CN111624295A - 一种首荟通便胶囊质量检测方法 - Google Patents

一种首荟通便胶囊质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药制剂分析领域，具体公开了一种首荟通便胶囊质量检测方法，包括以薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌；基于高效液相色谱技术，采用一标多测的分析方法，以2，3，5，4’‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷为内参物，测定首荟通便胶囊中2，3，5，4’‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量。本发明质量检测方法操作简单方便、稳定可靠、专属性强、重现性好，能全面有效地控制首荟通便胶囊的质量，有利于稳定产品质量，确保临床用药安全、有效，从而更好地满足医疗和市场的需要。

Description

一种首荟通便胶囊质量检测方法
技术领域
本发明涉及首荟通便胶囊的质量检测方法，属于中药制剂分析领域。
背景技术
中国发明专利CN100453105C公开了一种首荟通便胶囊，由何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实制成，具有处方、工艺、质量标准和用途等核心技术的自主知识产权，于2015年5月6日获得生产批件(国药准字Z20150041)和新药证书(国药证字Z20150005)，现已成功上市，商品名为
Figure BDA0002567144740000011
首荟通便胶囊临床上主要用于功能性便秘的治疗，具有润肠通便、泻浊排毒、补血润燥、补气健脾的功效，尤其对毒邪内蕴、阴液亏虚所致的便秘具有良好的润肠通便治疗作用，可全面改善胃肠功能，疗效确切，起效快，无毒副反应，并具有排毒养颜、减肥降脂的功效，尤其适合老年人和体质虚弱者服用。
中国专利CN106124685A公开了一种首荟通便胶囊现行质量检测方法，以薄层色谱法鉴别制剂中人参、枳实、芦荟、阿胶，同时采用HPLC测定制剂中何首乌的2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、枳实的柚皮苷含量。该方法应用HPLC法测定两类成分含量，使用不同浓度的甲醇溶液提取，并采用两种洗脱梯度在双波长下测定；中国专利CN109613166A公开了一种新的首荟通便胶囊质量检测方法，以薄层色谱法鉴别制剂中决明子、枸杞子和白术，同时采用HPLC法测定首荟通便胶囊中的2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷和芦荟苷4种活性成分的含量。该方法由于操作繁琐，不能实现首荟通便胶囊多种活性成分含量的同时测定，并且未进行最佳供试品溶液制备条件进行筛选。
中药化学成分数量众多，且各成分之间具有协同作用，在研究其有效性时，单一成分含量无法全面反映中药产品质量，多指标的质量评价模式更符合中药多成分、多功效的特点。现有的多指标含量测定要求种类繁多的对照品，但对照品的紧缺和检测费的高昂，制约了多指标质量评价模式的推广与应用，因此解决对照品的瓶颈问题成为实施中药多指标质量评价的关键。一测多评法是利用中药有效成分之间的内在函数和比例关系，通过测定一个成分(对照品易于得到)而实现多个成分(对照品难以得到或供应)的同步测定，是适合中药特点的多指标质量评价模式。
发明内容
针对现有首荟通便胶囊质量检测方法的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种首荟通便胶囊质量检测新方法。在中国专利CN106124685A、中国专利CN109613166A首荟通便胶囊质量检测方法的基础上，增加了处方中原料药材何首乌的薄层鉴别，从而在结合现有技术的条件下可实现制剂中8味原料药材全覆盖定性鉴别，完善了首荟通便胶囊的薄层鉴别体系，达到全组分联合控制的目的；同时，对检测方法进行优化升级，建立适用于首荟通便胶囊质量评价的一标多测方法，可缓解对照品的紧缺和检测费的高昂的问题，节约了耗材，提高了检测效率，节省了人工成本。
本发明一种首荟通便胶囊质量检测方法，该方法以薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌，采用一标多测的分析方法，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，以HPLC测定首荟通便胶囊中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量。
所述薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌乌是以氯仿-甲醇混合溶液为第一次展开剂，以二氯甲烷-甲醇-乙酸-水混合溶液为第二次展开剂；
优选地，按体积比计，氯仿：甲醇＝7：3；按体积比计，二氯甲烷：甲醇：乙酸：水＝15：2：0.5：0.1。
所述薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌包括以下步骤：
A、供试溶液的制备：取首荟通便胶囊内容物适量，加甲醇加热回流提取得提取液，离心，取上清液，用乙醚萃取，收集乙醚层，合并，蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，作为供试品溶液；
B、对照品溶液制备：取何首乌对照药材，按步骤A所述方法制成对照药材溶液；另分别取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚、大黄素对照品，精密称定，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；
C、点样、展开：吸取上述5种溶液，分别点于同一硅胶H薄层板上，以氯仿-甲醇的混合溶液为展开剂，展至3cm，取出，晾干，再以二氯甲烷：甲醇：乙酸：水的混合溶液为展开剂，展至8cm，取出，晾干，置紫外光灯以365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
具体的，所述薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌包括以下步骤：
A、供试溶液的制备：取首荟通便胶囊内容物适量，研细，第一次加50％甲醇30ml，加热回流提取30min，第二次加50％甲醇24ml，加热回流提取30min，合并两次得提取液，离心，取上清液，用60mL乙醚萃取3次，每次20mL，收集乙醚层，合并，蒸干，残渣加2mL甲醇溶解，作为供试品溶液；
B、对照品溶液制备：取何首乌对照药材，按步骤A所述方法制成对照药材溶液；另分别取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚、大黄素对照品，精密称定，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；
C、点样、展开：吸取上述5种溶液各2-5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以氯仿：甲醇＝7：3为展开剂，展至3cm，取出，晾干，再以二氯甲烷：甲醇：乙酸：水＝15：2：0.5：0.1为展开剂，展至8cm，取出，晾干，置紫外光灯以365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
所述一标多测法测定首荟通便胶囊中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量包括下列步骤：
A、供试品溶液制备：取首荟通便胶囊内容物适量，研细，过筛，作为供试样品，备用；取样品粉末适量，按重量/体积计加入料液比为1：50-120倍量甲醇溶液，进行超声提取，提取时间为30-75min，放冷至室温，称重，用溶剂补足减失重量，摇匀，静置，吸取上清液，滤过，弃去初滤液，以续滤液作为供试品溶液；
B、对照品溶液制备：制备2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的单一对照品溶液和7种成分的混合对照品溶液；
C、相对保留时间的确定：吸取步骤B所述的7种单一对照品溶液和7种成分的混合对照品溶液，分别注入HPLC中进行检测，记录7种单一对照品溶液保留时间，同时记录7种成分的混合对照品溶液中各成分的保留时间，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，通过公式RRT＝Tk/Ts计算柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚相对于内参物2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的相对保留时间；公式中Ts为内参物保留时间，Tk为混合对照品溶液中其它6种待测成分的保留时间；
D、相对校正因子的确定：吸取步骤B所述的混合对照品溶液，注入HPLC，测定，记录混合对照品溶液7种成分的峰面积，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，根据相对校正因子计算公式fk/s＝(As×Ck)/(Ak×Cs)计算柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的相对校正因子fk/s；公式中As为内参物峰面积，Cs为内参物质量浓度，Ak为其他组分峰面积，Ck为其他组分质量浓度；
E、多成分含量测定：分别吸取步骤A所述的供试品溶液和步骤B所述2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，注入HPLC，测定，根据公式C样＝(A样×C对)/A对计算供试品溶液中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量；根据步骤C相对保留时间RRT对供试品溶液中的柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚6种成分进行定性，根据步骤D所述相对校正因子fk/s计算供试品溶液中柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量；式中A样为供试品的峰面积，C对为对照品的浓度，A对为对照品的峰面积。
优选地，所述步骤A所述供试品溶液的制备方法包括下列步骤：所用甲醇的浓度为40-60％，优选为50％，步骤A所述供试品溶液的制备方法滤过步骤采用0.22μm的有机滤头。
具体的，步骤A所述供试品溶液的制备方法为：
取首荟通便胶囊内容物适量，研细，过80目筛；作为供试样品，备用；取样品粉末0.5g，精密称定，置于50mL磨口具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液50mL，密塞，称重，超声处理60min，放冷至室温，再称重，用50％甲醇溶液补足减失重量，摇匀，静置，吸取上清液，过0.22μm有机滤头，弃去初滤液，以续滤液作为供试品溶液。优选地，所述步骤B所述混合对照品溶液的制备方法包括下列步骤：
精密称取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚各适量，分别用50％甲醇溶解，并分别制成浓度为0.7670mg/mL、1.865mg/mL、1.139mg/mL、0.8010mg/mL、2.9365mg/mL、0.1760mg/mL、0.0880mg/mL的对照品贮备溶液，备用；
取上述对照品贮备液适量体积，稀释成每1mL含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚0.0767mg/mL、0.1865mg/mL、0.1139mg/mL、0.0801mg/mL、0.5873mg/mL、0.0176mg/mL、0.0088mg/mL的溶液，即为混合对照品溶液。
优选地，所述HPLC色谱条件为：采用C18色谱柱；以乙腈为流动相A，0.07％-0.12％磷酸溶液为流动相B进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：
Figure BDA0002567144740000041
Figure BDA0002567144740000051
流速：0.8mL/min-1.2mL/min；柱温：26-34℃；进样量：4-10μL；检测波长：212-230nm。
所述C18色谱柱为Agilent ZORBAX XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)、AgilentZORBAX SB C18(4.6mm×250mm，5μm)或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；
进一步优选为Agilent ZORBAX XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱。
优选地，所述色谱条件中，流速为1.1mL/min；柱温为30℃；进样量为6μL，检测波长为222nm。
优选地，步骤C所述柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚相对于内参物2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的相对保留时间分别为1.27±0.013、1.42±0.020、2.19±0.040、2.27±0.027、2.53±0.014和2.60±0.014；
优选的地，相对保留时间分别为1.26、1.42、2.14、2.23、2.51和2.59。
步骤D所述柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚与2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的相对校正因子分别为0.95±0.043、0.88±0.033、1.06±0.039、1.26±0.039、0.24±0.016和0.29±0.014；
优选地，相对校正因子分别为0.93、0.83、1.06、1.26、0.22和0.28。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
1)本发明在现有首荟通便胶囊质量检测方法的基础上，增加了原料药材何首乌的薄层鉴别，完善了首荟通便胶囊的薄层鉴别体系，实现了首荟通便胶囊8种原料药材全覆盖定性鉴别，达到首荟通便胶囊中8种原料药材全组分检测控制的目的。
2)本发明采用一标多测方法同时测定首荟通便胶囊中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚的含量，所建立的方法准确度高、稳定性好、精密度高、重复性优异、回收率高、操作简单。
3)本发明通过一测多评同时检测首荟通便胶囊中的7种成分，通过测定2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷一个成分的含量即可而实现多个成分的同步测定，可缓解对照品的紧缺和检测费的高昂的问题，节约了耗材，提高了检测效率，节省了人工成本。
附图说明
图1为首荟通便胶囊内容物对照品溶液色谱图
附图中标记分述如下：1-2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、2-柚皮苷、3-新橙皮苷、4-芦荟苷A、5-芦荟苷B、6-芦荟大黄素、7-大黄酚；
图2为首荟通便胶囊内容物供试品溶液色谱图
附图中标记分述如下：1-2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、2-柚皮苷、3-新橙皮苷、4-芦荟苷A、5-芦荟苷B、6-芦荟大黄素、7-大黄酚；
图3为首荟通便胶囊内容物无辅料供试品溶液色谱图
附图中标记分述如下：1-2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、2-柚皮苷、3-新橙皮苷、4-芦荟苷A、5-芦荟苷B、6-芦荟大黄素、7-大黄酚；
图4为首荟通便胶囊中何首乌的薄层色谱图
附图中标记分述如下(从左到右)：1-2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品、2-何首乌对照药材、3-大黄素对照品、4-大黄素甲醚对照品、5-供试品。
具体实施方式
为了更加充分理解本发明实施，下面通过典型的实施案例对本发明做进一步的说明。本发明专利申请说明书以及权利要求书中所述的“首荟通便胶囊”均指的是由鲁南厚普制药有限公司生产的产品，其处方配比和制备方法在以上的发明内容有明确的限定。
实施例1高效液相色谱条件优化
1提取方法的选择
分别考察提取溶剂70％乙醇、50％甲醇、70％甲醇、纯甲醇等；称样量0.25g、0.50g、1.0g；溶剂体积25mL、50mL、100mL；超声处理时间30min、60min、90min。优选提取方法为：精密称取0.50g供试品粉末、加入50mL50％甲醇溶液、超声处理60min，此时色谱图峰面积表现最好。
2柱温的选择
本研究对相同色谱条件不同柱温下各成分出峰时间及含量测定准确度进行考察，分别考察了25℃、30℃、35℃，发现在30℃条件下，各色谱峰分离度达标，出峰时间适当。
3检测波长的选择
在前期通过对首荟通便胶囊中7种活性成分的全波长扫描，对比7种成分的最大吸收波长，综合考虑，将色谱方法的检测波长确定为222nm。
4流动相的选择
分别考察了首荟通便胶囊中7种活性成分的含量，其中芦荟苷A与芦荟苷B是同分异构体，两成分可相互转化，一定条件下可以氧化分解生成芦荟大黄素以及其他成分，在其它检测方法中，芦荟苷A与芦荟苷B是统一按照芦荟苷进行含量计算，但是由于方法的不稳定性，经常存在肩缝或峰分叉的情况，对色谱图积分的准确度造成影响，因此本研究尝试了更改流动相有机相比例、pH值、洗脱梯度等方法，在最终方法以乙腈为流动相A，0.11％磷酸溶液为流动相B的条件下，两种芦荟苷异构体分离度最好。
5内参物的选择
中成药处方制剂成分复杂，首荟通便胶囊处方中，2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷出峰时间稳定，峰面积处于所测7种成分的中间水平，与含量最大的芦荟苷B以及含量最小的大黄酚差别均在可接受范围，所以将2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷确定为内参物。
实施例2一标多测法测定首荟通便胶囊药效成分含量方法学研究
1仪器与试药
1.1试剂
2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，CAS：82373-94-2，纯度≥98％)，柚皮苷(Naringin，CAS：10236-47-2，纯度≥98％)，新橙皮苷(Neohesperidin，CAS：13241-33-3，纯度≥98％)，芦荟苷A(Aloin A，CAS：1415-73-2，纯度≥98％)，芦荟苷B(Aloin B，CAS：28317-16-6，纯度≥98％)，芦荟大黄素(Aloeemodin，CAS：481-72-1，纯度≥97％)，大黄酚(Chrysophanol，CAS：481-74-3，纯度≥98％)，以上对照品由上海源叶生物科技有限公司提供。乙腈、甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)，异丙醇、磷酸(色谱纯，南京化学试剂股份有限公司)，甲醇(分析纯，南京化学试剂股份有限公司)。
1.2仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(包括DAD检测器、四元低压梯度泵、AgilentOpenLab色谱工作站，安捷伦科技有限公司)；Waters高效液相色谱仪(包括e2695四元泵、2998二极管阵列检测器、自动进样器，沃特世科技有限公司)；十万分之一电子分析天平(TOLEDOLE204E，METTLER)；万分之一电子分析天平(01193-YP601N，METTLER)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；有机滤头(0.22μm孔径，爱西默科技有限公司)；纯水/超纯水系统。
1.3试验药品
首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；
表1首荟通便胶囊样品统计表(n＝14)
Figure BDA0002567144740000081
2方法与结果
2.1溶液制备
(1)供试品溶液制备：取首荟通便胶囊内容物适量，研细，作为供试样品，备用。取样品粉末0.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液50mL，密塞，称重，超声处理(250W，100Hz)60min，放冷至室温，再称重，用50％甲醇溶液补足减失重量，摇匀，静置，吸取上清液，过0.22μm有机滤头，弃去初滤液，以续滤液作为供试品溶液。
(2)对照品溶液制备：精密称取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚各适量，分别用50％甲醇溶解并制成浓度分别为0.7670mg/mL、1.865mg/mL、1.139mg/mL、0.8010mg/mL、2.9365mg/mL、0.1760mg/mL、0.0880mg/mL的对照品贮备溶液，备用。取上述对照品贮备液适量体积，稀释成每1mL含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚0.0767mg/mL、0.1865mg/mL、0.1139mg/mL、0.0801mg/mL、0.5873mg/mL、0.0176mg/mL、0.0088mg/mL的溶液，即为混合对照品溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.11％磷酸溶液；溶剂：甲醇-超纯水(50：50)；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：222nm；流动相洗脱梯度见表2。理论塔板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计算不得低于5000。
表2洗脱梯度表
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-8 12％→12％ 88％→88％
8-20 12％→20％ 88％→80％
20-22 20％→20％ 80％→80％
22-25 20％→25％ 80％→75％
25-45 25％→30％ 75％→70％
45-55 30％→40％ 70％→60％
55-65 40％→100％ 60％→0％
65-70 100％→100％ 0％→0％
2.3方法学考察
2.3.1线性范围考察
取对照品贮备溶液稀释成系列浓度，按照2.2项下色谱方法测定峰面积，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的进样浓度(mg/mL)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，计算回归方程(Y＝aX+b)，绘制标准曲线，7种活性成分线性回归方程如表3所示。
表3 7种活性成分线性方程
Figure BDA0002567144740000091
Figure BDA0002567144740000101
试验结果表明，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚7种成分在各自相应的质量浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.2精密度试验
取混合对照品溶液，按照2.2项下色谱方法进样，连续进样6次，记录峰面积。得到2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚平均峰面积RSD(％)，见表4，7种成分RSD(％)均小于2.0％，表明本色谱方法系统适用，仪器精密稳定。
表4 7种活性成分精密度试验(n＝6)
Figure BDA0002567144740000102
2.3.3重复性试验
精密称取200101批首荟通便胶囊内容物样品粉末6次，按照2.1项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照2.2项下的色谱方法分别进样，记录峰面积，计算成分含量，结果见表5。各组分6次含量平均值RSD(％)均小于2.5％，表明首荟通便胶囊活性成分含量测定方法重复性良好。
表5 7种活性成分重复性试验(n＝6)
Figure BDA0002567144740000103
Figure BDA0002567144740000111
2.3.4稳定性试验
精密称取200101批首荟通便胶囊内容物供试样品，按照2.1项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h分别按照2.2项下的色谱方法进样，记录峰面积。得到2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚平均峰面积并计算RSD(％)，7种成分RSD(％)均小于2.0％，表明首荟通便胶囊内容物供试样品溶液在48小时内稳定，见表6。
表6 7种活性成分稳定性试验
Figure BDA0002567144740000121
2.3.5准确度试验(加样回收率试验)
精密称取已知含量的首荟通便胶囊内容物样品粉末6份，分别准确加入含有等量各组分对照品的对照品储备液，按2.1项下的供试品溶液制备方法制备样品溶液，按照2.2项下的色谱方法进样，所得结果如表7所示。结果显示，各组分平均回收率RSD(％)均小于4.0％，说明两个含量测定方法准确度良好。
Figure BDA0002567144740000122
表7 7种活性成分回收率试验(n＝6)
Figure BDA0002567144740000123
Figure BDA0002567144740000131
2.4一标多测法测定首荟通便胶囊中7种成分含量
2.4.1相对校正因子的计算
(1)斜率校正法：标准曲线中，X＝(Y-b)/a＝Y/a-b/a，b值通常为误差所引起，在a/b>100时，b/a通常可忽略不计，可用X＝Y/a来直接计算，此时校正因子计算公式：fk/s＝as/ak待测成分质量浓度计算公式：Ck’＝(Ak’×fk/s)/as(as：参照物斜率，ak：其他对照组分斜率)。应用斜率校正法进行计算，得到其它成分相对于2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的fk/s，2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚相对于2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的fk/s见表8。
表8斜率校正法校正因子(fk/s)
Figure BDA0002567144740000141
(2)多点校正法：以多个质量浓度点计算所得的fk/s取平均值做定量用fk/s。校正因子计算公式：fk/s＝(AS×CK)/(Ak×Cs)。待测成分质量浓度计算公式：Ck’＝(fk/s×Cs×Ak’)/AS(As：参照物质色谱峰峰面积，CS：参照物质质量浓度，AK：其他对照组分色谱峰峰面积，Ck：其他对照组分质量浓度，Ak：待测组分色谱峰峰面积)。结果如表9所示。
表9多点校正法校正因子(fk/s，n＝7)
Figure BDA0002567144740000142
Figure BDA0002567144740000151
2.4.2相对保留值的计算
利用相对保留时间来进行定位，即以各待测组分的色谱峰与2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰的保留时间来进行确定。相对保留时间计算公式：RRT＝Tk/Ts(Ts为参照物保留时间，Tk为其他待测组分保留时间)，结果如表10所示。
表10多点校正法相对保留值(RRT，n＝7)
Figure BDA0002567144740000152
3相对校正因子和相对保留值重现性考察
分别考察了3个不同型号Agilent ZORBAX XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)，AgilentZORBAX SB C18(4.6mm×250mm，5μm)，Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、不同实验员、不同试验日期的相对保留时间和保留时间的重现性。
本实验考察了2套不同的色谱系统、不同的色谱柱、试验时间、操作人员对fk/s与RRT的影响，结果见表11、表12；由表可知，不同考察条件下各活性成分的校正因子(fk/s)的RSD(％)值均小于5％，相对保留值的RSD(％)值均小于2％，重现性良好。
表11相对校正因子耐用性试验(fk/s)
Figure BDA0002567144740000153
Figure BDA0002567144740000161
表12相对保留值耐用性试验(RRT)
Figure BDA0002567144740000162
4一测多评结果与外标法测定结果比较
4.1一测多评结果与外标法含量测定结果比较
取14批首荟通便胶囊内容物供试样品按照2.1项下制备对照品溶液、供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，并分别通过一标多测方法与外标法对其进行含量测定，并比较两种测定方法的结果，见表13。由表可知，不同计算方法得到的7种活性成分含量RSD(％)值均小于3％，适用性良好。
表13一测多评结果与外标法含量测定结果(n＝14)
Figure BDA0002567144740000171
Figure BDA0002567144740000181
4.2多点校正相对保留值与外标实际保留时间比较
将14批首荟通便胶囊供试品通过多点校正因子计算的理论保留时间与外标法的实际保留时间进行比较，结果无显著差异，见表14。由表可知，7种活性成分计算保留值与实际保留值之间RSD(％)值均小于1.0％，适用性良好。
表14一测多评结果与外标法保留时间比较(n＝14)
Figure BDA0002567144740000182
Figure BDA0002567144740000191
Figure BDA0002567144740000201
综上所述，本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立了首荟通便胶囊一标多测(QAMS)含量测定方法，此方法通过对提取方法、色谱条件、洗脱梯度等方面的考察，建立了首荟通便胶囊7种成分同时测定的液相色谱方法，进一步以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，通过多点校正法确定了柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚的相对校正因子，采用一标多测法建立了这6个成分的含量测定方法；此6种成分的相对校正因子(fk/s)分别为0.93、0.83、1.06、1.26、0.22、0.28，相对保留值(RRT)分别为1.26、1.42、2.14、2.23、2.51、2.59；采用QAMS法测定14批次的首荟通便胶囊，比较QAMS法所得7个成分的含量与外标法(ESM)的含量测定值，RSD(％)均小于3.0％，比较QAMS法所得计算保留值与ESM法实际保留值，RSD(％)均小于1.0％，表明该方法准确、成本低，可更全面地反映首荟通便胶囊的内在品质，为进一步提升首荟通便胶囊质量标准提供技术依据。
实施例3首荟通便胶囊中何首乌薄层色谱鉴别
A、供试溶液的准备：取200201批次首荟通便胶囊内容物4g，研细，第一次加50％甲醇30ml，加热回流提取30min，第二次加50％甲醇24ml，加热回流提取30min，合并两次提取液，离心，取上清液，用60mL乙醚萃取3次，每次20mL，收集乙醚层，合并萃取液，蒸干，残渣加2mL甲醇溶解，作为供试品溶液。
B、对照药材溶液制备：取何首乌对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；另分别取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚、大黄素对照品，精密称定，加入甲醇溶解，制成1.0mg/mL的对照品溶液。
C、点样、展开：吸取上述5种溶液各2μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以氯仿：甲醇＝7：3为展开剂，展至3cm，取出，晾干，再以二氯甲烷：甲醇：乙酸：水＝15：2：0.5：0.1为展开剂，展至8cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
图4为首荟通便胶囊中何首乌的薄层色谱图，结果表明：含有何首乌的样品在与何首乌对照品溶液色谱以及2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚、大黄素对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。且色谱分离良好，何首乌的特征斑点突出，建立的薄层色谱分析方法可以作为首荟通便胶囊中何首乌的质量检测方法。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种首荟通便胶囊质量检测方法，其特征在于，以薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌，采用一标多测的分析方法，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，以HPLC测定首荟通便胶囊中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量。
2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌是以氯仿-甲醇混合溶液为第一次展开剂，以二氯甲烷-甲醇-乙酸-水混合溶液为第二次展开剂；
优选的，按体积比计，氯仿：甲醇＝7：3；按体积比计，二氯甲烷：甲醇：乙酸：水＝15：2：0.5：0.1。
3.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法鉴别首荟通便胶囊中何首乌包括以下步骤：
A、供试溶液的制备：取首荟通便胶囊内容物适量，加甲醇回流提取，得提取液，取上清液，用乙醚萃取，收集乙醚层，合并，蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，作为供试品溶液；
B、对照品溶液制备：取何首乌对照药材，按步骤A所述方法制成对照药材溶液；另分别取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚、大黄素对照品，精密称定，加入甲醇溶解，制成对照品溶液；
C、点样、展开：吸取上述5种溶液各2-5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以氯仿：甲醇＝7：3为展开剂，展至3cm，取出，晾干，再以二氯甲烷：甲醇：乙酸：水＝15：2：0.5：0.1为展开剂，展至8cm，取出，晾干，置紫外光灯以365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述一标多测法测定首荟通便胶囊中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量包括下列步骤：
A、供试品溶液制备：取首荟通便胶囊内容物适量，研细，过筛，作为供试样品，备用；取样品粉末适量，按重量/体积计加入料液比为1：50-120倍量甲醇溶液，进行超声提取，提取时间为30-75min，放冷至室温，称重，用溶剂补足减失重量，摇匀，静置，吸取上清液，滤过，弃去初滤液，以续滤液作为供试品溶液；
B、对照品溶液制备：制备2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的单一对照品溶液和7种成分的混合对照品溶液；
C、相对保留时间的确定：吸取步骤B所述的7种单一对照品溶液和7种成分混合对照品溶液，分别注入HPLC中进行检测，记录7种单一对照品溶液保留时间，同时记录7种成分混合对照品溶液中各成分的保留时间，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，通过公式RRT＝Tk/Ts计算柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚相对于内参物2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的相对保留时间；公式中Ts为内参物保留时间，Tk为混合对照品溶液中其它6种待测成分的保留时间；
D、相对校正因子的确定：吸取步骤B所述的混合对照品溶液，注入HPLC，测定，记录混合对照品溶液7种成分的峰面积，以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为内参物，根据相对校正因子计算公式fk/s＝(As×Ck)/(Ak×Cs)计算柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的相对校正因子fk/s；公式中As为内参物峰面积，Cs为内参物质量浓度，Ak为其他组分峰面积，Ck为其他组分质量浓度；
E、多成分含量测定：分别吸取步骤A所述的供试品溶液和步骤B所述2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，注入HPLC，测定，根据公式C样＝(A样×C对)/A对计算供试品溶液中2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量；根据步骤C相对保留时间RRT对供试品溶液中的柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚6种成分进行定性，根据步骤D所述相对校正因子fk/s计算供试品溶液中柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚的含量；式中A样为供试品的峰面积，C对为对照品的浓度，A对为对照品的峰面积。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤A所述供试品溶液的制备方法中所用甲醇的浓度为40-60％，优选为50％，步骤A所述供试品溶液的制备方法滤过步骤采用0.22μm的有机滤头。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤B所述混合对照品溶液的制备方法包括下列步骤：
精密称取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚各适量，分别用50％甲醇溶解，并分别制成浓度为0.7670mg/mL、1.865mg/mL、1.139mg/mL、0.8010mg/mL、2.9365mg/mL、0.1760mg/mL、0.0880mg/mL的对照品贮备溶液，备用；取上述对照品贮备液适量体积，稀释成每1mL含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚0.0767mg/mL、0.1865mg/mL、0.1139mg/mL、0.0801mg/mL、0.5873mg/mL、0.0176mg/mL、0.0088mg/mL的溶液，即为混合对照品溶液。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC色谱条件为：采用C18色谱柱；以乙腈为流动相A，0.07％-0.12％磷酸溶液为流动相B进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0-8 12％→12％ 88％→88％ 8-20 12％→20％ 88％→80％ 20-22 20％→20％ 80％→80％ 22-25 20％→25％ 80％→75％ 25-45 25％→30％ 75％→70％ 45-55 30％→40％ 70％→60％ 55-65 40％→100％ 60％→0％ 65-70 100％→100％ 0％→0％
流速：0.8mL/min-1.2mL/min；柱温：26-34℃；进样量：4-10μL；检测波长：212-230nm；
进一步优选为流速为1.1mL/min；柱温为30℃；进样量为6μL，检测波长为222nm。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为AgilentZORBAX XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)、Agilent ZORBAX SB C18(4.6mm×250mm，5μm)或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；
进一步优选为Agilent ZORBAX XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱。
9.根据权利要求4-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤C所述柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚相对于内参物2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的相对保留时间分别为1.27±0.013、1.42±0.020、2.19±0.040、2.27±0.027、2.53±0.014和2.60±0.014；优选地，相对保留时间分别为1.26、1.42、2.14、2.23、2.51和2.59。
10.根据权利要求4-6中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤D所述柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚与2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的相对校正因子分别为0.95±0.043、0.88±0.033、1.06±0.039、1.26±0.039、0.24±0.016和0.29±0.014；优选地，相对校正因子分别为0.93、0.83、1.06、1.26、0.22和0.28。
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