液，然后分别利用色谱柱①YMC-Triart C18(2.1mm×100mm，1.9μm)、②capcell pak C18(2.0mm×100mm，2μm)、③CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.6μm)，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图17-19所示，其中图17为使用色谱柱①YMC-Triart C18(2.1mm×100mm，1.9μm)时的色谱图，图 18为使用色谱柱②capcell pak C18(2.0mm×100mm，2μm)时的色谱图，图19为使用色谱柱③CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.6μm)时的色谱图。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表14和15所示。

表14不同色谱柱考察保留时间及相对保留时间表

表15不同色谱柱考察峰面积及相对峰面积表

由表14和表15可知，本发明方法的色谱柱耐用性较好，结合各色谱柱的分离效果，本发明方法的最佳色谱柱为CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.6μm)。

分别利用3根不同编号的CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.6μm)色谱柱(柱1编号1213123715304，柱2编号1213123715308，柱3编号1133924115409)，按照实施例1中步骤(4)的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图20-22所示，其中图20为使用柱1时的色谱图，图21为使用柱2时的色谱图，图22为使用柱3 时的色谱图。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表16和17所示。

表16不同CORTECS T3色谱柱保留时间及相对保留时间表

表17不同CORTECS T3色谱柱峰面积及相对峰面积表

由表16和表17可知，当时使用不同编号的CORTECS T3色谱柱时，各特征色谱峰保留时间和相对峰面积变化不大。

(9)不同磷酸浓度流动相系统考察

取大黄(唐古特大黄)配方颗粒(批号：2108001Y)，按照实施例1中步骤(1)的方法制备供试品溶液，然后分别利用甲醇-0.03％磷酸溶液、甲醇-0.05％磷酸溶液、甲醇-0.07％磷酸溶液作为流动相，按照实施例1中步骤(4) 的方法进行超高效液相色谱检测，获得特征图谱，如图23-25所示，其中图23为使用流动相甲醇-0.03％磷酸溶液时的色谱图，图24为使用流动相甲醇-0.05％磷酸溶液时的色谱图，图25为使用流动相甲醇-0.07％磷酸溶液时的色谱图。

以大黄酸峰(峰15)为第一参比峰S1，计算各特征峰与第一参比峰的相对保留时间，以大黄酚峰(峰17)为第二参比峰S2，计算各特征峰与第二参比峰的相对峰面积，并计算RSD值，计算结果如表18和19所示。

表18不同磷酸浓度流动相考察保留时间及相对保留时间表

表19不同磷酸浓度流动相考察峰面积及相对峰面积表

由表18和表19可知，流动相中磷酸溶液的浓度发生变化时，对所有色谱峰的相对保留时间影响较小，结合考察结果，确定本发明方法的最佳流动相为甲醇-0.05％磷酸溶液。

实施例4

按照实施例1的方法进行大黄(唐古特大黄)配方颗粒的特征图谱检测，不同的是，本实施例中分别设置柱温为30℃、35℃、40℃。所得色谱图如图26-28所示，其中图26是柱温为30℃时的色谱图，图27是柱温为35℃时的色谱图，图28是柱温为40℃时的色谱图。

由图26-28可知，在柱温30-40℃的范围内，本发明方法均能取得较好的检测效果。

实施例5

按照实施例1的方法进行大黄(唐古特大黄)配方颗粒的特征图谱检测，不同的是，本实施例中分别利用甲醇 -0.1％磷酸、甲醇-0.1％甲酸和甲醇-0.1％乙酸为流动相进行检测。所得色谱图如图29-31所示，其中图29是甲醇-0.1％磷酸作流动相时的色谱图，图30是甲醇-0.1％甲酸作流动相时的色谱图，图31是甲醇-0.1％乙酸作流动相时的色谱图。

由图29-31可知，使用三种不同的流动相时，本发明方法均能取得较好的检测效果。

实施例6

按照实施例1的方法进行大黄(唐古特大黄)配方颗粒的特征图谱检测，不同的是，本实施例中分别利用甲醇 -0.05％磷酸、甲醇-0.1％磷酸和甲醇-0.2％磷酸为流动相进行检测。所得色谱图如图32-34所示，其中图32是甲醇 -0.05％磷酸作流动相时的色谱图，图33是甲醇-0.1％磷酸作流动相时的色谱图，图34是甲醇-0.2％磷酸作流动相时的色谱图。

由图32-34可知，在流动相B的磷酸浓度为0.05％-0.2％的范围内，本发明方法均能取得较好的检测效果。

实施例7

按照实施例1的方法进行大黄(唐古特大黄)配方颗粒的特征图谱检测，不同的是，本实施例中分别利用水、甲醇、乙醇、60％甲醇溶液、80％甲醇溶液作为供试品溶液的提取溶剂，检测结果如图35-39所示，其中图35是使用水为提取溶剂时的色谱图，图36是使用甲醇为提取溶剂时的色谱图，图37是使用乙醇为提取溶剂时的色谱图，图38是使用60％甲醇溶液为提取溶剂时的色谱图，图39是使用80％甲醇溶液为提取溶剂时的色谱图。

由图35-39可知，甲醇、水、60％甲醇溶液、80％甲醇溶液作提取溶剂时，检测结果无明显区别，本发明方法均能取得较好的检测效果；乙醇作提取溶剂时，色谱图色谱峰的响应值较低。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种唐古特大黄产品的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取供试品溶液，采用超高效液相色谱法进行检测；其中，所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A、体积百分含量0.03～0.20％的磷酸水溶液、甲酸水溶液或乙酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～1min，流动相中甲醇的体积百分比为5％→20％；1～9min，流动相中甲醇的体积百分比为20％→35％；9～17min，流动相中甲醇的体积百分比为35％→37％；17～21min，流动相中甲醇的体积百分比为37％→48％；21～24min，流动相中甲醇的体积百分比为48％→60％；24～30min，流动相中甲醇的体积百分比为60％→100％；30～35min，流动相中甲醇的体积百分比为100％。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法的色谱条件还包括如下条件中的至少一项：

1)检测波长为260～270nm；

2)柱温为30～40℃；

3)流速为0.20～0.30mL/min；

4)进样量为0.5～2μL；

5)色谱柱为CORTECS T3色谱柱，内径2.1mm，柱长100mm，粒径1.6μm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述唐古特大黄产品包括唐古特大黄药材、唐古特大黄饮片和唐古特大黄制剂中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在所述唐古特大黄产品为唐古特大黄制剂的情况下，所述供试品溶液的制备过程包括：

取唐古特大黄制剂粉末，加提取溶剂，提取，固液分离，取液体；其中，所述提取溶剂选自水、甲醇或甲醇水溶液中的任意一种，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量不小于60％；

可选的，相对于1g所述唐古特大黄制剂粉末，所述提取溶剂的加入量为50～150ml；

可选的，所述提取为超声提取，超声功率为200W～300W，超声时间为15～45min。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，在所述唐古特大黄产品为唐古特大黄药材和/或饮片的情况下，所述供试品溶液的制备过程包括：

取唐古特大黄药材和/或饮片，加水，加热回流，固液分离，所得液体浓缩至干，得浓缩残渣；

在所述浓缩残渣中加入提取溶剂，提取，固液分离，取液体；所述提取溶剂选自水、甲醇或甲醇水溶液中的任意一种，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量不小于60％；

可选的，相对于1g所述唐古特大黄药材和/或饮片，水的加入量为25～75ml；

可选的，所述加热回流的温度为80～100℃，时间为20～60min；

可选的，在向所述唐古特大黄药材和/或饮片的浓缩残渣中加入提取溶剂时，相对于1g所述唐古特大黄药材和/或饮片，所述提取溶剂的加入量为25～75ml；

可选的，所述提取为超声提取，超声功率为200W～300W，超声时间为15min～45min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用没食子酸对照品、儿茶素对照品、番泻苷A对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品和芦荟大黄素对照品制备对照品溶液的步骤，以及采用所述超高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；

可选的，所述检测方法还包括采用唐古特大黄对照药材制备对照药材溶液的步骤，以及采用所述超高效液相色谱法检测对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。

7.权利要求1～6中任一项所述的检测方法在唐古特大黄产品的质量控制中的用途和/或在唐古特大黄产品的鉴别中的用途。

8.一种唐古特大黄产品的质量控制方法，其特征在于，

包括按照权利要求1～6中任一项所述的检测方法获得待测唐古特大黄产品的特征图谱，并采用该特征图谱与对照特征图谱进行比对的步骤；

其中，对照特征图谱为使用至少一批唐古特大黄产品的标准品按照权利要求1～6中任一项所述的检测方法得到的特征图谱通过平均值或中位数法拟合后得到。

9.根据权利要求8所述的质量控制方法，其特征在于，所述对照特征图谱包括18个特征峰，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为表儿茶素-3-O-没食子酸酯峰，峰4为异莲花掌苷峰，峰5为莲花掌苷峰，峰6为芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰7为白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)葡萄糖苷峰，峰8为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰9为番泻苷A峰，峰10为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰11为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰12为大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰，峰13为大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰，峰14为芦荟大黄素峰，峰15为大黄酸峰，峰16为大黄素峰，峰17为大黄酚峰，峰18为大黄素甲醚峰，以大黄酸峰为第一参比峰，各特征峰与第一参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰3的规定值为0.29、峰4的规定值为0.32、峰5的规定值为0.33、峰6的规定值为0.37、峰7的规定值为0.44、峰8的规定值为0.46、峰10的规定值为0.81、峰11的规定值为0.83、峰12的规定值为0.86、峰13的规定值为0.93。

10.根据权利要求9所述的质量控制方法，其特征在于，以大黄酚峰为第二参比峰，峰5、峰7、峰8和峰9与第二参比峰的相对峰面积在规定范围之内，峰5的规定范围为不低于0.9、峰7的规定范围为不低于1.4、峰8的规定范围为不低于13.0和峰9的规定范围为不低于1.7。

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