CN109828055B - 一种三白草药材的hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：步骤1，供试品溶液的制备：取三白草样品粉末，加入80％甲醇，经回流提取后，用80％甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；步骤2，指纹图谱的建立：采用高效液相色谱仪，对供试品溶液进行检测，建立供试品溶液的指纹图谱。本发明灵敏地对样品进行定性和定量分析，较好地反映共有峰的相似性，检测分离度较好，实验结果可靠，重复性和稳定性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间。

Description

一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及指纹图谱领域，具体涉及一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术

三白草来源于三白草科三白草Saururus chinensis (Lour.) Baill.，干燥地上部分入药，其味甘、辛，性寒，归肺、膀胱经；有利尿消肿、清热解毒的功效；用于治疗水肿，小便不利，淋沥涩痛，带下；外治疮伤肿毒，湿疹等。现代研究报道，三白草药材含有挥发油、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质等成分，发现其具有抗炎、去毒、降糖、保肝、利尿等活性。三白草中木脂素类成分具有多方面药理活性，如抗炎、抗氧化等，三白草黄酮类成分具有很好的抑制超氧基阴离子和羟基自由基的作用。近些年，国内外对三白草的研究不断加深，使其应用范围不断扩大，而且在某些方面还呈现一定的开发前景。

目前三白草质量控制方面的研究还不完善，多集中于三白草酮，里卡灵A等单一化学成分的质量评价，指纹图谱的研究也有相关报道，但不够完善。现多使用指纹图谱检测中药材成分，但是存在较大的测量误差，比如检测仪器、流动相、环境条件等多种因素的差异，且检测所需时间太长，所需样品量较大，检测的精度及灵敏度不高。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明公开了一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：

一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，该建立方法包括以下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：取三白草样品粉末，加入80%甲醇，经回流提取后，用80%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

步骤2，指纹图谱的建立：采用高效液相色谱仪，对供试品溶液进行检测，建立供试品溶液的指纹图谱。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中在步骤1中，三白草样品粉末与甲醇的比例为1g三白草样品粉末：50mL 80%甲醇。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中在步骤1中，回流提取时间为30min，且采用0.45μm微孔滤膜过滤。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中在步骤2中，色谱条件为：采用Waters Xbridge^TM C₁₈色谱柱，色谱柱规格为4. 6mm x 250mm、5µm，以甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱，柱温25℃，流速1.0 mL·min^-1，检测波长为238nm，进样量为10μL。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中梯度洗脱条件：0~21min，14%A；21~37min，14~39%A；37~42min，40~52%A；42~96min，52~80%A；96~105min，80~95%A。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中该建立方法还包括步骤3，指纹图谱的相似度评价：将供试品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，计算相似度。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中标准指纹图谱的建立是以金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、马兜铃内酰胺AⅡ、1’表-三白草酮、(-)-三白草醇甲基醚、三白草酮、三白草醇I、里卡灵A、4-O-去甲基马钠萨亭B、马钠萨亭B、里卡灵B的混合物为对照品溶液测得。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中对照品溶液为金丝桃苷35.46μg/mL、芦丁21.54μg/mL、槲皮苷41.36μg/mL、马兜铃内酰胺AⅡ 45.67μg/mL、1’表-三白草酮49.28μg/mL、(-)-三白草醇甲基醚67.58μg/mL、三白草酮179.04μg/mL、三白草醇I52.80μg/mL、里卡灵A 80.67μg/mL、4-O-去甲基马钠萨亭B 80.48μg/mL、马钠萨亭B 122.08μg/mL、里卡灵B 67.04μg/mL的混合对照品甲醇溶液。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中供试品溶液的指纹图谱共有模式具有12个共有特征峰，各共有特征峰对应的化学成分分别是1号峰：芦丁，2号峰：金丝桃苷，3号峰：槲皮苷，6号峰：马兜铃内酰胺AⅡ，10号峰：1’表-三白草酮，13号峰：(-)-三白草醇甲基醚，14号峰：三白草酮，15号峰：三白草醇I，17号峰：里卡灵A，18号峰：4-O-去甲基马钠萨亭B，19号峰：马钠萨亭B，20号峰：里卡灵B。

上述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其中以3号峰槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，得出如下其他峰的相对保留时间和相对峰面积：

1号峰：相对保留时间为0.83-0.849，相对峰面积为0.022-1.002；

2号峰：相对保留时间为0.859-0.866，相对峰面积为0.583-1.58；

6号峰：相对保留时间为1.807-1.844，相对峰面积为0.123-0.653；

10号峰：相对保留时间为2.292-2.339，相对峰面积为0.114-0.404；

13号峰：相对保留时间为2.456-2.542，相对峰面积为0.059-0.356；

14号峰：相对保留时间为2.527-2.582，相对峰面积为2.389-8.322；

15号峰：相对保留时间为2.624-2.682，相对峰面积为0.137-0.705；

17号峰：相对保留时间为2.729-2.79，相对峰面积为0.19-2.268；

18号峰：相对保留时间为2.84-2.903，相对峰面积为0.201-0.747；

19号峰：相对保留时间为3.003-3.072，相对峰面积为0.352-1.155；

20号峰：相对保留时间为3.13-3.204，相对峰面积为0.07-1.032。

本发明的有益效果为：本发明灵敏地对样品进行定性和定量分析，较好地反映共有峰的相似性，实验结果可靠，检测分离度较好，重复性和稳定性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为15批不同来源及批次的三白草药材的重叠指纹图谱；

图2为三白草药材共有模式指纹图谱；

图3为混合对照品溶液的指纹图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法作进一步说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，而非对本发明进行限制。

实施例：

1材料

1.1仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、PAD检测器(美国)、KQ-700DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、TLE204电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、ALB-200型高速多功能粉碎机（上海塞耐机械有限公司）。

1.2对照品：金丝桃苷（111521-201205）、芦丁（100080-201409）、槲皮苷（111538-200504）为中国食品药品鉴定所购买；马兜铃内酰胺AⅡ、1’表-三白草酮、(-)-三白草醇甲基醚、三白草酮、三白草醇I、里卡灵A、4-O-去甲基马钠萨亭B、马钠萨亭B、里卡灵B为中山大学徐俊教授团队提供；甲醇为色谱纯（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

1.3试药：15批三白草批号及产地来源见表1，经广东省中医研究所刘法锦教授鉴定为三白草科植物三白草Saururus chinensis (Lour.) Baill.的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1色谱条件

Waters Xbridge^TMC₁₈色谱柱(4.6mm x 250mm，5µm），流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0~21 min，14% A；21~37 min，14~39% A；37~42 min，40~52% A；42~96 min，52~80% A；96~105 min，80~95% A）；柱温25℃；流速1.0 mL·min^-1；检测波长238 nm；进样量10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备：分别精密称取适量金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、马兜铃内酰胺AⅡ、1’表-三白草酮、(-)-三白草醇甲基醚、三白草酮、三白草醇I、里卡灵A、4-O-去甲基马钠萨亭B、马钠萨亭B、里卡灵B制成芦丁21.54μg/mL、金丝桃苷35.46μg/mL、槲皮苷41.36μg/mL、马兜铃内酰胺AⅡ 45.67μg/mL、1’表-三白草酮49.28μg/mL、(-)-三白草醇甲基醚67.58μg/mL、三白草酮179.04μg/mL、三白草醇I 52.80μg/mL、里卡灵A 80.67μg/mL、4-O-去甲基马钠萨亭B 80.48μg/mL、马钠萨亭B 122.08μg/mL、里卡灵B 67.04μg/mL的混合对照品甲醇溶液。

2.2.2供试品溶液的制备：取三白草样品粉末(过四号筛)各约1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，经过0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2. 3方法学考察

2. 3. 1精密度试验：取S1供试品溶液，连续进样6次，以3号峰槲皮苷为参照峰，计算出1~20号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均>0. 990，表明仪器稳定，精密度良好。

2. 3. 2重复性试验：取同一批样品(S1)，分别精密称取6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，以3号峰槲皮苷为参照峰，计算出1~20号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均>0. 990，表明方法重复性良好。

2. 3. 3稳定性试验：取S1供试品溶液，分别在0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h进样，以3号峰槲皮苷为参照峰，计算出1~20号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均>0. 990，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4 结果与分析

2.4.1三白草样品图谱采集和对照指纹图谱的建立：将15批三白草药材按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件分别进样检测并记录各批次的色谱图，得到15批药材的叠加指纹图谱，参见图1。将所得三白草HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”，样品S1的图谱设为参照图谱，选择中位数法生成对照指纹图谱，时间窗宽度设定为0.1min，对15批药材的指纹图谱进行多点校正后进行峰匹配，生成三白草药材指纹图谱的共有模式并标定12个共有峰，共有模式指纹图谱参见图2，混合对照品溶液的指纹图谱参见图3。

2.4.2指标性成分的指认：根据文献和相关研究，结合色谱图结果，指认了三白草中12个已知成分。将对照品溶液以相同条件下进样，与共有模式图谱进行比较，根据保留时间进行峰定位，可指认出图谱中12个色谱峰，分别以3号峰为参照峰，确定了20个共有峰为特征峰，并指认为芦丁（1号峰）、金丝桃苷（2号峰）、槲皮苷（3号峰）、马兜铃内酰胺AⅡ（6号峰）、1’-表-三白草酮（10号峰）、(-)-三白草醇甲基醚（13号峰）、三白草酮（14号峰）、三白草醇I（15号峰）、里卡灵A（17号峰）、4-O-去甲基马钠萨亭B（18号峰）、里卡灵B（19号峰）、马钠萨亭B（20号峰），按"2.2”项下方法配置对照品溶液进行分析测定，其中槲皮苷所指示的3号峰峰面积适中，保留时间适宜，故选为参照峰S。共有峰相对保留时间和相对峰面积分别参见表2和表3。

2.4.2指纹图谱的相似度评价：采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”软件，对15批三白草药材的指纹图谱进行相似度评价和数据匹配。以生成的共有模式图谱作为对照，各15批药材图谱相似度均大于0.9，说明15批三白草药材的成分稳定，结果见表4。

本发明灵敏地对样品进行定性和定量分析，较好地反映共有峰的相似性，实验结果可靠，检测分离度较好，重复性和稳定性良好，具有较高的精密度，大大缩短了检测时间。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术手段和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明之形状、构造及原理所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，该建立方法包括以下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：取三白草样品粉末，加入80%甲醇，经回流提取后，用80%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

步骤2，指纹图谱的建立：采用高效液相色谱仪，对供试品溶液进行检测，建立供试品溶液的指纹图谱；

在步骤2中，色谱条件为：采用Waters Xbridge^TM C₁₈色谱柱，色谱柱规格为4. 6mm x250mm、5µm，以甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱，柱温为25℃，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为238nm，进样量为10μL；

梯度洗脱条件：0~21min，14%A；21~37min，14~39%A；37~42min，40~52%A；42~96min，52~80%A；96~105min，80~95%A；

该建立方法还包括步骤3，指纹图谱的相似度评价：将供试品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，计算相似度；

标准指纹图谱的建立是以金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、马兜铃内酰胺AⅡ、1’表-三白草酮、(-)-三白草醇甲基醚、三白草酮、三白草醇I、里卡灵A、4-O-去甲基马钠萨亭B、马钠萨亭B、里卡灵B的混合物为对照品溶液测得。

2.根据权利要求1所述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤1中，三白草样品粉末与甲醇的比例为1g三白草样品粉末：50mL 80%甲醇。

3.根据权利要求1所述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤1中，回流提取时间为30min，且采用0.45μm微孔滤膜过滤。

4.根据权利要求1-3任一 所述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，对照品溶液为金丝桃苷35.46μg/mL、芦丁21.54μg/mL、槲皮苷41.36μg/mL、马兜铃内酰胺AⅡ 45.67μg/mL、1’表-三白草酮49.28μg/mL、(-)-三白草醇甲基醚67.58μg/mL、三白草酮179.04μg/mL、三白草醇I 52.80μg/mL、里卡灵A 80.67μg/mL、4-O-去甲基马钠萨亭B80.48μg/mL、马钠萨亭B 122.08μg/mL、里卡灵B 67.04μg/mL的混合对照品甲醇溶液。

5.根据权利要求4所述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，供试品溶液的指纹图谱共有模式具有12个共有特征峰，各共有特征峰对应的化学成分分别是1号峰：芦丁，2号峰：金丝桃苷，3号峰：槲皮苷，6号峰：马兜铃内酰胺AⅡ，10号峰：1’表-三白草酮，13号峰：(-)-三白草醇甲基醚，14号峰：三白草酮，15号峰：三白草醇I，17号峰：里卡灵A，18号峰：4-O-去甲基马钠萨亭B，19号峰：马钠萨亭B，20号峰：里卡灵B。

6.根据权利要求5所述的三白草药材的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，以3号峰槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，得出如下其他峰的相对保留时间和相对峰面积：

1号峰：相对保留时间为0.83-0.849，相对峰面积为0.022-1.002；

2号峰：相对保留时间为0.859-0.866，相对峰面积为0.583-1.58；

6号峰：相对保留时间为1.807-1.844，相对峰面积为0.123-0.653；

10号峰：相对保留时间为2.292-2.339，相对峰面积为0.114-0.404；

13号峰：相对保留时间为2.456-2.542，相对峰面积为0.059-0.356；

14号峰：相对保留时间为2.527-2.582，相对峰面积为2.389-8.322；

15号峰：相对保留时间为2.624-2.682，相对峰面积为0.137-0.705；

17号峰：相对保留时间为2.729-2.79，相对峰面积为0.19-2.268；

18号峰：相对保留时间为2.84-2.903，相对峰面积为0.201-0.747；

19号峰：相对保留时间为3.003-3.072，相对峰面积为0.352-1.155；

20号峰：相对保留时间为3.13-3.204，相对峰面积为0.07-1.032。

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