CN108072708A - 测定甘草制雪胆中甘草酸含量的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法，它包括以下步骤：(1)甘草酸标准曲线的建立：a、对照品溶液的制备；b、对照品溶液的测定；(2)待测样品中甘草酸的含量测定：c、供试品溶液的制备；d、供试品溶液的测定。本发明成功建立了测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法，可以简便、快速、准确地测定甘草制雪胆中甘草酸的含量，可以监控甘草制雪胆中的活性成分含量，真实地反映药品的内在质量，为甘草制雪胆的质量控制提供了有效保障。

Description

测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法

技术领域

本发明涉及药材检测领域，具体涉及甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法。

背景技术

雪胆为葫芦科雪胆属植物长果雪胆Hemsleya dolichocarpa W.J.Chang、峨眉雪胆Hemsleya omeiensis L.T.Shen et W.J.Chang或巨花雪胆Hemsleya giganthaW.J.Chang的干燥块根。

甘草制雪胆为用质量比0.4倍量的甘草汁闷润7.5h后，80℃烘干12h后晾干的雪胆制品。甘草制雪胆具有清热解毒，消炎止痛的功效，用于治疗菌痢，肠炎，支气管炎，急性扁桃体炎，虚火牙痛，胃痛等疾病。

甘草酸及甘草酸盐是甘草清热解毒的有效成分也是甘草质量控制的指标成分，甘草酸还是是甘草甜味的主要成分(张明发,沈雅琴.甘草及其活性成分抗炎与抗炎机制的研究进展[J].现代药物与临床,2011,04:261-268；韩瑶聃,王彬,王政雨,张亚弢,杨凌云,周金培,张惠斌.甘草酸药理作用的研究进展[J].中国新药杂志,2012,21:2499-2505；李志华,颜苗,张毕奎,李焕德,方平飞.基于药动学的甘草配伍减毒机制研究进展[J].中草药,2015,23:3611-3616.)。

因此，为了确保甘草制雪胆的质量和药效，需要一种能准确、可靠测定甘草制雪胆中甘草酸含量的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法，它包括以下步骤：

(1)甘草酸标准曲线的建立：

a、对照品溶液的制备：

取甘草酸对照品，加甲醇配制成对照品溶液；

b、对照品溶液的测定：

配制系列浓度的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到甘草酸的标准曲线；

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

检测波长：250nm；

流动相：A为乙腈；B为0.05％磷酸水溶液，梯度洗脱程序如下：

(2)待测样品中甘草酸的含量测定：

c、供试品溶液的制备：

取待测样品，加甲醇提取，过滤得供试品溶液；

d、供试品溶液的测定：

取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中甘草酸的含量。

进一步地，所述色谱条件的柱温为25℃～35℃，优选30℃。

进一步地，所述色谱条件的流速0.8～1.2mL/min；优选流速1.0mL/min。

进一步地，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。

进一步地，所述色谱柱为Diamonsil-C18柱。

进一步地，步骤(3)中，所述甲醇的浓度为70％。

进一步地，步骤(3)中，所述提取是超声提取或回流提取。

进一步地，步骤(3)中，所述提取是超声提取30分钟。

进一步地，步骤(3)中，所述甲醇与待测样品的体积质量比为50mL：1g。

进一步地，所述甘草制雪胆是通过下述方法制备得到的：

取雪胆饮片，加入甘草汁，拌匀，闷润7.5h，在80℃下烘12h，放凉即得；所述雪胆饮片与甘草的重量比为5:2。

本发明中，所述的“甲醇”包括甲醇任意浓度下的水溶液。

试验结果证明，本发明成功建立了测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法，可以简便、快速、准确地测定甘草制雪胆中甘草酸的含量，可以监控甘草制雪胆中的活性成分含量，真实地反映药品的内在质量，为甘草制雪胆的质量控制提供了有效保障。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为梯度洗脱程序考察项下，梯度洗脱程序1的HPLC色谱图。

图2为梯度洗脱程序考察项下，梯度洗脱程序2的HPLC色谱图。

图3为梯度洗脱程序考察项下，梯度洗脱程序3的HPLC色谱图。

图4为柱温考察项下，柱温25℃时的HPLC色谱图。

图5为柱温考察项下，柱温35℃时的HPLC色谱图。

图6为流速考察项下，流速0.8mL/min时的HPLC色谱图。

图7为流速考察项下，流速1.0mL/min时的HPLC色谱图。

图8为流速考察项下，流速1.2mL/min时的HPLC色谱图。

图9为甘草酸单铵盐对照品的HPLC图。

图10为制雪胆供试品溶液的HPLC图。

图11为甘草酸单铵盐对照品标准曲线。

具体实施方式

实施例1本发明的HPLC方法及方法学验证

1仪器与试药

仪器：日本Shimadzu LC-20AT高效液相系统(DAD检测器SPD-M20A 230V)；BP211D电子分析天平(感量0.00001g，德国Sartorius公司)；KQ-300E超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BP-61电子天平(感量0.0001g，德国Sartorius公司)。

试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

对照品：甘草酸单铵盐对照品(批号：MUST-13093010，纯度>98％，成都曼斯特生物科技有限公司)。

雪胆购于荷花池市场，经成都中医药大学药学院生药教研室卢先明教授鉴定为葫芦科植物雪胆Hemsleya omeiensis L.T.Shen et W.J.Chang的干燥块根。

雪胆饮片：取上述雪胆，除去杂质，洗净，润透。切厚片，干燥。

2色谱条件的选择及确定

制雪胆供试品溶液的制备

取制雪胆(过二号筛)粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

色谱柱：Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。

检测波长：250nm。

2.1梯度洗脱程序的考察

在柱温为30℃，流速为1mL/min的条件下考察了梯度洗脱程序，梯度洗脱程序1-3分别如表1-3所示，流动相：A为乙腈；B为0.05％磷酸水溶液。结果如图1-3所示。

表1梯度洗脱程序1(药典测甘草酸单铵盐方法)

表2梯度洗脱程序2

表3梯度洗脱程序3

结果显示，梯度洗脱程序3的样品分离度较好，可有效检测甘草酸单铵盐。

2.2柱温的考察

在梯度洗脱程序3，流速为1mL/min的条件下考察了25℃和35℃对样品的分离效果，结果见图4和图5，和图3比较不同温度下的峰形。

可以看出，柱温30℃时样品峰形较好，故选择柱温为30℃。

2.3流速的考察

在梯度洗脱程序3，柱温为30℃的条件下，分别考察0.8、1.0、1.2mL/min流速对样品的分离效果，结果见图6-8。

可以看出，流速对出峰时间和样品的分离度都有所影响，本发明选择流速为1mL/min。

2.4色谱条件的确定

检测波长：250nm；梯度洗脱程序如表3所示；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；灵敏度：0.01AUFS。

理论板数按甘草酸单铵盐峰计算应不低于5000。

甘草酸单铵盐对照品溶液及制雪胆供试品溶液的高效液相色谱图见图9、图10。

3方法学考察

3.1线性关系考察

取甘草酸单铵盐对照品溶液2、5、10、15、20μL，按上述方法测定，以进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表4和图11。

表4线性关系考察结果

3.2精密度试验

精密吸取甘草酸单铵盐对照品溶液10μL，连续进样6次测定，以归并后的色谱峰面积计算，结果见表5。

表5精密度试验结果

结果表明，甘草酸单铵盐峰面积的RSD<2％，精密度良好。

3.3重复性试验

精密称取同批制雪胆样品6份，按供试品溶液制备项下制备，以上述色谱条件测定，得峰面积值并计算含量，结果见表6。

表6重复性试验结果

结果表明，甘草酸单铵盐峰面积的RSD＝2.18％，供试品重现性良好。

3.4稳定性试验

取制雪胆样品溶液，分别于0、2、4、8、12、48h测定，并以归并后的色谱峰面积计算，结果见表7。

表7稳定性试验结果

结果表明，测得样品中峰面积值的RSD＝1.97％<2％，样品在0～48h内稳定性良好。

3.5加样回收率试验

取已知含量的制雪胆样品粉末约0.5g，精密称定后，分别加入对照品甘草酸单铵盐适量，按上述方法制备样品溶液并测定，计算回收率，结果见表8。

表8加样回收率试验结果

结果表明，回收率在95％～105％之间，加样回收良好。

综上所述，本发明成功建立了测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法，可以简便、快速、准确地测定甘草制雪胆中甘草酸的含量，可以监控甘草制雪胆中的活性成分含量，真实地反映药品的内在质量，为甘草制雪胆的质量控制提供了有效保障。

Claims (10)

1.测定甘草制雪胆中甘草酸含量的HPLC方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)甘草酸标准曲线的建立：

a、对照品溶液的制备：

取甘草酸对照品，加甲醇配制成对照品溶液；

b、对照品溶液的测定：

配制系列浓度的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到甘草酸的标准曲线；

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

检测波长：250nm；

流动相：A为乙腈；B为0.05％磷酸水溶液，梯度洗脱程序如下：

(2)待测样品中甘草酸的含量测定：

c、供试品溶液的制备：

取待测样品，加甲醇提取，过滤得供试品溶液；

d、供试品溶液的测定：

取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中甘草酸的含量。

2.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为25℃～35℃，优选30℃。

3.根据权利要求1或2所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的流速0.8～1.2mL/min；优选流速1.0mL/min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。

5.根据权利要求4所述的HPLC方法，其特征在于：所述色谱柱为Diamonsil-C18柱。

6.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(3)中，所述甲醇的浓度为70％。

7.根据权利要求6所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(3)中，所述提取是超声提取或回流提取。

8.根据权利要求7所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(3)中，所述提取是超声提取30分钟。

9.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于：步骤(3)中，所述甲醇与待测样品的体积质量比为50mL：1g。

10.根据权利要求1-9任一项所述的HPLC方法，其特征在于：所述甘草制雪胆是通过下述方法制备得到的：

取雪胆饮片，加入甘草汁，拌匀，闷润7.5h，在80℃下烘12h，放凉即得；所述雪胆饮片与甘草的重量比为5:2。