CN111948308A - 一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，所述光果甘草用绿色分析方法的主体流程包括检测波长选择、洗脱梯度选择、基础材料选择、溶液制备、多项实验以及对比实验，所述基础材料选择包括仪器选择、试剂选择和药材选择，所述溶液制备包括色谱条件、混合对照品溶液的制备和供试品溶液的制备，所述多项实验包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验和样品含量测定，可用于光果甘草中甘草酸和光甘草定的测定，但本实验所建立的分析方法可在20分钟内完成测定，检测效率高、流动相用量少，且流动相为乙醇，能够显著减少有毒有机溶剂的使用，更加绿色环保。
Description
技术领域
本发明属于光果甘草检测相关技术领域，具体涉及一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法。
背景技术
光果甘草为豆科多年生草本，根与根状茎粗壮，直径0.5-3cm，根皮褐色，内层黄色，具甜味，其根及根状茎供药用，具补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药之效，现代研究已表明光果甘草中富含多种活性成分，主要是以甘草酸为代表的三萜类化合物和以光甘草定为代表的黄酮类化合物，甘草酸是甘草次酸的二葡萄糖醛酸苷，是甘草产生甜味的主要物质。
现有的光果甘草检测技术存在以下问题：采用高效液相法分析甘草酸和光甘草定时，乙腈/甲醇常做为优选的流动相溶剂，因为这两种有机溶剂与水的完全混溶，有相对较低的粘度以及较低的UV截止波长，尽管乙腈/甲醇具有这些卓越的优势，但在环境和健康安全方面仍存在许多问题，乙腈属于易燃，易挥发和有毒有机试剂，甲醇易被吸入和皮肤接触吸收，并被人代谢为甲醛和甲酸，它也被列为危险溶剂，上述两种有机溶剂的废物都必须作为化学废物处理，这不仅成本高昂，而且还会增加实验室的环境废物处理负担。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，以解决上述背景技术中提出采用高效液相法分析甘草酸和光甘草定时，乙腈/甲醇常做为优选的流动相溶剂，因为这两种有机溶剂与水的完全混溶，有相对较低的粘度以及较低的UV截止波长，尽管乙腈/甲醇具有这些卓越的优势，但在环境和健康安全方面仍存在许多问题，乙腈属于易燃，易挥发和有毒有机试剂，甲醇易被吸入和皮肤接触吸收，并被人代谢为甲醛和甲酸，它也被列为危险溶剂，上述两种有机溶剂的废物都必须作为化学废物处理，这不仅成本高昂，而且还会增加实验室的环境废物处理负担。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，所述光果甘草用绿色分析方法的主体流程包括检测波长选择、洗脱梯度选择、基础材料选择、溶液制备、多项实验以及对比实验，所述基础材料选择包括仪器选择、试剂选择和药材选择，所述溶液制备包括色谱条件、混合对照品溶液的制备和供试品溶液的制备，所述多项实验包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验和样品含量测定。
优选的，所述检测波长选择的操作步骤如下：
查阅文献可知甘草酸的最大吸收波长为249nm，光甘草定的最大吸收波长为230nm和283nm，当选用249nm时，光甘草定在此波长下几乎没有吸收，而甘草酸在230nm波长下的吸收值优于283nm，综合考虑后，本方法选择检测波长为230nm。
优选的，所述洗脱梯度选择的操作步骤如下：
设定不同的洗脱梯度，根据其洗脱梯度下的色谱峰的峰形及分离度，最终确定最佳洗脱梯度为0-3min，A:B＝55:45；15min，A:B＝70:30；17min，A:B＝55:45，20min，停止。
优选的，所述基础材料选择的操作步骤如下：
步骤一：选用高效液相色谱仪、手提式高速万能粉碎机、超声清洗仪、电子分析天平和台式高速离心机；
步骤二：选用光甘草定对照品(纯度≥98％)、甘草酸对照品(纯度≥98％)、无水乙醇、乙醇和三氟乙酸；
步骤三：选用豆科植物光果甘草的根和根茎，在50℃环境烘干，粉碎后备用。
优选的，所述溶液制备的操作步骤如下：
色谱条件：采用汉邦色谱柱，以乙醇(A)-0.1％三氟乙酸(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度为0-3min，A:B＝55:45；15min，A:B＝70:30；17min，A:B＝55:45，20min，停止，流速为0.8mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃；
混合对照品溶液的制备：分别精密称取光甘草定和甘草酸的对照品适量，加70％乙醇水溶液制成每1mL分别含光甘草定0.1mg，甘草酸1mg的混合溶液，作为混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取样品粉末(过60目筛)1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入60％乙醇水溶液，定容至刻度线，密塞，超声(频率40kHz，功率300W)提取30min，放冷，用60％乙醇溶液补至刻度线，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
优选的，所述多项实验的操作步骤如下：
步骤一：基于“混合对照品溶液的制备”项下混合对照品溶液，来进行线性关系考察；
步骤二：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试品溶液，来进行精密度试验；
步骤三：基于“供试品溶液的制备”项方法制备成供试品溶液，来进行稳定性试验；
步骤四：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试品溶液，来进行重复性试验；
步骤五：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试溶液以及“色谱条件”项下色谱条件测定，来进行加样回收率试验；
步骤六：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，来进行样品含量测定。
优选的，所述对比实验的操作步骤如下：
步骤一：基于现有甘草酸与光甘草定含量测定采用的高效液相色谱条件下，与本试验所采用的甘草酸与光甘草定含量测定采用的高效液相色谱条件，来进行对比；
步骤二：综合对比数据，来分析不同方法下的测定结果。
与现有技术相比，本发明提供了一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，具备以下有益效果：
1、本发明采用了新型绿色分析方法来测定光果甘草中甘草酸和光甘草定，该方法相较于吕娇方法，由甘草酸和光甘草定的分离度，不对称度和理论塔板数可知，两种方法均准确可靠，可用于光果甘草中甘草酸和光甘草定的测定，但本实验所建立的分析方法可在20分钟内完成测定，检测效率高、流动相用量少，且流动相为乙醇，能够显著减少有毒有机溶剂的使用，更加绿色环保。
2、本发明首次将乙醇作为基础的流动相，采用高效液相法同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的含量，该方法准确可靠，专属性强，结果稳定，重复性好，绿色环保，能够用于光果甘草中甘草酸和光甘草定的测定。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1是本发明中混合对照品溶液的HPLC图谱(绿色方法，其中1为甘草酸，2为光甘草定)；
图2是本发明中光果甘草样品的HPLC图谱(绿色方法，其中1为甘草酸，2为光甘草定)；
图3是本发明中混合对照品溶液的HPLC图谱(吕姣方法，其中1为甘草酸，2为光甘草定)；
图4是本发明中光果甘草样品的HPLC图谱(吕姣方法，其中1为甘草酸，2为光甘草定)；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明提供一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法技术方案：
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括检测波长选择、洗脱梯度选择、基础材料选择、溶液制备、多项实验以及对比实验，基础材料选择包括仪器选择、试剂选择和药材选择，溶液制备包括色谱条件、混合对照品溶液的制备和供试品溶液的制备，多项实验包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验和样品含量测定。
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括检测波长选择的操作步骤如下：
查阅文献可知甘草酸的最大吸收波长为249nm，光甘草定的最大吸收波长为230nm和283nm，当选用249nm时，光甘草定在此波长下几乎没有吸收，而甘草酸在230nm波长下的吸收值优于283nm，综合考虑后，本方法选择检测波长为230nm。
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括洗脱梯度选择的操作步骤如下：
设定不同的洗脱梯度，根据其洗脱梯度下的色谱峰的峰形及分离度，最终确定最佳洗脱梯度为0-3min，A:B＝55:45；15min，A:B＝70:30；17min，A:B＝55:45，20min，停止。
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括基础材料选择的操作步骤如下：
步骤一：选用高效液相色谱仪、手提式高速万能粉碎机、超声清洗仪、电子分析天平和台式高速离心机；
步骤二：选用光甘草定对照品(纯度≥98％)、甘草酸对照品(纯度≥98％)、无水乙醇、乙醇和三氟乙酸；
步骤三：选用豆科植物光果甘草的根和根茎，在50℃环境烘干，粉碎后备用。
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括溶液制备的操作步骤如下：
色谱条件：采用汉邦色谱柱，以乙醇(A)-0.1％三氟乙酸(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度为0-3min，A:B＝55:45；15min，A:B＝70:30；17min，A:B＝55:45，20min，停止，流速为0.8mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃；
混合对照品溶液的制备：分别精密称取光甘草定和甘草酸的对照品适量，加70％乙醇水溶液制成每1mL分别含光甘草定0.1mg，甘草酸1mg的混合溶液，作为混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取样品粉末(过60目筛)1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入60％乙醇水溶液，定容至刻度线，密塞，超声(频率40kHz，功率300W)提取30min，放冷，用60％乙醇溶液补至刻度线，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括多项实验的操作步骤如下：
步骤一：分别精密量取“混合对照品溶液的制备”项下混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1；
表1甘草酸、光甘草定线性关系考察结果
| 化合物 | 回归方程 | R<sup>2</sup> | 线性范围(mg/ml) |
| 甘草酸 | y＝74.508x-1.2572 | 0.9999 | 0.05～2.0 |
| 光甘草定 | y＝1581.3x-2.0708 | 0.9999 | 0.01～0.2 |
步骤二：取光果甘草样品粉末(过60目筛)按照“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，依次测定，计算得甘草酸，光甘草定峰面积的日内RSD分别为0.13％和0.09％，日间精密度分别为0.44％和0.55％，表明仪器的精密度良好；
步骤三取光果甘草样品粉末(过60目筛)，按照“供试品溶液的制备”项方法制备成供试品溶液，在室温下保存，分别于0、2、4、6、8、10、12h进样，依次测定，甘草酸和光甘草定峰面积的RSD分别为0.32％和0.28％，结果表明供试品溶液在12h内基本稳定；
步骤四：取光果甘草样品粉末(过60目筛)6份，按照“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试品溶液，依次测定，测得甘草酸和光甘草定峰面积RSD分别为1.50％和1.39％。结果表明本法重复性良好；
步骤五：取已知含量光果甘草样品粉末适量(过60目筛)6份，精密加入每1mL含甘草酸、光甘草定分别为1.49mg和0.067mg的混合对照品溶液2mL，按照“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试溶液，按“色谱条件”项下色谱条件测定，计算加样回收率，回收率试验结果表明，甘草酸和光甘草定的平均回收率分别为97.94％和99.18％；RSD分别为0.8862％和0.2232％，结果表明回收率良好，结果见表2；
表2甘草酸和光甘草定加样回收实验
步骤六：取光果甘草3份，按照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定，按外标法分别计算甘草中甘草酸和光甘草定含量，结果见表3。
表3含量测定结果
| 样品 | 甘草酸含量(％) | 光甘草定含量(％) |
| 光果甘草 | 3.71±0.18 | 0.16±0.01 |
一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，包括对比实验的操作步骤如下：
步骤一：北京化工大学吕姣的学位论文《光甘草定与甘草酸的联合提取、分离纯化研究》中，甘草酸与光甘草定含量测定采用的高效液相色谱条件为：以乙腈(A)-0.05％三氟乙酸(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度为0.01-3min，A：B＝46：54；20min，A：B＝80：20；20.01min，A：B＝85：15；24min，A：B＝46：54；35min，停止，流速为1.0mL/min，检测波长为230nm，柱温为30℃；
步骤二：本专利绿色分析方法中，甘草酸与光甘草定含量测定采用的高效液相色谱条件为：以乙醇(A)-0.1％三氟乙酸(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度为0-3min，A：B＝55：45；15min，A：B＝70：30；17min，A：B＝55：45；20min，停止，流速为0.8mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃；
步骤三：取“溶液制备”项下混合对照品以及供试品溶液，按照上述两种色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，结果见表4、图3和图4。
表4不同分析方法测定结果
| 化合物 | 保留时间 | 分离度 | 理论塔板数 | 不对称度 | |
| 吕娇方法 | 甘草酸 | 4.910 | 58.81 | 13725 | 1.15 |
| 绿色方法 | 甘草酸 | 6.787 | 19.23 | 9771 | 1.15 |
| 吕娇方法 | 光甘草定 | 15.173 | <u>na</u> | 110835 | 1.08 |
| 绿色方法 | 光甘草定 | 11.897 | <u>na</u> | 34916 | 1.09 |
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述光果甘草用绿色分析方法的主体流程包括检测波长选择、洗脱梯度选择、基础材料选择、溶液制备、多项实验以及对比实验，所述基础材料选择包括仪器选择、试剂选择和药材选择，所述溶液制备包括色谱条件、混合对照品溶液的制备和供试品溶液的制备，所述多项实验包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验和样品含量测定。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述检测波长选择的操作步骤如下：
查阅文献可知甘草酸的最大吸收波长为249nm，光甘草定的最大吸收波长为230nm和283nm，当选用249nm时，光甘草定在此波长下几乎没有吸收，而甘草酸在230nm波长下的吸收值优于283nm，综合考虑后，本方法选择检测波长为230nm。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述洗脱梯度选择的操作步骤如下：
设定不同的洗脱梯度，根据其洗脱梯度下的色谱峰的峰形及分离度，最终确定最佳洗脱梯度为0-3min，A:B＝55:45；15min，A:B＝70:30；17min，A:B＝55:45，20min，停止。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述基础材料选择的操作步骤如下：
步骤一：选用高效液相色谱仪、手提式高速万能粉碎机、超声清洗仪、电子分析天平和台式高速离心机；
步骤二：选用光甘草定对照品(纯度≥98％)、甘草酸对照品(纯度≥98％)、无水乙醇、乙醇和三氟乙酸；
步骤三：选用豆科植物光果甘草的根和根茎，在50℃环境烘干，粉碎后备用。
5.根据权利要求1所述的一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述溶液制备的操作步骤如下：
色谱条件：采用汉邦色谱柱，以乙醇(A)-0.1％三氟乙酸(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度为0-3min，A:B＝55:45；15min，A:B＝70:30；17min，A:B＝55:45，20min，停止，流速为0.8mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃；
混合对照品溶液的制备：分别精密称取光甘草定和甘草酸的对照品适量，加70％乙醇水溶液制成每1mL分别含光甘草定0.1mg，甘草酸1mg的混合溶液，作为混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取样品粉末(过60目筛)1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入60％乙醇水溶液，定容至刻度线，密塞，超声(频率40kHz，功率300W)提取30min，放冷，用60％乙醇溶液补至刻度线，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
6.根据权利要求1所述的一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述多项实验的操作步骤如下：
步骤一：基于“混合对照品溶液的制备”项下混合对照品溶液，来进行线性关系考察；
步骤二：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试品溶液，来进行精密度试验；
步骤三：基于“供试品溶液的制备”项方法制备成供试品溶液，来进行稳定性试验；
步骤四：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试品溶液，来进行重复性试验；
步骤五：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备成供试溶液以及“色谱条件”项下色谱条件测定，来进行加样回收率试验；
步骤六：基于“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，来进行样品含量测定。
7.根据权利要求1所述的一种同时测定光果甘草中甘草酸和光甘草定的绿色分析方法，其特征在于：所述对比实验的操作步骤如下：
步骤一：基于现有甘草酸与光甘草定含量测定采用的高效液相色谱条件下，与本试验所采用的甘草酸与光甘草定含量测定采用的高效液相色谱条件，来进行对比；
步骤二：综合对比数据，来分析不同方法下的测定结果。
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