CN101961405A - 检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法 - Google Patents

Abstract

检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法，属于医药领域中成药有效成分含量的测定方法。是用高效液相色谱法测定，每片复方杜仲片含松脂醇二葡萄糖苷不得少于0.05mg，每片基片重量为0.35g，具体是以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱；检测波长：230μm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，测定，按外标法计算即得。本发明确定的松脂醇二葡萄糖苷的含量测定方法，灵敏度高，经实验，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到要求。

Description

检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法

技术领域

本发明属于医药领域中成药有效成分含量的测定方法，具体涉及复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的测定方法。

背景技术

复方杜仲片由杜仲、益母草、钩藤、夏枯草、黄芩制成，主要用于肾虚肝旺之高血压症。该产品具有良好的降高血压的作用，在临床应用较广。该产品收载于中国卫生部药品标准中药成方制剂第6册第117页WS3-B-1185-92。而标准中仅有简单的显微鉴别和显色反应对产品质量进行控制。这类鉴别方法粗糙，无专属性。无法有效控制产品质量。

复方杜仲片处方中的君药为杜仲，是我国的名贵药材，属于国家二级保护植物，具有补肝肾、强筋骨、降血压的作用，而杜仲中主要降血压的成分即为松脂醇二葡萄糖苷(Pinoresind Diglucoside，简称PDG)，因此对松脂醇二葡萄糖苷进行含量测定，更能体现复方杜仲片质量的优劣。

关于杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量测定方法文献报道较少，王月茹等在文献“HPLC测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量”，《现代中医药》，2009年11月第29卷第6期78～79页中报道了测定杜仲药材中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法。但是，复方杜仲片的制备工艺是由多种药材采用水提取工艺制得，因此片剂中含有的成分复杂，还含有蛋白质、多糖类等等成分，如直接用水、甲醇等极性溶剂提取，过滤困难，从而影响了该成分的提取分离和测定数据的正确性。按该文献的方法松脂醇二葡萄糖苷是无法从复方杜仲片中分离出来，在高效液相色谱图中也检测不到相应的成分。为此，必需寻找能测定复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的具体可操作和生产上可应用的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法。

本发明所采用的技术方案是这样实现的：用高效液相色谱法测定，每片含松脂醇二葡萄糖苷不得少于0.05mg，每片基片重量为0.35g，松脂醇二葡萄糖苷的分子式为C₃₂H₄₂O₁₆，具体操作按以下进行：

色谱条件  以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000；所说的梯度洗脱优选如下程序进行：

对照品溶液的制备  精密称取松脂醇二葡萄糖苷加入体积百分浓度为25％的甲醇水溶液制成每1ml中含松脂醇二葡萄糖苷0.035mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取复方杜仲片，除去包衣，研细，精密称定细粉1g，置三角瓶中，加入体积百分浓度为60％的甲醇水溶液80ml，超声提取30分钟，滤过，并用甲醇洗涤残渣，滤液加60ml正己烷萃取1次，取下层溶液减压浓缩至约5ml，再加无水乙醇30ml超声2分钟，滤取溶液，滤液减压浓缩至约0.5ml，用75％乙醇溶液7ml使溶解，通过100～200目的硅胶柱，用二氯甲烷40ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙酸乙酯∶甲醇体积比为70∶30的混合溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加体积百分浓度为30％的甲醇水溶液使溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，测定，按外标法计算即得。

松脂醇二葡萄糖苷为水溶性成分，可以采用水、甲醇、乙醇等溶剂提取。但由于复方杜仲片的制备工艺是由多种药材采用水提取工艺制得，因此片剂中含有的成分复杂，还含有蛋白质、多糖类等等成分，如直接用水、甲醇等极性溶剂提取，过滤困难，从而影响了该成分的提取分离和测定数据的正确性。为此，对供试品溶液的制备是关键技术。

供试品溶液的制备归纳采用如下方法予以比较：

采用同一批号复方杜仲片制备供试品溶液，并采用同一条件进行高效液相色谱检测：以碳十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇∶水的体积比为20∶80组成；检测波长：230nm；流速：1ml/min。

具体如下表所示：

从上表可知，只有采用甲醇提取才可能检测出松脂醇二葡萄糖苷，而提取后采用什么分离方法才能保证松脂醇二葡萄糖苷的谱峰分离效果好、纯度高、测定的准确度高也是该技术的关键，发明人通过反复试验确定了供试品的制备方法。

本发明的色谱条件的确定

用碳十八烷基桂烷键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇∶水的体积比为25∶75组成；流速为1ml/min；检测波长230nm；柱温：室温。以此为色谱条件为研究基础，分别对流动相的选择和梯度洗脱进行了摸索。结果发现，松脂醇二葡萄糖苷色谱峰在约15分钟出峰，在此条件下能够完全达到分离，成分峰和相邻峰的分离度大于1.5；但主成分出峰后40分钟还有其他杂质峰，故采用梯度洗脱快速洗出杂质，缩短色谱分析时间，节约分析成本。

洗脱程序的选择：

1、以碳十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇∶水的体积比为20∶80组成洗脱液进行等度洗脱；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000。

结果显示，其目标成分峰松脂醇二葡萄糖苷在27.5min出峰，分离度较好，基线平稳，但洗脱时间太长，且在此条件下分时时间在松脂醇二葡萄糖苷色谱峰洗脱出来后1h仍有色谱峰出现，不能达到快速分析的目的。因此，对流动相的比例和洗脱梯度做进一步的研究和优化，以缩短分析时间，节约分析成本。

2、以碳十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇∶水的体积比为25∶75组成洗脱液进行等度洗脱；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000。

结果显示，在该色谱条件下，松脂醇二葡萄糖苷色谱峰在约14min出峰，峰形较好，其分离度大于1.5，理论塔板数高于2000。但在此等度洗脱条件下，目标成分峰洗脱出来后35min，仍有其它色谱峰出现，导致洗脱时间太长。与洗脱程序1比较，检测成分的保留时间大幅度缩短，但分析时间仍然很大。故对松脂醇二葡萄糖苷洗脱后的洗脱条件做进一步的分析。

3、以碳十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B梯度洗脱(见下表；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000。

此条件下松脂醇二葡萄糖苷在14.5min出峰，分离度较大，大于1.5，且在目标成分峰洗脱出来后20min，样品成分能完全洗脱出来，大大缩短了分析时间，因此选择做为最终色谱检测条件。

本发明的优越性：本发明确定的松脂醇二葡萄糖苷的含量测定方法，灵敏度高，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到生产的要求。

本发明的积极效果是：本发明提高了控制复方杜仲片药物质量的方法，增加了专属性强的复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷的含量测定方法，更有效地控制了产品的质量，确保了药物的疗效。

附图说明

图1松脂醇二葡萄糖苷对照品的高效液相色图谱

图2复方杜仲片供试品的高效液相色谱图

下面结合实施例和附图详细叙述本发明的技术方案。

具体实施方式

实施例1复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量检测方法的确定

色谱条件  以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000；梯度洗脱按如下程序进行：

对照品溶液的制备  精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品14.8mg，置50ml量瓶中，加30％甲醇溶解并定容至刻度，得0.296mg/ml对照品溶液。

供试品溶液的制备  取复方杜仲片，除去包衣，研细，精密称定细粉1g，置三角瓶中，加入体积百分浓度为60％的甲醇水溶液80ml，超声提取30分钟，滤过，并用甲醇洗涤残渣，滤液加60ml正己烷萃取1次，取下层溶液减压浓缩至约5ml，再加无水乙醇30ml超声2分钟，滤取溶液，滤液减压浓缩至约0.5ml，用75％乙醇溶液7ml使溶解，通过100～200目的硅胶柱，用二氯甲烷40ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙酸乙酯∶甲醇体积比为70∶30的混合溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加体积百分浓度为30％的甲醇水溶液使溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

1.线性范围试验：

分别精密量取对照品溶液1ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml，均置于25ml量瓶中，加30％甲醇定容至刻度，摇匀，得0.01184mg/ml、0.02368mg/ml、0.0296mg/ml、0.0592mg/ml、0.1184mg/ml的对照品溶液。取以上6个浓度的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪中，以峰面积(Y)对浓度(X)作图，得一条直线，其回归方程为：Y＝26372x+8.3096(R＝1.0)

采用以上研究确定的方法进行含量测定，方法经过方法学验证，阴性样品对测定结果无干扰，线性相关系数为r＝1.0000，表明松脂醇二葡萄糖苷在0.01184～0.1184mg范围内呈良好的线性关系。松脂醇二葡萄糖苷回收率平均值为96.84％，RSD为2.13％。

试验表明：松脂醇二葡萄糖苷在0.01184～0.296mg/ml范围内呈良好线性关系。

2.回收率试验：

取同一批号的复方杜仲片，共6份，精密称定，再分别加入对照品0.195mg以样品测定法进行测定，回收率平均值为96.84％，RSD＝2.13％。结果见下表1

表1

结果表明本方法测定准确度较好。

3.重复性试验

取同一批号的复方杜仲片，配制成同一浓度的6个样品，按样品测定法操作，测定含量，结果表明：本方法重现性良好，RSD＝2.82％。结果见表2

表2

4.稳定性试验

精密吸取同一样品溶液20μl，在0h、2h、4h、6h、8h进样，结果8小时内峰面积积分值比较稳定，峰面积RSD＝1.25％。结果见表3

表3

实施例2取广州市香雪制药股份有限公司生产的批号为200701001批复方杜仲片，片重为0.35克，按以下条件进行检测：

(1)色谱条件  以碳十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，洗脱程序见表4；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000。

表4

(2)对照品溶液的制备：精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品，加体积百分浓度为25％的甲醇溶液制成每1ml含0.035mg的溶液，即得。

(3)供试品溶液的制备：取本品20片，除去包衣，研细，取细粉约1.0g，精密称定，加60％的甲醇水溶液80ml，超声提取(功率160W，频率40kHz)2次，每次30分钟，滤过，并用适量甲醇洗涤残渣，滤液加60ml正己烷萃取1次，下层溶液减压浓缩至约5ml，再加无水乙醇30ml超声(功率160W，频率40kHz)2分钟，溶液转移至漏斗中滤过，并用85％乙醇洗涤滤渣，滤液减压蒸发至约0.5ml，用75％乙醇7ml使溶解，通过硅胶柱(100～200目的硅胶18g，内径1.0cm，无水乙醇湿法装柱)，用二氯甲烷40ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙酸乙酯∶甲醇体积比为70∶30的混合溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加体积比为30％的甲醇水溶液使溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，测定得色谱图，如附图1和2所示，按外标法计算，即得。

计算得：松脂醇二葡萄糖苷含量为0.083mg/片。

实施例3按实施例2方法测定广州市香雪制药生产的其它批次的产品，测定结果如下：

从以上各批测定的结果可见复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量每片含松脂醇二葡萄糖苷均大于0.05mg，每片基片重量为0.35g。

Claims (2)

1.一种检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法，其特征在于：用高效液相色谱法测定，每片含松脂醇二葡萄糖苷不得少于0.05mg，每片基片重量为0.35g，具体操作按以下进行：

色谱条件  以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱；检测波长：230nm；流速：1ml/min；理论板数按松脂醇二葡萄糖苷峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备  精密称取松脂醇二葡萄糖苷加入体积百分浓度为25％的甲醇水溶液制成每1ml中含松脂醇二葡萄糖苷0.035mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取复方杜仲片，除去包衣，研细，精密称定细粉1g，置三角瓶中，加入体积百分浓度为60％的甲醇水溶液80ml，超声提取30分钟，滤过，并用甲醇洗涤残渣，滤液加60ml正己烷萃取1次，取下层溶液减压浓缩至约5ml，再加无水乙醇30ml超声2分钟，滤取溶液，滤液减压浓缩至约0.5ml，用75％乙醇溶液7ml使溶解，通过100～200目的硅胶柱，用二氯甲烷40ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙酸乙酯∶甲醇体积比为70∶30的混合溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加体积百分浓度为30％的甲醇水溶液使溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20ul，注入高效液相色谱仪，测定，按外标法计算即得。

2.根据权利要求1所说的检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法，其特征在于：所说的梯度洗脱是按如下程序进行

Images