CN116223656B - 化湿败毒组合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药质量检测技术领域，具体公开了一种化湿败毒组合物的检测方法，包括：以和厚朴酚为内标物，建立芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子；采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；按照各相对校正因子计算得到化湿败毒组合物中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的含量。本发明的检测方法实用性强、操作简单、测试快速、准确、节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量检测技术领域，尤其涉及一种化湿败毒组合物的检测方法。
背景技术
化湿败毒方由《伤寒论》中麻杏石甘汤，《金匮要略》中葶苈大枣泻肺汤,《温病条辨》中宣白承气汤，《医原·湿气论》中藿朴夏苓汤四首方剂组合优裁而制。化湿败毒方由14味中药组成，包括生麻黄、生石膏、杏仁、赤芍、葶苈子、法半夏、甘草、茯苓、藿香、草果、苍术、厚朴、生黄芪、生大黄。化湿败毒颗粒是化湿败毒方经现代工艺制粒而成，研究表明，化湿败毒颗粒在动物及临床应用中均显示出良好效果。然而化湿败毒颗粒药味多、成分复杂，目前对于化湿败毒方的研究多集中在网络药理学、疗效等方面的研究，对于其质量标准的研究主要集中于特征图谱及单一成分含量测定。文献《基于多元统计的化湿败毒颗粒特征图谱分析及活性成分含量测定》(今日药学)建立了化湿败毒颗粒的特征图谱，但只对大黄5种蒽醌类成分进行了含量测定。专利2020108343359-化湿败毒组合物的质量检测方法分别测定了大黄5种蒽醌组分、芍药苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，但其测试的成分少，且测试方法复杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种化湿败毒组合物的检测方法，该方法测定组分多，且测定工序简单，检测成本低。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种化湿败毒组合物的检测方法，所述化湿败毒组合物主要包括以下组分：麻黄，炒苦杏仁，生石膏，甘草，广藿香，厚朴，麸炒苍术，炒草果仁，法半夏，茯苓，大黄，黄芪，葶苈子，赤芍；
所述化湿败毒组合物的检测方法包括：
以和厚朴酚为内标物，建立芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子；
采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；
按照各相对校正因子计算得到化湿败毒组合物中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的含量。
作为上述技术方案的改进，所述以和厚朴酚为内标物，分别建立芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子的步骤包括：
(1)取芍药苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品、大黄素对照品、茯苓酸B对照品、大黄酚对照品和茯苓酸A对照品，加甲醇溶解，得到第一混合对照品溶液；
(2)将所述第一混合对照品溶液梯度稀释，得到系列浓度的多个第二混合对照品溶液；
(3)采用液相色谱仪分别测定多个所述第二混合对照品溶液，并计算得到芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、厚朴酚、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子。
其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1-0.2vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为230-290nm。
作为上述技术方案的改进，所述梯度洗脱按照下述程序进行：
0-8min，流动相A从4％→20％，流动相B从96％→80％；
8-30min，流动相A从20％→35％，流动相B从80％→65％；
30-35min，流动相A从35％→50％，流动相B从65％→50％；
35-50min，流动相A从50％→63％，流动相B从50％→37％；
50-62min，流动相A从63％→85％，流动相B从37％→15％；
62-70min，流动相A从85％→95％，流动相B从15％→5％；
70-72min，流动相A从95％→4％，流动相B从5％→96％；
72-80min，流动相A为4％，流动相B为96％。
作为上述技术方案的改进，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min，柱温为25-40℃，检测波长为230-290nm，进样量为5-10μL。
作为上述技术方案的改进，检测波长为：0-30min为235nm，30-80min为254nm。
作为上述技术方案的改进，所述采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中厚朴酚的含量的步骤包括：
(i)取和厚朴酚对照品，加甲醇溶解，得到和厚朴酚对照品溶液；
(ii)取化湿败毒组合物，利用甲醇提取，得到供试品溶液；
(iii)吸取所述和厚朴酚对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；
其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1-0.2vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为230-290nm。
作为上述技术方案的改进，所述梯度洗脱按照下述程序进行：
0-8min，流动相A从4％→20％，流动相B从96％→80％；
8-30min，流动相A从20％→35％，流动相B从80％→65％；
30-35min，流动相A从35％→50％，流动相B从65％→50％；
35-50min，流动相A从50％→63％，流动相B从50％→37％；
50-62min，流动相A从63％→85％，流动相B从37％→15％；
62-70min，流动相A从85％→95％，流动相B从15％→5％；
70-72min，流动相A从95％→4％，流动相B从5％→96％；
72-80min，流动相A为4％，流动相B为96％。
作为上述技术方案的改进，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min，柱温为25-40℃，检测波长为230-290nm，进样量为5-10μL。
作为上述技术方案的改进，检测波长为：0-30min为235nm，30-80min为254nm。
作为上述技术方案的改进，步骤(ii)中，取化湿败毒组合物，加入浓度为50-80vol％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
作为上述技术方案的改进，所述化湿败毒组合物主要包括下述组分：麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份，赤芍5-100份，辅料适量；
所述化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中药制剂为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。
实施本发明，具有如下有益效果：
1、本发明采用以和厚朴酚作为内标物的一测多评法(即QAMS法)，获得化湿败毒颗粒中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A等11种成分含量，实用性强、操作简单、测试快速、准确、节约成本。且本发明选用对照品相对易得且化合物性质相对稳定的和厚朴酚为内标物，实用性和可行性更好。
2、本发明的方法重复性好、稳定性好、耐用性好，为建立化湿败毒颗粒的质量评价提供依据。
附图说明
图1是采用乙腈-0.05％磷酸作为流动相时所得的色谱图；
图2是采用甲醇-0.05％磷酸作为流动相时所得的色谱图；
图3是采用乙腈-0.1％磷酸作为流动相时所得的色谱图；
图4是采用甲醇-0.1％磷酸作为流动相时所得的色谱图；
图5是采用乙腈-0.2％磷酸作为流动相时所得的色谱图；
图6是采用甲醇-0.2％磷酸作为流动相时所得的色谱图；
图7是采用梯度1时所得的色谱图；
图8是采用梯度2时所得的色谱图；
图9是采用梯度3时所得的色谱图；
图10为采用250nm吸收波长时的色谱图；
图11是本发明化湿败毒颗粒含量测定专属性考察中混合对照品、化湿败毒颗粒、缺赤芍阴性样品的色谱图；其中，峰1：芍药苷；峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；峰3：芦荟大黄素；峰4：大黄酸；峰5：甘草酸；峰6：和厚朴酚；峰7：厚朴酚；峰8：大黄素；峰9：茯苓酸B；峰10：大黄酚；峰11：茯苓酸A；
图12是本发明化湿败毒颗粒含量测定专属性考察中混合对照品、化湿败毒颗粒、缺黄芪阴性样品的色谱图；其中，峰1：芍药苷；峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；峰3：芦荟大黄素；峰4：大黄酸；峰5：甘草酸；峰6：和厚朴酚；峰7：厚朴酚；峰8：大黄素；峰9：茯苓酸B；峰10：大黄酚；峰11：茯苓酸A；
图13是本发明化湿败毒颗粒含量测定专属性考察中混合对照品、化湿败毒颗粒、缺大黄阴性样品的色谱图；其中，峰1：芍药苷；峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；峰3：芦荟大黄素；峰4：大黄酸；峰5：甘草酸；峰6：和厚朴酚；峰7：厚朴酚；峰8：大黄素；峰9：茯苓酸B；峰10：大黄酚；峰11：茯苓酸A；
图14是本发明化湿败毒颗粒含量测定专属性考察中混合对照品、化湿败毒颗粒、缺甘草阴性样品的色谱图；其中，其中，峰1：芍药苷；峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；峰3：芦荟大黄素；峰4：大黄酸；峰5：甘草酸；峰6：和厚朴酚；峰7：厚朴酚；峰8：大黄素；峰9：茯苓酸B；峰10：大黄酚；峰11：茯苓酸A；
图15是本发明化湿败毒颗粒含量测定专属性考察中混合对照品、化湿败毒颗粒、缺厚朴阴性样品的色谱图；其中，其中，峰1：芍药苷；峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；峰3：芦荟大黄素；峰4：大黄酸；峰5：甘草酸；峰6：和厚朴酚；峰7：厚朴酚；峰8：大黄素；峰9：茯苓酸B；峰10：大黄酚；峰11：茯苓酸A；
图16是本发明化湿败毒颗粒含量测定专属性考察中混合对照品、化湿败毒颗粒、缺茯苓阴性样品的色谱图，其中，其中，峰1：芍药苷；峰2：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；峰3：芦荟大黄素；峰4：大黄酸；峰5：甘草酸；峰6：和厚朴酚；峰7：厚朴酚；峰8：大黄素；峰9：茯苓酸B；峰10：大黄酚；峰11：茯苓酸A。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明中，化湿败毒组合物主要包括以下组分：麻黄，炒苦杏仁，生石膏，甘草，广藿香，厚朴，麸炒苍术，炒草果仁，法半夏，茯苓，大黄，黄芪，葶苈子，赤芍。
优选的，化湿败毒组合物包括以下组分：
麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份，赤芍5-100份，辅料适量。化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中药制剂为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。本发明提供了一种化湿败毒组合物的检测方法，其对任意剂型的化湿败毒组合物均可以起到良好的检测效果。
具体的，本发明中化湿败毒组合物的检测方法包括以下步骤：
S100：以和厚朴酚为内标物，建立芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子；
具体的，建立相对校正因子的方法可参考《中国药典》(2020版)第四部通则0512高效液相色谱法，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，建立相对校正因子包括以下步骤：
S101：取芍药苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品、大黄素对照品、茯苓酸B对照品、大黄酚对照品和茯苓酸A对照品，加甲醇溶解，得到第一混合对照品溶液；
具体的，可将各对照品先混合后，然后采用甲醇溶解；也可将各对照品分别采用甲醇溶解，然后混合。溶解所用甲醇的浓度为50-80vol％，优选的为80vol％。
S102：将第一混合对照品溶液梯度稀释，得到系列浓度的多个第二混合对照品溶液；
具体的，采用甲醇将第一混合对照品溶液进行梯度稀释，稀释所用甲醇的浓度为50-80vol％，优选的为80vol％。
S103：采用液相色谱仪分别测定多个所述第二混合对照品溶液，并计算得到芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、厚朴酚、大黄酸、甘草酸、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子。
其中，液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1-0.2vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为230-290nm。优选的，液相色谱仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min，柱温为25-40℃，检测波长为230-290nm，进样量为5-10μL。更优选的，检测波长为：0-30min为235nm，30-80min为254nm。
其中，梯度洗脱按照下述程序进行：
0-8min，流动相A从4％→20％，流动相B从96％→80％；
8-30min，流动相A从20％→35％，流动相B从80％→65％；
30-35min，流动相A从35％→50％，流动相B从65％→50％；
35-50min，流动相A从50％→63％，流动相B从50％→37％；
50-62min，流动相A从63％→85％，流动相B从37％→15％；
62-70min，流动相A从85％→95％，流动相B从15％→5％；
70-72min，流动相A从95％→4％，流动相B从5％→96％；
72-80min，流动相A为4％，流动相B为96％。
具体的，测定后记录各成分的峰面积，以和厚朴酚为内标物，计算其他10种成分的相对校正因子(fs/k)，fs/k＝fs/fk＝(As×Ck)/(Ak×Cs)，其中As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度，其中As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度。
S200：采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；
具体的，可采用内标法、外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法或面积归一化法进行和厚朴酚含量的测定。优选的，在本发明的一个实施例之中，和厚朴酚含量的测定方法如下：
S201：取和厚朴酚对照品，加甲醇溶解，得到和厚朴酚对照品溶液；
其中，甲醇的浓度为50-80vol％，优选的为80vol％。
S202：取化湿败毒组合物，利用甲醇提取，得到供试品溶液；
其中，甲醇的浓度为50-80vol％，优选的为80vol％。提取的方式可为加热回流提取或超声提取，但不限于此。
优选的，在本发明的一个实施例之中，取化湿败毒组合物，加入体积浓度为50-80％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
S203：吸取所述和厚朴酚对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；
具体的测试条件与第二混合对照品溶液的测试条件相同。需要说明的是，在此步骤中，和厚朴酚对照品溶液和供试品溶液的进样量分别为5-10μL。
S300：按照各相对校正因子计算得到化湿败毒组合物中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的含量。
下面以具体实施例对本发明进行进一步说明：
本发明实施例中所用到的仪器、药品如下：
1、仪器
Waters Arc型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Thermo Vanquish型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平(瑞士METTLER TDLEDO公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct型超纯水系统(德国Merck公司)。
2、试剂
甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
3、试药
10批化湿败毒颗粒由广东一方制药有限公司制备。
对照品：芍药苷(中国食品药品检定研究院，110736-202044)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(中国食品药品检定研究院，111920-201907)、芦荟大黄素(中国食品药品检定研究院，110795-202011)、大黄酸(中国食品药品检定研究院，110757-201607)、甘草酸(中国食品药品检定研究院，110731-202015)、和厚朴酚(中国食品药品检定研究院，110730-201915)、厚朴酚(中国食品药品检定研究院，110729-202015)、大黄素(中国食品药品检定研究院，110756-201913)、茯苓酸B(四川省维克奇生物科技有限公司，wkq20042104)、大黄酚(中国食品药品检定研究院，110796-201922)、茯苓酸A(四川省维克奇生物科技有限公司，wkq21051702)。
实施例1化湿败毒颗粒一测多评含量检测方法
1色谱条件、对照品溶液、供试品溶液的制备
1.1色谱条件
色谱柱：Waters Xbridge C18(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长：235nm(0-30min，芍药苷)、254nm(30-80min，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL。
表1流动相梯度洗脱条件
1.2对照品溶液的制备
1.2.1混合对照品溶液的制备
分别取芍药苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品、大黄素对照品、茯苓酸B对照品、大黄酚对照品、茯苓酸A对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每质量浓度分别为498.7136μg/mL、225.2536μg/mL、104.9100μg/mL、48.1605μg/mL、60.0288μg/mL、133.5324μg/mL、397.9800μg/mL、57.8880μg/mL、57.3300μg/mL、65.7034μg/mL、65.1085μg/mL的混合对照品溶液。
1.2.2和厚朴酚对照品溶液的制备
取和厚朴酚对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每质量浓度为26.706μg/mL的和厚朴酚对照品溶液。
1.3供试品溶液的制备
取化湿败毒颗粒适量，研细，取约2.0g，精密称定，精密加入体积浓度为80％的甲醇水溶液20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2测定法
吸取混合对照品溶液，或供试品溶液与和厚朴酚对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，按照测定结果计算各组分的相对校正因子，各组分含量。
3色谱条件的确定
3.1流动相的选择
分别选择乙腈-0.05％磷酸；甲醇-0.05％磷酸；乙腈-0.1％磷酸；甲醇-0.1％磷酸；乙腈-0.2％磷酸；甲醇-0.2％磷酸作为流动相进行考察，结果如图1-6。实验过程中发现因水的极性较大，出峰成分较少且峰与峰之间堆在一起，所以考虑加酸；用0.05％磷酸时达不到分离效果，0.1％和0.2％磷酸的分离效果较好，故选用0.1％磷酸；在选用乙腈和甲醇时，乙腈在分离时锋形较窄且分离效果较差，甲醇采用梯度洗脱时分离效果较好。
3.2梯度洗脱程序考察
通过多种梯度洗脱条件对比试验，对洗脱梯度进行优化，最终确定的梯度洗脱程序。梯度洗脱条件见表2-4，色谱图如图7-9。由结果可知，梯度1的时间较长，各色谱峰响应较低；梯度2色谱峰数目较少，响应较低。最后确定以梯度3为最优的梯度洗脱程序。
表2流动相梯度1
表3流动相梯度2
表4流动相梯度3
3.3检测波长的选择
经检测：芍药苷的最大吸收波长在230nm左右；黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷最大吸收波长在260nm；厚朴中主要成分厚朴酚、和厚朴酚分别在250nm和290nm左右时有最大吸收；甘草中甘草酸的最大吸收波长在250nm左右；大黄中蒽醌类成分在254nm处有最大吸收；茯苓中的茯苓酸A和茯苓酸B的最大吸收波长在250nm左右。采用250nm检测波长结果如图10，从图中可以看出，色谱峰整体响应较低，基线不平稳，虽然也可用于定量，但准确度低。综合以上考虑，决定采用切换波长的方式，洗脱时间在0-30min，波长设置为235nm，检测芍药苷；洗脱时间在30-80min，波长设置为254nm，检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A，在相应的波长下，基线平稳，各成分分离效果较好。
3.4供试品制备
通过考察提取条件来确定供试品的制备，具体的，分别采用超声提取和回流提取进行实验，具体结果见表5。从表中可以看出，超声提取和回流提取的含量区别不大。但实验发现用80％甲醇20mL超声30min后所得到的峰基线平稳，色谱图中检测成分较多且峰形较好。故采用超声提取法。
表5超声提取与回流提取含量结果对比(n＝3，mg/g)
4 待测组分的选择
4.1 待测组分的选择
化湿败毒方中以麻黄、广藿香、石膏为君药，麻黄、广藿香，辛、苦、温兼气味芳香，解表平喘，化湿和中；石膏，辛、甘、寒，清泻肺胃郁热兼以生津，三药相辅，以达解表散寒、芳香化湿、清热平喘之效。炒苦杏仁、法半夏、厚朴、麸炒苍术、炒草果仁、茯苓共为臣药，炒苦杏仁、法半夏、厚朴，辛、苦、温，行气降逆，开结平喘；麸炒苍术、炒草果仁，辛烈、苦温，入脾胃经，燥湿健脾、破戾气所结；茯苓，淡渗除湿健脾；六味药共用以达助君药燥湿健脾，行气通窍，疏泄腠理，助邪外出之效。以黄芪、赤芍、葶苈子、大黄为佐药，黄芪，甘温益肺脾气，赤芍，苦、微寒，凉血散瘀，用以治疗疫病后期伤其正气，气机郁闭导致的血瘀等；葶苈子辛寒，辅助君药石膏清泄肺热，兼以利水，预防或治疗“湿肺(肺水肿)病变”；大黄，苦寒入大肠经而通腑，肺与大肠相表里，辅助君药石膏清泄肺热，并配合赤芍凉血活血，四药共为佐药，以达顾护正气、泻热凉血、活血化瘀之效。以甘草为使药，甘草甘平，调和诸药，配赤芍取芍药甘草汤意缓急。本发明以2020年版《中国药典》一部各品种项下的含量测定指标为依据，首选含量高、性质稳定且易于检测的物质作为定量成分，同时兼顾各检测波长下的色谱峰形状及保留时间，确定合适的定量物质。最终以赤芍中的芍药苷，黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草中的甘草酸，厚朴中的厚朴酚、和厚朴酚，茯苓中的茯苓酸A、茯苓酸B，大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚为化湿败毒颗粒的质量评价指标。
4.2内标组分的选择
在本发明限定的色谱条件下，分别吸取“1.2.1混合对照品溶液的制备”项下制备得到的混合对照品溶液0.2mL、0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL，分别置10mL量瓶中，加80％甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，记录各成分的峰面积，分别以芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素作为内标物，计算各待测组分的相对校正因子(fs/k)，fs/k＝fs/fk＝(As×Ck)/(Ak×Cs)，其中As为内标物峰面积，Cs为内标物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度，结果见表6-13。结果表明，以和厚朴酚为内标物时，计算各待测组分相对校正因子的RSD均小于3％，结果较准确，因此以和厚朴酚为内标组分。
表6各成分相对校正因子1(n＝6)
表7各成分相对校正因子2(n＝6)
表8各成分相对校正因子3(n＝6)
表9各成分相对校正因子4(n＝6)
表10各成分相对校正因子5(n＝6)
表11各成分相对校正因子6(n＝6)
表12各成分相对校正因子7(n＝6)
表13各成分相对校正因子8(n＝6)
5待测成分色谱峰的定位
本发明采用相对保留时间进行待测组分色谱峰的定位，以和厚朴酚为内标物，考察其它10种成分在Thermo Vanquish型和Waters Arc型两种高效液相色谱系统，以及3根不同厂家的色谱柱(Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX Extend-C18、YMC Triart C18)的相对保留时间，结果见表14。采用相对保留值法各成分的RSD均小于3％，表明采用相对保留值法对待测成分的定位是可行的。
表14各成分相对保留时间
实施例2方法学考察
1专属性考察
分别取缺赤芍化湿败毒颗粒样品、缺黄芪化湿败毒颗粒样品、缺甘草化湿败毒颗粒样品、缺茯苓化湿败毒颗粒样品、缺大黄化湿败毒颗粒样品、缺厚朴化湿败毒颗粒样品，按照实施例1中1.3节的方法分别制备缺赤芍阴性样品溶液、缺黄芪阴性样品溶液、缺甘草阴性样品溶液、缺茯苓阴性样品溶液、缺大黄阴性样品溶液、缺厚朴阴性样品溶液。
精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺赤芍阴性样品溶液、缺黄芪阴性样品溶液、缺甘草阴性样品溶液、缺茯苓阴性样品溶液、缺大黄阴性样品溶液、缺厚朴阴性样品溶液各10μL，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，结果见图11-16。结果表明，各成分色谱峰均具有良好的分离度，理论塔板数均不低于5000，与对照品色谱峰保留时间一致，并且未在相应阴性样品中检测出，表明该方法专属性良好。
2线性关系考察
分别吸取实施例1中“1.2.1混合对照品溶液的制备”项下制备得到的混合对照品溶液0.2mL、0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL，分别置10mL量瓶中，加80％甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果见表15，可知各成分在各自浓度范围内线性关系良好。
表15线性关系考察结果(n＝6)
3精密度考察
精密吸取实施例1中“1.2.1混合对照品溶液的制备”项下制备得到的混合对照品溶液10μL，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，连续进样6针，记录峰面积，结果见表16。计算芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A峰面积的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。
表16精密度考察结果
4重复性考察
取同一批化湿败毒颗粒适量，按实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下方法平行制备6份供试品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，结果见表17。计算芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A含量的RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。
表17重复性考察结果(mg/g)
5稳定性考察
精密吸取实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24h时按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，结果见表18。计算芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A峰面积的RSD均小于3％，表明样品在24小时内稳定。
表18稳定性考察结果
6加样回收率试验
取同一批已知含量的化湿败毒颗粒9份，每份约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分为3组，分别按高、中、低浓度精密加入混合对照品溶液适量，按实施例1中“1.1色谱条件”项下方法制备供试品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表19。计算芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的加样回收率均在90％-105％以内，RSD均小于3％，表明该方法准确度较好。
表19加样回收率试验结果(n＝9)
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7系统耐用性考察
7.1不同仪器、色谱柱考察
以和厚朴酚为内标物，考察其它10种成分在Thermo Vanquish型、Waters Arc型2种高效液相色谱系统，以及Waters Xbridge C18(250mm×4.6μm，5μm)、Agilent ZORBAXExtend-C18(250mm×4.6μm，5μm)、YMC Triart C18(250mm×4.6μm，5μm)3种色谱柱下的相对校正因子，结果见表20，各成分的RSD均小于3％，表明仪器和色谱柱的更换对各成分相对校正因子无显著影响。
表20不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响
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7.2不同柱温考察
采用Waters Arc型高效液相色谱仪、Waters Xbridge C18色谱柱，考察柱温25、30、35、40℃对各成分相对校正因子的影响，结果见表21，各成分的RSD均小于3％，表明柱温的波动对各成分相对校正因子无显著影响。
表21不同柱温对相对校正因子的影响
7.3不同流速考察
采用Waters Arc型高效液相色谱仪、Waters Xbridge C18色谱柱，考察流速0.6、0.8、1.0mL·min-1对各成分相对校正因子的影响，结果见表22，各成分的RSD均小于3％，表明不同流速对各成分相对校正因子无显著影响。
表22不同流速对相对校正因子的影响
7.4不同进样量考察
采用Waters Arc型高效液相色谱仪、Waters Xbridge C18色谱柱，考察进样量2、4、6、8、10μL对各成分相对校正因子的影响，结果见表23，各成分的RSD均小于3％，表明不同进样量对各成分相对校正因子无显著影响。
表23不同进样量对相对校正因子的影响
8QAMS法与外标法(ESM)测定结果对比
取10批化湿败毒颗粒样品适量，按实施例1中“1.3供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，按实施例1中“1.1色谱条件”项下色谱条件进样测定，分别采用外标法和一测多评法测定各成分含量，利用SPSS 20.0软件对这两组检测结果进行Pearson相关系数(r)分析，结果见表24和表25，2种方法之间的相关系数r均为1.000，2种方法计算的含量结果基本一致。芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对标准偏差范围分别为0.89％-3.78％、0.07％-0.47％、0.74-3.83％、0.43％-0.84％、4.13％-4.54％、0.56％-0.96％、0.91％-1.32％、0.86％-1.27％、0.00％-0.30％、0.09％-0.39％，均小于5.0％，表明2种方法计算结果无显著性差异。
表24外标法与一测多评测定结果比较1(％，n＝3)
表25外标法与一测多评测定结果比较2(％，n＝3)
综上所述，本发明所建立的化湿败毒组合物的检测方法，具有简单、准确，操作方便的优点，能在对照品短缺的情况下用于含量测定，同时可减少溶剂消耗和分析时间，更有利于环境保护。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种化湿败毒组合物的检测方法，其特征在于，所述化湿败毒组合物主要包括以下组分：麻黄，炒苦杏仁，生石膏，甘草，广藿香，厚朴，麸炒苍术，炒草果仁，法半夏，茯苓，大黄，黄芪，葶苈子，赤芍；
所述化湿败毒组合物的检测方法包括：
以和厚朴酚为内标物，建立芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子；
采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；
按照各相对校正因子计算得到化湿败毒组合物中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的含量；
所述采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量的步骤中，将化湿败毒组合物利用甲醇水溶液提取，得到供试品溶液，然后采用液相色谱仪测定所述供试品溶液，得到化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量；
其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1-0.2vol%磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱按照下述程序进行：
0-8min，流动相A从4%→20%，流动相B从96%→80%；
8-30min，流动相A从20%→35%，流动相B从80%→65%；
30-35min，流动相A从35%→50%，流动相B从65%→50%；
35-50min，流动相A从50%→63%，流动相B从50%→37%；
50-62min，流动相A从63%→85%，流动相B从37%→15%；
62-70min，流动相A从85%→95%，流动相B从15%→5%；
70-72min，流动相A从95%→4%，流动相B从5%→96%；
72-80min，流动相A为4%，流动相B为96%；
所述液相色谱仪的检测波长为：0-30min为235nm，30-80min为254nm。
2.如权利要求1所述的化湿败毒组合物的检测方法，其特征在于，所述以和厚朴酚为内标物，分别建立芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子的步骤包括：
（1）取芍药苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品、大黄素对照品、茯苓酸B对照品、大黄酚对照品和茯苓酸A对照品，加甲醇溶解，得到第一混合对照品溶液；
（2）将所述第一混合对照品溶液梯度稀释，得到系列浓度的多个第二混合对照品溶液；
（3）采用液相色谱仪分别测定多个所述第二混合对照品溶液，并计算得到芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦荟大黄素、厚朴酚、大黄酸、甘草酸、厚朴酚、大黄素、茯苓酸B、大黄酚、茯苓酸A的相对校正因子。
3.如权利要求1所述的化湿败毒组合物的检测方法，其特征在于，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，0.1vol%磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min，柱温为25-40℃，进样量为5-10μL。
4.如权利要求1所述的化湿败毒组合物的检测方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法测定化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量的步骤包括：
（i）取和厚朴酚对照品，加甲醇溶解，得到和厚朴酚对照品溶液；
（ii）取化湿败毒组合物，利用甲醇水溶液提取，得到供试品溶液；
（iii）吸取所述和厚朴酚对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到化湿败毒组合物中和厚朴酚的含量。
5. 如权利要求4所述的化湿败毒组合物的检测方法，其特征在于，步骤（ii）中，取化湿败毒组合物，加入浓度为50-80 vol%的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
6.如权利要求1所述的化湿败毒组合物的检测方法，其特征在于，所述化湿败毒组合物包括下述组分：麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份，赤芍5-100份，辅料适量；
所述化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中药制剂为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。
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| Title |
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| 基于多元统计的化湿败毒颗粒特征图谱分析及活性成分含量测定;李国卫 等;今日药学;20220731;第32卷(第07期);490-498, 519 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116223656A (zh) | 2023-06-06 |
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