CN100368806C - 一种检测紫花前胡素的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种检测紫花前胡素的方法，具体地说，涉及一种用高效液相色谱法检测紫花前胡素的方法，其包括用高效液相色谱法测定样品中紫花前胡素的步骤，其特征在于所述的色谱为反相色谱，且流动相为磷酸盐缓冲溶液、乙腈和十二烷基硫酸钠的混合溶液。该方法检测紫花前胡素，具有异构体之间易分离，不干扰，检测时间短，测定结果准确等优点。

Description

一种检测紫花前胡素的方法
技术领域
本发明涉及一种检测紫花前胡素的方法，具体地说，涉及一种用高效液相色谱法检测紫花前胡素的方法，该方法检测紫花前胡素，具有异构体之间易分离，不干扰，检测时间短，测定结果准确等优点。本发明属于中药分析化学领域。
背景技术
紫花前胡为伞形科植物紫花前胡Angelica decursiva(Miq.)Franch的干燥根，多年生宿根草本植物，具有疏风清热、下气化痰等功效，主产湖南、江西、安徽等地，我国分布比较广泛，也是临床上的常用中药。具有散风清热、降气化痰的功效，临床上常用于风热咳嗽痰多，燥湿清热等症状的治疗。现代研究表明该类植物含有挥发油及香豆素等化学成分，例如主要有紫花前胡苷(nodakenin)、紫花前胡苷元(nodakenetin)、紫花前胡素(decursin)、伞花内酯等。紫花前胡素，其分子式C19H20O5，熔点：110～112℃，[α]d 15：+172(c＝7，CHCL3)。研究发现，其中的紫花前胡素对治疗白血病、糖尿病、高血压以及降低肾毒素具有显著效果，它也能抑制幽门螺杆茵，而幽门螺杆菌与胃和十二指肠溃疡、胃炎、胃癌等疾病密切相关。
Figure C20061010338600031
紫花前胡素(decursin)
随着中药现代化的发展，开发安全、有效、可控的现代中药，是中药研究的重要途径之一。对天然药物中活性药物成分的检测和测定等质量控制，是中药现代研究和开发的重要内容，其中探索活性成分有效、快捷的测定方法尤为关键。紫花前胡素是一重要的药物活性成分，广泛存在于伞形科植物中，是多数中药例如紫花前胡等的有效成分。目前，关于紫花前胡素的检测方法，还主要是比色法和薄层色谱法等，方法效率低下，灵敏度低，重现性和可靠性等都存在严重缺陷，远远不能满足现代中药要求和标准。因此，探索一种更加灵敏、快捷、有效的紫花前胡素检测方法，具有十分重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种通过高效液相色谱法检测紫花前胡素的方法，从而为紫花前胡素的开发以及中药的质量控制，提供一种有效的方法。本发明的技术方案如下：
本发明的检测紫花前胡素的方法，其包括用高效液相色谱法测定样品中紫花前胡素的步骤，其特征在于所述的色谱为反相色谱，且流动相为磷酸盐缓冲溶液、乙腈和十二烷基硫酸钠的混合溶液。
其中，所述的“样品”，具有广义的含义，一方面是指含有紫花前胡素的原料或原药材，例如伞形科植物紫花前胡药材(根、茎、叶或果实等)或其经过适当的提取和/或分离步骤之后所得到的提取物，另一方面，也指含有上述原料或药材的复方药物，例如含有紫花前胡药材的中药复方或中成药等，此外，所述“样品”还包括上述样品经过适当处理之后制成的待测样品，也称“供试品”，例如紫花前胡原料经过适当提取分离步骤所配制成的供试品。
其中，所述的反相色谱，色谱柱可以为C2～C22的材料，例如ODS柱(Shim-pack VP-ODS)，型号为AT.Lichrom C18，或其它规格，柱子的填充物质是十八烷基结合硅胶；也还可以选用Intersil ODS-2或Capcell Pakc-18等柱子的固定相。其中，作为本发明-优选实施方案，使用ODS柱(250MM*4.6MM，5UM)作为固定相。
其中，上述流动相的组成成分为磷酸盐缓冲溶液、乙腈和十二烷基硫酸钠，其中，所述的磷酸盐缓冲溶液可以为磷酸、次磷酸、偏磷酸、磷酸氢钠、磷酸二氢钠或磷酸钠等组成的缓冲溶液，本发明优选用磷酸和磷酸二氢钠缓冲溶液，更优选pH值为5的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液。
上述流动相中组成成分的配制，可以根据样品及其预处理情况以及固定相种类进行调整，本领域一般技术人员可以通过实验来确定符合要求的配比。作为本发明实施方案之一，所述的流动相优选采用通过如下方法配成：
(1)pH值为5的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释10倍后，与乙腈等体积混合：
(2)按1000毫升步骤(1)所得的混合液中加入1.5～4.5克、优选2～3克、更优选2.88克十二烷基硫酸钠的比例向混合液中加入十二烷基硫酸钠。
本发明上述所述的高效液相色谱法检测紫花前胡素的方法，测定时的柱温，可以为室温或稍微低于或高于室温的温度，通常，柱温为20～40℃，优选30～35℃。
本发明上述所述的高效液相色谱法检测紫花前胡素的方法，其中，测定的流速可以为每分钟0.5～2毫升，优选每分钟1.0～1.5毫升。
本发明上述所述的高效液相色谱法检测紫花前胡素的方法，其中，测定的检测波长可以在250～300纳米范围内，优选为280纳米。
本发明通过反复实验和摸索，意外地发现通过使用反相色谱法，并以磷酸盐缓冲溶液、乙腈和十二烷基硫酸钠组成的流动相，进行高效液相色谱法检测样品中紫花前胡素，方法具有分离度好、灵敏度高以及重现性好等优点，而且流动相没有使用甲醇等试剂，尤其是，本发明方法的色谱分离好，紫花前胡素异构体之间易分离，时间短，结果准确。可以有效地检测和测定紫花前胡素，可作为紫花前胡素指控的有效手段。
附图说明
图1：紫花前胡素的HPLC图
图2：样品的HPLC图
具体实施方式
以下实施例是为了进一步解释或说明本发明的内容，但不构成对本发明主旨和权利要求保护范围的限制。
实施例1
取紫花前胡素对照品适量，精密称定后，用甲醇溶解并定容50ml，过0.45μm滤膜，作为对照品溶液。
吸取上述对照品溶液，进行高效液相色谱测定。
流动相配制：
(1)PH＝5的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释10倍后，与乙腈按1∶1的体积比混合；
(2)按1000ml(1)混合液中加入2.88g十二烷基硫酸钠的比例向混合液中加入十二烷基硫酸钠.
检测条件：
柱温35℃，流速1.2ml/min检测波长280nm，ODS柱250×4.6mm 5μm。
测得的HPLC图谱见图1。
结果测得紫花前胡素的保留时间为29.559分钟，理论板数为23111.537。结果良好。
图1中各色谱峰的参数见下表1。
表1各色谱峰的参数
峰号组分名  保留时间浓度面积 峰高       理论塔板    分离因子
1               1.872        0.00000    15894.0     1456.2    --         0.000
2               2.230        0.00000    114080.4    5680.9    231.914    0.000
3               2.753        0.00000    5652.5      861.0     --         2.461
4               3.065        0.00000    11760.7     518.4     --         1.354
5  紫花前胡素   29.559       0.00000    68573.9     2450.0    23111.537  22.374
实施例2
精密吸取上述的对照品溶液2，4，6，8，10μl，按实施例1的色谱条件测定峰面积，以峰面积对进样量进行回归处理，进行线性关系试验。
结果测得线性回归方程为：y＝66995x+27088，r＝0.9998。说明本发明方法的线性关系良好。
实施例3
用微量注射器吸取上述的紫花前胡素对照品液10μl进样，重复进样5次。测得峰面积依次为2115765.9，2109336.0，2134522.9，2142488.5和2128115.8。平均峰面积为2126045.82，相对标准偏差RSD＝0.636％。测定结果说明该方法有很好的精密度。
实施例4
取紫花前胡根药材原料10.0g，粉碎至60目的粉末，取粉末，精密称定后，在55℃、频率55KHZ下超声提取30分钟，溶媒为95％乙醇，提取两次，合并提取液，过滤，回收溶媒后残渣用甲醇溶解，定容至100ml，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。
采用高效液相色谱法进行测定
流动相配制：
(1)PH＝5的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释10倍后，与乙腈按1∶1的体积比混合；
(2)按1000ml(1)混合液中加入2.88g十二烷基硫酸钠的比例向混合液中加入十二烷基硫酸钠。
检测条件：
柱温35℃，流速1.2ml/min检测波长280nm，ODS柱250×4.6mm 5μm。
结果测得药材中紫花前胡素的含量为0.6495％。测得的样品的HPLC图谱见图2。图2中，各峰对应的数据如下表2所示。
表2：各色谱峰对应的色谱参数
峰号组分名  保留时间浓度 面积    峰高   理论塔板    分离因子
1               23.391   0.00000  257671.4  10958.3  22564.712     0.000
2               24.456   0.00000  1646541.6 61093.8  18993.940     0.000
3               25.504   0.00000  112210.3  204.7    20766.079     1.985
4               26.863   0.00000  18150.0   660.0    --            1.643
5               27.780   1.54008  721037.4  25354.9  22633.331     1.264
6  紫花前胡素   29.457   6.49544  3041052.4 101907.5 22316.146     1.382
7               31.121   0.00000  37996.2   1307.8   24523.622     1.274
8               33.566   0.00000  99747.4   2871.5   1615.395      1.316
实施例5
精密称取已知紫花前胡素含量的紫花前胡药材粗粉3份，每份约0.5g，分别精密加入0.0482mg/mL的紫花前胡素对照品10，12，14mL，按实施例4样品测定同法进行，结果测得平均加样回收率为97.971％，RSD为0.908％。
实施例6
紫花前胡药材粗粉过60目，40℃干燥4h，取约0.58，精密称定，按照实施例4相同方法制得供试品5份，每份取10μl进样。测得紫花前胡素的平均含量为0.6405％，RSD＝0.822％，说明该方法具有很好的重现性。
实施例7
取新配制的紫花前胡素对照品溶液，进样10μl，以后每2h进样一次，共进样5次，各次的峰面积为2242841.5，2245106.6，2243692.4，2243090.4和2244825.2，RSD＝2.206％，可见其峰面积基本不变，表明紫花前胡素在10h内有很好的稳定性。
已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测紫花前胡素的方法，包括用高效液相色谱法测定样品中紫花前胡素的步骤，其特征在于所述的色谱为反相色谱，检测波长为280纳米，流动相为磷酸盐缓冲溶液、乙腈和十二烷基硫酸钠的混合溶液，且通过如下步骤配制而成：
(1)pH值为5的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释10倍后，与乙腈等体积混合；
(2)按1000毫升步骤(1)所得的混合液中加入2.88克十二烷基硫酸钠的比例向混合液中加入十二烷基硫酸钠。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的反相色谱的固定相选自Shim-pack VP-ODS、Intersil ODS-2或Capcell Pakc-18。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中测定的柱温为35℃。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中测定的流速为每分钟1.2毫升。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的样品为紫花前胡的根、茎、叶、果实或其提取物。
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