CN114646695B

CN114646695B - 一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法及其应用

Info

Publication number: CN114646695B
Application number: CN202011518212.0A
Authority: CN
Inventors: 张翊; 顾芹英; 张云天; 梅春梅; 温聪聪
Original assignee: Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN114646695A

Abstract

本发明提供一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法及其应用。该方法通过测定银柴胡标准汤剂中的有效成分成分L‑色氨酸的含量，为银柴胡的内在质量的控制提供新的分析手段。采用本发明的方法进行检测时，检测基线平稳、分离度高，耐用性好并且专属性强、准确性高、回收率可靠，本发明极大缩短了检测时间，提升了检测效率，为银柴胡标准汤剂的质量标准研究提供了一套快速高效可行的检测方法，尤其适合规模化生产的检测与监控。

Description

一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法及其应用

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法，以及该检测方法的具体应用。

背景技术

银柴胡为石竹科植物银柴胡Stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.的干燥根。别名银夏柴胡、银胡、山菜根等。

银柴胡味甘，微寒。归肝、胃经。具有清虚热，除疳热的功效，用于治疗阴虚发热，骨蒸潮热，小儿疳热。现代临床研究发现，银柴胡具有抗炎、抗过敏、抗癌、扩张血管、抗动脉粥样硬化、杀精等作用(王秀芬,由会玲.银柴胡的药理作用与临床应用研究[J].河北中医药学报,2012,27(3):43-44)。临床可用于治疗小儿疳积发热、阴虚潮热，久病发热、感冒发热、过敏性疾病、治疗癌症。银柴胡在我国主要分布于内蒙古、宁夏、陕西3省毗邻的干旱少雨的荒漠草原区域。宁夏中部干旱荒漠、半荒漠草原区是发展人工银柴胡种植生产的最佳区域。由于长期无序的过度采挖，我国各地区野生银柴胡资源急剧减少。自20世纪70年代开始，宁夏等地区开展了野生银柴胡人工驯化和种植技术的研究，取得了显著的成果，极大地保护了银柴胡野生资源。随着人工种植面积及产量不断提高，银柴胡的分布区也逐步扩大，但目前银柴胡的野生资源依然缺乏，商品药材绝大部分来源于人工种植。

目前发现银柴胡中主要的化学成分有甾醇类、环肽类、生物碱类、酚酸类、黄酮类以及多种氨基酸等(叶方,杨光义,王刚等.银柴胡的研究进展[J].医药导报,2012,31(9):1174-1177)。关于银柴胡含量测定方法的报道较少，主要集中于总甾醇或生物碱类成分的测定。比如：李静等利用硅胶柱色谱、MCI柱色谱和反相制备液相色谱等手段进行分离纯化，并通过H-NMR、C-NMR等波谱技术进行结构鉴定以研究银柴胡Stellaria dichotoma的生物碱成分及其抗炎活性(李静,敖亮,银柴胡的生物碱成分及其抗炎活性研究.中草药,2018,49(22))。张玉玺等采用薄层扫描法测定银柴胡中α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量(张玉玺,马红军,张立虹.银柴胡中α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇含量测定的方法学研究[J].当代化工,2014,43(11):2474-2475)。李振凯等以总甾醇含量为指标研究了不同干燥方法对银柴胡浸出物及甾醇成分的影响(李振凯,犹卫,王贺瑾,王红,雷燕,梁旺利,彭励.不同干燥方法对银柴胡浸出物及甾醇成分的影响.江苏农业学报,2019,35(4))。上述测试方法操作复杂，耗时相对长，准确性和专属性还有待提高。

近几年，标准汤剂研究广受关注，俨然成为中药配方颗粒和经典名方复方制剂质量控制中的主角。标准汤剂最能体现临床用药形式，标准汤剂作为中药整体质量控制模式的思路越来越清晰。现行的中药饮片标准汤剂定量指标的选择都是基于现版《中国药典》，对银柴胡而言，现行药典未有含量指标。

因此有必要建立一种操作简单、耗时短、专属性强、准确性和稳定性高、尤其适合在规模化生产中检测与监控银柴胡标准汤剂质量的新的分析手段。

发明内容

发明要解决的问题

为了解决现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法，其通过测定L-色氨酸的含量来对银柴胡标准汤剂进行质量检测。

用于解决问题的方案

本发明提供了如下技术方案：

【1】一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法，其中，所述方法包括供试品溶液的制备、参照物溶液的制备和和采用超高效液相色谱仪进行测定，其中，所述参照物溶液的制备包括取L-色氨酸对照品制备得到参照物溶液。

【2】根据【1】所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述参照物溶液的制备包括取L-色氨酸对照品，精密称定，加入第一溶剂溶解。

【3】根据【2】所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述参照物溶液的制备所用的第一溶剂包括水、甲醇及其混合物，优选水或甲醇水溶液，更优选体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液，进一步优选体积浓度为50％的甲醇水溶液。

【4】根据【1】～【3】任一项所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述供试品溶液的制备包括取银柴胡标准汤剂，精密称定，精密加入第二溶剂，密塞，称定重量，进行提取，再称定重量，加入第二溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。

【5】根据【4】所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述供试品溶液的制备所用的第二溶剂包括水、甲醇及其混合物，优选水或甲醇水溶液，更优选体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液，进一步优选体积浓度为50％的甲醇水溶液。

【6】根据【4】或【5】所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述供试品溶液的制备中提取的方式包括超声处理、振摇提取或加热回流提取。

【7】根据【4】～【6】任一项所述的超高效液相色谱检测方法，其中，

所述供试品溶液的制备采用超声处理，超声处理的时间为15～60分钟，进一步优选15～45分钟，更优选30分钟。

【8】根据【4】～【7】任一项所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述银柴胡标准汤剂与第二溶剂的用量比为1g：20～50mL，优选1g：30mL。

【9】根据【1】～【8】任一项所述的超高效液相色谱检测方法，其中，

超高效液相色谱的条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水为流动相，等度洗脱，进一步优选地，乙腈和水的体积比为2:98；检测波长为217nm。

【10】根据【9】所述的超高效液相色谱检测方法，其中，所述色谱条件还包括：流速：0.25～0.35mL/min，优选0.30mL；柱温：25～35℃，优选30℃。

【11】根据【1】～【10】任一项所述的银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法在银柴胡标准汤剂的质量检测和/或鉴别药材产地中的应用。

发明的效果

本发明提供的银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法，测定其有效成分L-色氨酸的含量，为银柴胡的内在质量的控制提供新的分析手段，并且本发明的检测方法还有鉴别药材产地的可能性。采用本发明的方法进行检测时，检测基线平稳、分离度高，耐用性好并且专属性强、准确性高、回收率可靠，本发明极大缩短了检测时间，提升了检测效率，为银柴胡标准汤剂的质量标准研究提供了一套快速高效可行的检测方法，尤其适合规模化生产的检测与监控。需要说明的是，上述的记载并不是公开了本发明的全部实施方式和本发明的全部优点。

附图说明

图1为L-色氨酸在210～400nm波长下的UV图谱；

图2为不同配比条件下银柴胡标准汤剂的UPLC图谱(条件1：乙腈：水＝10:90；条件2：乙腈：水＝8:92；条件3：乙腈：水＝6:94；条件4：乙腈：水＝5:95；条件5：乙腈：水＝2:98)；

图3为不同提取溶剂条件下银柴胡标准汤剂的UPLC图谱；

图4为不同提取方法条件下银柴胡标准汤剂的UPLC图谱；

图5为不同提取溶剂体积条件下银柴胡标准汤剂的UPLC图谱；

图6为不同提取时间条件下银柴胡标准汤剂的UPLC图谱；

图7为对照品的线性关系图；

图8为银柴胡标准汤剂专属性试验；

图9为银柴胡标准汤剂延迟性试验；

图10为银柴胡标准汤剂在不同流速考察条件下的UPLC图谱；

图11为银柴胡标准汤剂在不同柱温考察条件下的UPLC图谱；

图12为银柴胡标准汤剂在不同色谱柱考察条件下的UPLC图谱。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

应当理解，在本申请说明书和权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。

本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选的实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选的实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

除非另有说明，本文中所使用的术语“供试品”是指用作检测或鉴定的实验样品。

除非另有说明，本文中所使用的术语“对照品”是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。

除非另有说明，本文中所使用的术语“精密称定”是指称取重量应准确至所取重量的千分之一，术语“称定”是指称取重量应准确至所取重量的百分之一，术语“精密量取”是指量取体积应准确至所取体积的千分之一，术语“精密吸取”是指通过微量进样器来准确量取样品的操作方式。

除非另有说明，本文中所使用的术语“续滤液”是指过滤时弃去初滤液后继续收集的滤液。与初滤液相比，续滤液更加接近样品的真实浓度，因为过滤介质(如滤膜、滤纸等)有可能会吸附溶质，因而造成初滤液中样品浓度偏低；另外，续滤液更加干净，因为被过滤介质吸附的溶质可以形成滤饼，降低了过滤孔径，因而能够截留更微小的微粒。

除非另有说明，本文中所使用的术语“填充剂”是指在色谱分析法中用作固定相的物质，术语“固定相”是指在色谱分析法中位置固定不动、对样品产生吸附效果的一相，术语“流动相”是指在色谱分析法中位置不固定、可以自由流动、对样品产生解吸效果的一相。

除非另有说明，本文中所使用的术语“等度洗脱”是指在样品的色谱分析周期中，流动相的组成、比例和流速恒定不变的洗脱方式。

除非另有说明，本文中所使用的术语“超高效液相色谱”(或称“UPLC”)是指在高效液相色谱(HPLC)的基础上开发一种全新技术，具有填料颗粒小、检测速度快、分析通量大、灵敏度高等特点。

除非另有说明，含量测定提及的“％”为质量百分数。

本发明提供了一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法，所述方法包括供试品溶液的制备、参照物溶液的制备和和采用超高效液相色谱仪进行测定，其中，所述参照物溶液的制备包括取L-色氨酸对照品制备得到参照物溶液。

<参照物溶液的制备>

本发明选择L-色氨酸作为指标成分。L-色氨酸又名α-氨基吲哚基丙酸，分子式为C₁₁H₁₂N₂O₂。目前对于银柴胡中有效成分氨基酸类化合物方面的研究报道较少，但是氨基酸类化合物具有抗氧化、降低血脂、保护心血管和抗应激等多方面的生物活性，而色氨酸调节采食和营养物质代谢的作用及调节神经与免疫功能，色氨酸的代谢产物对反刍动物有一定的作用(王洪荣,季昀.氨基酸的生物活性及其营养调控功能的研究进展[J].动物营养学报,2013,25(03))，目前尚未有文献报道银柴胡中的色氨酸的测定，因此检测银柴胡标准汤剂中氨基酸类成分，具有一定意义。在本申请的一些具体实施方式中，采用该指标成分进行分析，还有鉴别药材产地的可能性，银柴胡的产地来源包括产地A、产地B、产地C，药材来源于产地C的银柴胡标准汤剂的L-色氨酸的含量约为产地A和产地B的两倍，其中ABC表示银柴胡在中国不同产地。

本发明的参照物溶液的制备包括取L-色氨酸对照品，精密称定，加入第一溶剂溶解。根据L-色氨酸的溶解度，第一溶剂包括水、甲醇及其混合物，优选水或甲醇水溶液，更优选体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液，进一步优选体积浓度为50％的甲醇水溶液。参照物溶液的浓度根据实际可调整，在本发明的一些具体实施方式中，L-色氨酸的浓度为3～15μg/mL，进一步为5～12μg/mL。

<供试品溶液的制备>

本发明的供试品溶液的制备包括取银柴胡标准汤剂作为供试品。根据2016年国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，中药标准汤剂系遵循中医药理论，采用合格饮片按照临床汤剂煎煮方式规范煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。银柴胡标准汤剂是以水作为溶媒对银柴胡饮片进行提取，浓缩制得。在本发明的一些具体实施方式中，可以采用如下方法制备银柴胡标准汤剂：取银柴胡饮片80～150g，称定，置砂锅中，加入800～1000mL水浸泡20～40min，采用机械分体煎药壶，先武火煮沸，再文火煎煮15～30min，趁热过滤，滤液冷水浴冷却；二煎加600～800mL水，武火煮沸后，再文火煎煮10～20min，趁热过滤，滤液冷水浴冷却；两次滤液合并后进行减压浓缩；浓缩至相对密度1.04～1.07(65℃)，将浓缩液分装至西林瓶后，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得银柴胡标准汤剂。本发明的银柴胡标准汤剂由申请单位自制。

在本发明的一些具体实施方式中，本发明的供试品溶液的制备包括取银柴胡标准汤剂，精密称定，精密加入第二溶剂，密塞，称定重量，进行提取，再称定重量，加入第二溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在本发明的一些具体实施方式中，第二溶剂(即提取溶剂)可以选自水、甲醇及其混合物，根据提取后L-色氨酸的含量，本发明优选水或甲醇水溶液，更优选体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液，考虑到仪器和色谱柱的损耗，进一步优选体积浓度为50％的甲醇水溶液。在本发明的一些具体实施方式中，银柴胡标准汤剂与第二溶剂的用量比为1g：20～50mL，从节省溶剂的角度及萃取方便综合考虑，优选1g：30mL。

供试品溶液的制备中提取的方式包括超声处理、振摇提取或加热回流提取。上述三者提取方式测得L-色氨酸的含量相近，其中加热回流的提取方式操作较为复杂，振摇提取方式容易使提取不完全，因此，考虑实验操作的简便性和提取结果的稳定性，选择提取方式为超声处理。超声处理的时间为15～60分钟，进一步优选15～45分钟，本发明研究表明超声15分钟后，L-色氨酸的含量基本不再增加，说明提取充分，综合考虑检验周期和提取充分等因素，优选超声时间为30分钟。超声功率为100～400W，优选为200～300W，进一步地超声功率为250W，超声频率为10～100KHz，优选为30～50KHz，更优选为40KHz。在供试品制备过程中，对于过滤没有特定的限定，可以是本领域任何常规的过滤手段，优选为膜过滤，例如采用孔径为0.1～0.5μm的微孔滤膜，进一步优选为0.22μm的微孔滤膜。

本发明的供试品溶液的制备方法能够对L-色氨酸进行有效、充分的提取，还能够减少其他成分对测定的影响，可以得到良好峰型的色谱峰，分离度高。另外，本发明的供试品溶液在12小时稳定性良好。

<采用超高效液相色谱仪进行测定>

本发明采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，分析周期短，分离度更高，更加环保，使用UPLC检测大大提高了研究检测的精度和效率。

本发明的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，可选的色谱柱包括SB AQ(Agilent，2.1×100mm，1.8μm)、CORTECS T3(Waters，2.1×100mm，1.6μm)、BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)等，上述色谱柱的分离效果均较好，保留时间适中。在本发明的一些具体实施方式中，色谱柱选用BEH C18(柱长为100mm，内径为2.1nm，粒径为1.7μm)。本发明采用二元流动相体系，乙腈-水为流动相，进行等度洗脱,采用上述流动相可以实现结果色谱峰的分离且峰型良好。进一步优选地，出于获得更高的分离度，乙腈和水的体积比为2:98。对L-色氨酸进行全波长扫描，结果显示在217nm处出现最大吸收，因此选择217nm作为检测波长。在本发明的一些具体实施方式中，流速在0.25mL/min～0.35mL/min区间对样品的测定结果影响较小，柱温在25℃～35℃范围内波动时，测得L-色氨酸含量相近，进一步地，流速优选0.30mL，柱温优选30℃。进样量为1-3μL，优选1μL。

本发明基于参照物溶液的UPLC图谱，确定所述供试品溶液的UPLC图谱中与所述对照品对应的色谱峰，并利用所述色谱峰的峰面积，按照峰面积归一化法计算银柴胡标准汤剂中L-色氨酸的含量。本发明检测时间短，在15分钟内可完成。

以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。本领域技术人员容易理解的是，下列实施例中所描述的具体实验条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当且不会被理解为用于限制本发明。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围之内。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的仪器、材料、试剂等均可通过常规商业手段获得。

实施例一：银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法的构建

1.仪器、试剂与样品：

Waters-ACQUIYT-UPLC-H-Class，超高效液相色谱系统；Waters-Quaternary-Solvent-Manager-四元泵；Sample-manager-FTN自动进样器；Waters-UPLC-PDA检测器；Empower-3色谱工作站；KQ-250E超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；ME204E/02型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；GKC114型控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；HY-4振荡器(金坛市科兴仪器厂)；纯水系统(Sartorius公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)；乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

L-色氨酸(批号：6135)，购自于上海诗丹德公司，供含量测定用，纯度以98％计，使用前无须处理。银柴胡标准汤剂由江阴市天江药业有限公司提供。

2.参照物溶液的制备：

取L-色氨酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含5μg的溶液，即得。

3.供试品溶液的制备：

将银柴胡标准汤剂样品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液15mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.色谱条件的确定：

4.1检测波长的确定

采集参照物溶液在210～400nm波长下的UV光谱图，结果如图1所示，通过对光谱图的分析可知，在217nm波长处存在明显的UV吸收峰，确定银柴胡标准汤剂中L-色氨酸含量测定的检测波长为217nm。

4.2流动相的选择

本发明根据现有实验条件对测定方法进行对流动相的配比进行优化(条件1：乙腈：水＝10:90；条件2：乙腈：水＝8:92；条件3：乙腈：水＝6:94；条件4：乙腈：水＝5:95；条件5：乙腈：水＝2:98)，具体见图2，最终选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1nm，粒径为1.7μm)；以乙腈-水(2：98)为流动相；流速为每分钟0.30mL；柱温为30℃；检测波长为217nm。理论板数按L-色氨酸峰计算应不低于5000。

采用该流动相检测基线平稳，目标成分分离度良好，检测时间14分钟内可完成。

4.3供试品溶液的制备

(1)提取溶剂的考察

取银柴胡标准汤剂样品(批号：DG1903181)约0.5g，平行5组，每组两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇(此处％是指体积浓度)各15mL，密塞，称定重量，分别进行超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同的供试品溶液。分别精密吸取各供试品溶液1μL，注入液相色谱仪，按“4.2”项下色谱条件连续进样2次，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表1，图3。

表1不同提取溶剂的比较

结论：由结果可知，除以甲醇为提取溶剂时含量相对较低，以水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇提取时测得L-色氨酸含量相近，考虑到仪器和色谱柱的损耗，最终选择50％甲醇为提取溶剂。

(2)提取方式的考察

取银柴胡标准汤剂样品(批号：DG1903181)约0.5g，平行3组，每组两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流、振摇提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同的供试品溶液。分别精密吸取各供试品溶液1μL，注入液相色谱仪，按“4.2”项下色谱条件连续进样2次，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量，计算相对标准偏差(RSD)，得到不同提取方式考察结果，具体见表2，图4。

表2提取方式的比较

结论：不同提取方式测得L-色氨酸的含量相近，其中加热回流的提取方式操作较为复杂，振摇提取方式容易使提取不完全，因此，考虑实验操作的简便性和提取结果的稳定性，选择提取方式为超声处理。

(3)提取溶剂体积的考察

取银柴胡标准汤剂样品(批号：DG1903181)约0.5g，平行3组，每组两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇10mL、15mL、25mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同的供试品溶液。分别精密吸取各供试品溶液1μL，注入液相色谱仪，按“4.2”项下色谱条件连续进样2次，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量，计算相对标准偏差(RSD)，得到不同提取溶剂体积考察结果，具体见表3，图5。

表3提取溶剂体积的比较

(4)提取时间的考察

取银柴胡标准汤剂样品(批号：DG1903181)约0.5g，平行4组，每组两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同的供试品溶液。分别精密吸取各供试品溶液1μL，注入液相色谱仪，按“4.2”项下色谱条件连续进样2次，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量，计算相对标准偏差(RSD)，得到不同提取时间考察结果见表4，图6。

表4提取时间的比较

结论：不同超声处理时间，银柴胡标准汤剂中的L-色氨酸含量较为接近，为保证提取完全，提取时间采用30分钟。

综合以上结果，本发明在下述实施例二中采用的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1nm，粒径为1.7μm)；以乙腈-水(2：98)为流动相；流速为每分钟0.30mL；柱温为30℃；检测波长为217nm。理论板数按L-色氨酸峰计算应不低于5000。

供试品溶液的制备方法为：取银柴胡标准汤剂约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例二：银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法的方法学验证

(1)线性

分别精密吸取参照物溶液(取L-色氨酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成L-色氨酸浓度为11.21μg/mL的参照物溶液)0.1μL、0.2μL、0.5μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.5μL、1.8μL注入液相色谱仪，按实施例一得到的色谱条件进样，以峰面积积分值为纵坐标，各成分进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，L-色氨酸回归方程：Y＝25,724,904.2233X-12,393.2535，R＝0.9999，结果见表5，图谱见图7。

表5对照品峰面积积分值与进样量关系

结果表明：L-色氨酸的进样量在0.00112μg～0.02018μg范围内，与峰面积值呈良好的线性关系。

(2)精密度试验

1)仪器精密度试验

精密吸取供试品溶液(批号：DG1903181)，注入液相色谱仪，按实施例一确定的色谱条件进样，进样1μL，连续进样6次，记录其峰面积，计算相对标准偏差，结果见下表6。

表6仪器精密度试验

结果表明：仪器精密度试验RSD为0.67％，结果良好。

2)重复性试验

取银柴胡标准汤剂样品(批号：DG1903181)约0.5g，精密称定，平行6份，分别按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例一确定的色谱条件进样，分别进样1μL，连续进样2次，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量，计算RSD，结果见表7。

表7银柴胡标准汤剂样品的重复性试验

结果表明：重复性试验RSD为0.87％，结果良好。

3)中间精密度

取银柴胡标准汤剂样品(批号：DG1903181)，分别由两个实验员按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制备3份供试品溶液，按实施例一确定的色谱条件进样，分别于不同时间在相同仪器上(Waters-ACQUIYT-UPLC-H-Class，超高效液相色谱系统)分别进样1μL，连续进样2次，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量和RSD，结果见表8。

表8中间精密度试验

结果：中间精密度的RSD为0.88％，试验结果良好。

(3)准确度试验

取已知L-色氨酸的含量的银柴胡标准汤剂样品0.25g(批号：DG1903181，L-色氨酸：0.21mg/g)，平行六份，精密称定，分别加入0.25g与样品含量相同的L-色氨酸对照品，按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按实施例一确定的色谱条件进样，分别进样1μL，连续进样2次，以下列公式计算回收率，RSD，结果见表9。回收率(％)＝(测得量(mg)-样品中含量(mg))/加入对照品量(mg)×100％

表9准确度试验

结果：L-色氨酸回收率在85％～110％之间，准确度试验良好。

(4)专属性试验

取空白溶剂，L-色氨酸参照物溶液(按照实施例一确定的方法制备)，供试品溶液(按实施例一确定的供试品溶液(批号：DG1903181)的制备方法制备)，按照实施例一得到的色谱条件各进样1μL，结果见图8。结论：由结果可知，溶剂对L-色氨酸没有干扰，具有较强的专属性。

(5)延迟性试验

取银柴胡标准汤剂样品1份(批号：DG1903181)，按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例一得到的色谱条件进样分析，在相同的色谱条件上，保持乙腈比例最高时的洗脱梯度，洗脱时间延长一倍，记录色谱图，结果见图9。结论：原梯度洗脱结束后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则。

(6)耐用性试验

1)稳定性试验

取银柴胡标准汤剂样品1份(批号：DG121904109)，按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例一确定的色谱条件进样分析，每隔2小时进样1μL，测定峰面积值，计算其RSD，共测定12小时，结果见表10。

表10稳定性试验测定结果

结果：供试品溶液在12小时内稳定性良好(RSD％＜2.0％)。

2)不同流速考察

取银柴胡标准汤剂样品1份(批号：DG1903181)，按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min三个流速，结果见表11、图10。

表11不同流速考察

结果：流速在0.25mL/min～0.35mL/min区间对样品的测定结果影响较小，耐用性良好。

3)柱温考察

取银柴胡标准汤剂样品1份(批号：DG1903181)，按实施例一得到的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察25℃、30℃、35℃三个温度，结果见表12、图11。

表12不同柱温的考察

结果：柱温在25℃～35℃范围内波动时，测得L-色氨酸含量相近，说明该色谱条件在此温度变化范围内耐用性良好。

4)色谱柱考察

取银柴胡标准汤剂样品1份(批号：DG1903181)，按实施例一得到的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别采用柱1：SB AQ(Agilent，2.1×100mm，1.8μm)、柱2：CORTECS T3(Waters，2.1×100mm，1.6μm)、柱3：BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)三种色谱柱，对银柴胡标准汤剂样品进行分析，结果见表13、图12。

表13不同色谱柱的比较

结果：三种不同型号色谱柱的分离效果均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。

实施例三：采用本发明的UPLC检测方法检测不同批次的银柴胡标准汤剂

取20批银柴胡标准汤剂，按实施例一确定的供试品溶液的制备方法制备样品，按实施例一制备参照物溶液，按实施例一确定的色谱条件进样分析，进样1μL，记录其峰面积，计算L-色氨酸的含量，具体结果如下：

表14不同批次的银柴胡标准汤剂的L-色氨酸的检测

结果表明，采用本发明的检测方法能够对不同批次的银柴胡标准汤剂进行检测。根据银柴胡标准汤剂中L-色氨酸的含量测定结果，银柴胡标汤中L-色氨酸的含量的均值0.028％，最大值为0.049，最小值为0.013，差异较大，可能与其产地相关，上述批次药材来源于产地C的银柴胡标准汤剂的L-色氨酸的含量约为产地A和产地B的两倍，意味着该指标成分的检测有鉴别药材产地C的可能性。

以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述方法包括供试品溶液的制备、参照物溶液的制备和采用超高效液相色谱仪进行测定，

其中，

所述供试品溶液的制备包括：取银柴胡标准汤剂，精密称定，精密加入第二溶剂，密塞，称定重量，进行提取，再称定重量，加入第二溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；所述第二溶剂为水或甲醇水溶液；

所述参照物溶液的制备包括：取L-色氨酸对照品，精密称定，加入第一溶剂溶解；

所述超高效液相色谱的条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水为流动相，等度洗脱，乙腈和水的体积比为2:98；检测波长为217nm。

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述参照物溶液的制备所用的第一溶剂包括水、甲醇及其混合物。

3.根据权利要求1或2所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述参照物溶液的制备所用的第一溶剂为水或甲醇水溶液。

4.根据权利要求3所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述参照物溶液的制备所用的第一溶剂为体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液。

5.根据权利要求3所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述参照物溶液的制备所用的第一溶剂为体积浓度为50％的甲醇水溶液。

6.根据权利要求1所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述供试品溶液的制备所用的第二溶剂为体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述供试品溶液的制备所用的第二溶剂为体积浓度为50％的甲醇水溶液。

8.根据权利要求1所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述供试品溶液的制备中提取的方式包括超声处理、振摇提取或加热回流提取。

9.根据权利要求1所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述供试品溶液的制备中提取的方式采用超声处理，超声处理的时间为15～60分钟；所述银柴胡标准汤剂与第二溶剂的用量比为1g：20～50mL。

10.根据权利要求9所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述超声处理的时间为15～45分钟。

11.根据权利要求9所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述超声处理的时间为30分钟。

12.根据权利要求9所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述银柴胡标准汤剂与第二溶剂的用量比为1g：30mL。

13.根据权利要求1所述的超高效液相色谱检测方法，其特征在于，

所述条件还包括：流速：0.25～0.35mL/min，柱温：25～35℃。

14.根据权利要求1～13任一项所述的银柴胡标准汤剂的超高效液相色谱检测方法在银柴胡标准汤剂的质量检测和/或鉴别药材产地中的应用。