CN102579612B - 一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法，包括以下步骤：药材准备、提取、萃取、大孔吸附树脂纯化、聚酰胺纯化和阳离子交换树脂。本发明提供了一套优化组合的生物碱制备方法，将准噶尔乌头提取物中生物碱的含量从0.167％～0.24％大大提升了，专属性强，发明所建立起来的制备方法可以获得纯度较高、杂质较少、符合国家《药品注册管理办法》要求的准噶尔乌头生物碱有效部位。
Description
技术领域
本发明涉及一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法，属于医药领域。
背景技术
准噶尔乌头（Aconitum soongaricum Stapf.）为毛茛科乌头属植物，分布于新疆天山山脉海拔1700～2500 m的山坡草地、灌丛和林橼。在西北地区准噶尔乌头被当作中药川乌和草乌的替代品而使用，同时也是哈萨克民族医学的传统药材，主要用于止痛、除湿、祛风寒。其块根还被收载于前苏联的国家药典中，酊剂外用可作为神经痛、牙痛、关节炎及其它各种疼痛时的镇痛剂。
对于乌头类药材，大量的临床使用经验、科学研究和实验数据表明，乌头类药材之所以具有止痛、除湿、祛风寒等临床疗效是因为药材中含有大量的生物碱类化学成分的原因，生物碱成分是乌头类药材的活性有效成分。因此，对乌头类药材的新药研发都是针对其中所含生物碱成分而展开的，从药材中提取出的生物碱成分的纯度将直接影响临床治疗疾病的效果，有效成分含量越高、杂质越少、疗效越高，反之亦然。
通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）可以判断准噶尔乌头根、茎和叶各部位所含主要生物碱的种类。其中，TLC实验结果表明，准噶尔乌头药材的根、茎、叶主要含有生物碱成分，具体所含物质类别和名称见附图1和图2所示(图1展开剂为石油醚－丙酮－氨水10:10:0.4、图2展开剂为氯仿－甲醇－氨水22.5:1:0.4)。在TLC上（见附图1和图2）从左至右依次点样顺序为准噶尔乌头根、茎、叶提取部位，以及12-表-欧乌碱、宋果灵、尼奥灵、准噶尔碱和欧乌碱等8个样品点，分别使用石油醚-丙酮-氨水和氯仿-甲醇-氨水溶剂配比体系进行展开。可以看出，准噶尔乌头中所含成分均为生物碱类物质（碘化铋钾试剂显色，其为生物碱的特征显色剂，显示红色斑点者为生物碱成分）。因此，TLC结果可以确定在准噶尔乌头的根中含有12-表-欧乌碱、宋果灵、尼奥灵、准噶尔碱和欧乌碱五种成分；茎中含有12-表-欧乌碱、尼奥灵、准噶尔碱和欧乌碱；叶中含有准噶尔碱和欧乌碱。
另外，也通过HPLC方法对准噶尔乌头进行了分析，同样确定出准噶尔乌头根中的生物碱包括准噶尔碱、欧乌碱、尼奥灵、12-表-欧乌碱、14-乙酰尼奥灵、宋果灵、6-O-去甲基尼奥灵。空白溶液的HPLC色谱图见附图3，混合对照品的HPLC色谱图见附图4。其中，色谱条件为：日立液相色谱系统（日本）是由单泵（L-2130）和一个二极管阵列检测器（L-2455）以及D-2000组成的工作站；采用Inertsil NH2柱 （150×4.6mm，5μm）；检测波长为270 nm；流速1.0 ml/min；进样量10 μL；柱温30℃；流动相为正己烷和无水乙醇（92:8）。可见准噶尔乌头中主要含有以上七种生物碱成分（见附图5～图9）。
对于中药和天然植物药的新药研发，我们国家制定了《药品注册管理办法》，在附件一中明确将中药分为九类。其中，对于有效部位入药的要求描述为：“未在国内上市销售的中药、天然药物中提取的有效部位制成的制剂是指从中药、天然药物中提取的一类或数类成份制成的制剂，其有效部位的含量应占提取物的50％以上”，可见，要开发一种天然植物药的有效部位，必须使其含量占到提取物的50％以上，这样的有效部位才符合国家的新药注册标准。
之前，已经有对准噶尔乌头乙醇提取物中生物碱的含量进行了检测，采用紫外光谱对经过酸性染料络合的生物碱进行分析，检测出准噶尔乌头根、茎、叶乙醇提取物中生物碱含量，结果如表1所示。结果表明，准噶尔乌头中所含生物碱含量很低，必须要经过多种手段纯化处理，减少杂质，浓缩生物碱，才能提高含量，使其达到管理办法的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供了一种含量高、杂质少的一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法，包括以下步骤：
（1）药材准备：将准噶尔乌头干燥根粉碎，过10～40目筛；
（2）提取：在准噶尔乌头药材粉末中加入3～6倍体积量的70%～100%的低级醇溶液，在60℃～100℃温度回流提取8h～12h，冷却后过滤得到提取液，提取液用无机碱溶液调pH值至9～10；其中，所述低级醇溶液用稀盐酸调pH值为2～3；所述低级醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；所述无机碱溶液为氨水或氢氧化钠溶液；
（3）萃取：将步骤（2）得到的提取液用等体积的萃取剂萃取3次，合并3次的萃取液，减压回收溶剂至干，得到固体物质组分A即准噶尔乌头总生物碱；其中，所述萃取剂为乙酸乙酯和/或氯仿。
进一步地，所述准噶尔乌头总生物碱通过大孔吸附树脂纯化：组分A用40%～70%的乙醇溶液溶解，将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中，先用纯水洗脱，然后用20%～50%的乙醇溶液洗脱，最后用60%～100%的乙醇溶液洗脱，收集60%～100%乙醇溶液洗脱液，减压回收溶剂至干，得到进一步纯化的准噶尔乌头总生物碱组分B。
进一步地，所述准噶尔乌头总生物碱通过聚酰胺纯化：组分B用有机溶剂溶解，将溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，先用石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ进行洗脱，然后用石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ进行洗脱，收集石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ洗脱液，减压回收溶剂至干，得到进一步纯化的准噶尔乌头总生物碱组分C；其中，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ中石油醚和丙酮体积比为8～15:1，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ中石油醚和丙酮体积比为2～6:1。
进一步地，所述准噶尔乌头总生物碱通过阳离子交换树脂纯化：用稀盐酸调节 70%～100%的低级醇溶液pH值至2～3，将其加入组分C中，至整个溶液pH值为2，将所得溶液加入到阳离子交换树脂色谱柱中，先用去离子水冲洗该色谱柱至中性，然后用浓度为5％～40％的无机碱溶液洗脱，再将树脂从色谱柱中取出，用70%～100%的低级醇溶液在60℃～100℃回流提取4h～10h，收集提取液，减压回收溶剂至干，得到进一步纯化的准噶尔乌头总生物碱组分D。
进一步地，所述填料大孔吸附树脂的体积应为溶解组分A的40%～70%乙醇溶液体积的4～8倍；所述纯水用量为2～6倍色谱柱体积；所用20%～50%的乙醇溶液用量为2～5倍色谱柱体积；所用60%～100%的乙醇溶液用量为2～6倍色谱柱体积。
进一步地，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿和丙酮中的一种或多种；所述填料聚酰胺的体积应为有机溶剂体积的4～10倍，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ用量为1～5倍量色谱柱体积；所述石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ用量为4～8倍量色谱柱体积。
进一步地，所述阳离子交换树脂为强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂；所述无机碱溶液为氨水和氢氧化钠溶液；所述阳离子交换树脂质量为组分C质量的5～10倍；所述无机碱溶液体积为树脂体积的1～4倍；所述70%～100%的低级醇溶液体积为树脂体积的1～5倍。
优选地，本发明一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法，包括以下步骤：
（1）药材准备：将准噶尔乌头干燥根粉碎，过20目筛；
（2）提取：在准噶尔乌头药材粉末中加入5倍体积量的浓度为95%的乙醇溶液，在70℃温度下回流提取8 h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氨水调pH值至9～10；其中，所述乙醇溶液用稀盐酸调pH值为2～3；
（3）萃取：将步骤（2）得到的提取液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂至干，得到固体物质组分A即准噶尔乌头总生物碱；
（4）大孔吸附树脂纯化：组分A用50%的乙醇溶液溶解，将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，先用纯水洗脱，然后用50％的乙醇溶液洗脱，最后用75％的乙醇溶液洗脱，收集75％乙醇溶液洗脱液，减压回收溶剂，得到固体状物质即为生物碱组分B；其中，所述填料大孔吸附树脂的体积应为溶解组分A的50%乙醇溶液体积的6倍；所述纯水量用量为3倍色谱柱体积；所用50％的乙醇洗脱用量为3倍色谱柱体积；所用75％的乙醇洗脱用量为4倍色谱柱体积。
优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述填料聚酰胺的体积应为乙酸乙酯体积的8倍，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ用量为2倍量色谱柱体积，其中石油醚和丙酮体积比为10:1；所述石油醚和丙酮混合溶剂用量Ⅱ为5倍量色谱柱体积的，其中石油醚和丙酮体积比为4:1。
优选地，所述准噶尔乌头总生物碱通过阳离子交换树脂纯化：用稀盐酸调节95%的乙醇溶液pH值至2～3，将其加入组分C中，使整个溶液pH为2，将所得溶液加入到强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂中，先用去离子水冲洗该色谱柱至中性，然后用浓度为10％的氨水洗脱，再将树脂从色谱柱中取出，用80％的乙醇溶液在80℃回流提取5 h，收集乙醇提取液，减压回收溶剂，得到固体物质即本发明的准噶尔乌头总生物碱；其中，所述树脂质量为组分C质量的9倍；所述氨水体积为树脂体积的1倍；所述80％的乙醇溶液体积为树脂体积的3倍。
本发明的有益效果：本发明提供了一套结合酸溶碱沉提取、有机溶剂萃取、大孔吸附树脂分离、聚酰胺色谱纯化、阳离子交换树脂纯化等技术的优化组合的生物碱制备方法。当采用最优选的技术方案时将准噶尔乌头提取物中生物碱的含量从0.167％～0.24％大大提升至71％～75％，专属性强，达到了国家《药品注册管理办法》中对有效部位含量在50％以上的要求，这样的有效部位可以直接进行创新药物的研制。本发明所建立起来的制备方法可以获得纯度较高、杂质较少、符合国家《药品注册管理办法》要求的准噶尔乌头生物碱有效部位。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：准噶尔乌头总生物碱的薄层层析结果1；
图2：准噶尔乌头总生物碱的薄层层析结果2；
图3：准噶尔乌头总生物碱的HPLC分析时空白溶液色谱图；
图4：混合对照品的HPLC色谱图；
图5：本发明实施例1所述方法提取的准噶尔乌头总生物碱A组分的HPLC分析结果；
图6：本发明实施例2所述方法提取的准噶尔乌头总生物碱A组分的HPLC分析结果；
图7：本发明实施例3所述方法提取的准噶尔乌头总生物碱A组分的HPLC分析结果；
图8：本发明实施例4所述方法提取的准噶尔乌头总生物碱A组分的HPLC分析结果；
图9：本发明实施例5所述方法提取的准噶尔乌头总生物碱A组分的HPLC分析结果。
其中，a：根提取物，b：茎提取物，c：叶提取物，d：12-表-欧乌碱，e：宋果灵，f：尼奥灵，g：准噶尔碱，h：欧乌碱；A：尼奥灵，B：准噶尔碱，C：12-乙酰欧乌头碱，D：15-乙酰宋果灵，E：欧乌碱，F：宋果灵，G：12-表-欧乌碱；1：尼奥灵，2：准噶尔碱，3：12-乙酰欧乌头碱，4：15-乙酰宋果灵，5：欧乌碱，6：宋果灵，7：12-表-欧乌碱。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法
（1）准噶尔乌头药材准备：
将准噶尔乌头除尽泥土（不能水洗），准确称取准噶尔乌头干燥根5.0 kg，粉碎机粉碎后过20目筛，筛过后待用。
（2）酸溶碱沉法提取：
对准噶尔乌头药材粉末，加入5倍体积量浓度为95%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），在70℃温度回流提取8h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氨水调pH值至9～10。
（3）有机溶剂萃取法提取生物碱：
将步骤（2）得到的提取液用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至溶剂挥干，得到固体状物质320g，即为粗生物碱组分A，待用。
（4）大孔吸附树脂分离法纯化生物碱：
将组分A用50%的乙醇溶液溶解，后通过大孔吸附树脂（D101）色谱柱进行纯化。所用填料大孔吸附树脂的体积应为乙醇溶液体积的6倍。将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，首先使用纯水洗脱大孔吸附树脂色谱柱，所用纯水量为3倍色谱柱体积，除去糖、多酚、蛋白质和鞣质类成分。然后使用50％的乙醇洗脱，所用量为3倍色谱柱体积，除去皂苷、黄酮苷类成分。最后使用75％的乙醇洗脱，所用量为4倍色谱柱体积，收集此部分乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质210g，即为生物碱组分B，待用。
（5）聚酰胺色谱纯化生物碱：
将组分B用乙酸乙酯溶剂溶解，后通过聚酰胺色谱柱进行纯化，所用填料聚酰胺的体积应为乙酸乙酯溶剂体积的8倍。首先将乙酸乙酯溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，使用2倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（石油醚和丙酮体积比10:1）进行洗脱，进一步除去低极性的杂质，该部分洗脱液弃用。然后使用5倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（石油醚和丙酮体积比4:1）进行洗脱，收集此部分洗脱液，用旋转蒸发仪回收洗脱液至溶剂挥干，得到固体状物质170 g，即为生物碱组分C，待用。
（6）阳离子交换树脂纯化生物碱：
在组分C中，逐渐加入浓度为95%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），至整个溶液pH值至2为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为组分C质量的9倍。首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为10％的氨水溶液洗脱碱化，所用氨水体积量为树脂体积的1倍；再将树脂从色谱柱中取出，置连续回流提取器中，用浓度为80％的乙醇进行提取，所用80％的乙醇体积量为树脂体积的3倍，在80℃下回流提取5 h，收集此部分乙醇提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质80 g，即为生物碱组分D。
实施例2
一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法
（1）准噶尔乌头药材准备：
将准噶尔乌头除尽泥土（不能水洗），准确称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过10目筛，筛过后待用。
（2）酸溶碱沉法提取：
对准噶尔乌头药材粉末，加入3倍体积量浓度为100%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），在60℃温度下回流提取10h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氨水调pH值至9～10。
（3）有机溶剂萃取法提取生物碱：
对步骤（2）得到的提取液用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至溶剂挥干，得到固体状物质220g，即为粗生物碱组分A，待用。
（4）大孔吸附树脂分离法纯化生物碱：
将组分A用70%的乙醇溶液溶解，后通过大孔吸附树脂（D101）色谱柱进行纯化。所用填料大孔吸附树脂的体积应为乙醇溶液体积的4倍。将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，首先使用纯水洗脱大孔吸附树脂色谱柱，所用纯水量为2倍色谱柱体积，除去糖、多酚、蛋白质和鞣质类成分。然后使用20％的乙醇洗脱，所用量为2倍色谱柱体积，除去皂苷、黄酮苷类成分。最后使用100％的乙醇洗脱，所用量为2倍色谱柱体积，收集此部分乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质160g，即为生物碱组分B，待用。
（5）聚酰胺色谱纯化生物碱：
将组分B用丙酮溶剂溶解，后通过聚酰胺色谱柱进行纯化，所用填料聚酰胺的体积应为丙酮溶剂体积的4倍。首先将丙酮溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，使用1倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（体积比15:1）进行洗脱，进一步除去低极性的杂质，该部分洗脱液弃用。然后使用4倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（体积比6:1）进行洗脱，收集此部分洗脱液，用旋转蒸发仪回收洗脱液至溶剂挥干，得到固体状物质70 g，即为生物碱组分C，待用。
（6）阳离子交换树脂纯化生物碱：
在组分C中，逐渐加入浓度为70%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），至整个溶液pH值至2为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为组分C质量的5倍。首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为5％的氨水溶液洗脱碱化，所用氨水体积量为树脂体积的2倍；再将树脂从色谱柱中取出，置连续回流提取器中，用浓度为70％的乙醇进行提取，所用70％的乙醇体积量为树脂体积的1倍，在温度60℃下回流提取4 h，收集此部分乙醇提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质40 g，即为生物碱组分D。
实施例3
一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法
（1）准噶尔乌头药材准备：
将准噶尔乌头除尽泥土（不能水洗），准确称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过40目筛，筛过后待用。
（2）酸溶碱沉法提取：
对准噶尔乌头药材粉末，加入6倍体积量浓度为70%的甲醇（用稀盐酸调pH值至2～3），在100℃温度下回流提取12h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氨水调pH值至9～10。
（3）有机溶剂萃取法提取生物碱：
将步骤（2）得到的提取液用等体积的氯仿溶剂反复萃取3次，合并3次的氯仿萃取液，用旋转蒸发仪回收氯仿至溶剂挥干，得到固体状物质280g，即为粗生物碱组分A，待用。
（4）大孔吸附树脂分离法纯化生物碱：
将组分A用40%的乙醇溶液溶解，后通过大孔吸附树脂（D101）色谱柱进行纯化，所用填料大孔吸附树脂的体积应为乙醇溶液体积的8倍。将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，首先使用纯水洗脱大孔吸附树脂色谱柱，所用纯水量为6倍色谱柱体积，除去糖、多酚、蛋白质和鞣质类成分。然后使用40％的乙醇洗脱，所用量为5倍色谱柱体积，除去皂苷、黄酮苷类成分。最后使用60％的乙醇洗脱，所用量为6倍色谱柱体积，收集此部分乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质180 g，即为生物碱组分B，待用。
（5）聚酰胺色谱纯化生物碱：
将组分B用氯仿溶剂溶解，后通过聚酰胺色谱柱进行纯化，所用填料聚酰胺的体积应为氯仿溶剂体积的10倍。首先将氯仿溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，使用5倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（体积比8:1）进行洗脱，进一步除去低极性的杂质，该部分洗脱液弃用。然后使用8倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（体积比2:1）进行洗脱，收集此部分洗脱液，用旋转蒸发仪回收洗脱液至溶剂挥干，得到固体状物质110 g，即为生物碱组分C，待用。
（6）阳离子交换树脂纯化生物碱：
在组分C中，逐渐加入浓度为100%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），至整个溶液pH值至2为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为组分C质量的10倍。首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为40％的氨水溶液洗脱碱化，所用氨水体积量为树脂体积的4倍；再将树脂从色谱柱中取出，置连续回流提取器中，用浓度为100％的乙醇进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的5倍，在温度100℃下回流提取10h，收集此部分乙醇提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质60 g，即为生物碱组分D。
实施例4
一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法
（1）准噶尔乌头药材准备：
将准噶尔乌头除尽泥土（不能水洗），准确称取准噶尔乌头干燥根5.0 kg，粉碎机粉碎后过20目筛，筛过后待用。
（2）酸溶碱沉法提取：
对准噶尔乌头药材粉末，加入5倍体积量浓度为95%的甲醇（用稀盐酸调pH值至2～3），在70℃温度回流提取8h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氢氧化钠调pH值至9～10。
（3）有机溶剂萃取法提取生物碱：
将步骤（2）得到的提取液用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至溶剂挥干，得到固体状物质297g，即为粗生物碱组分A，待用。
（4）大孔吸附树脂分离法纯化生物碱：
将组分A用50%的乙醇溶液溶解，后通过大孔吸附树脂（D101）色谱柱进行纯化。所用填料大孔吸附树脂的体积应为乙醇溶液体积的6倍。将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，首先使用纯水洗脱大孔吸附树脂色谱柱，所用纯水量为3倍色谱柱体积，除去糖、多酚、蛋白质和鞣质类成分。然后使用50％的乙醇洗脱，所用量为3倍色谱柱体积，除去皂苷、黄酮苷类成分。最后使用75％的乙醇洗脱，所用量为4倍色谱柱体积，收集此部分乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质185g，即为生物碱组分B，待用。
（5）聚酰胺色谱纯化生物碱：
将组分B用氯仿溶剂溶解，后通过聚酰胺色谱柱进行纯化，所用填料聚酰胺的体积应为氯仿溶剂体积的8倍。首先将氯仿溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，使用2倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（石油醚和丙酮体积比10:1）进行洗脱，进一步除去低极性的杂质，该部分洗脱液弃用。然后使用5倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（石油醚和丙酮体积比4:1）进行洗脱，收集此部分洗脱液，用旋转蒸发仪回收洗脱液至溶剂挥干，得到固体状物质147 g，即为生物碱组分C，待用。
（6）阳离子交换树脂纯化生物碱：
在组分C中，逐渐加入浓度为95%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），至整个溶液pH值至2为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为组分C质量的9倍。首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为10％的氢氧化钠水溶液洗脱碱化，所用氢氧化钠体积量为树脂体积的1倍；再将树脂从色谱柱中取出，置连续回流提取器中，用浓度为80％的乙醇进行提取，所用80％的乙醇体积量为树脂体积的3倍，在80℃下回流提取5 h，收集此部分乙醇提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质52 g，即为生物碱组分D。
实施例5
一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法
（1）准噶尔乌头药材准备：
将准噶尔乌头除尽泥土（不能水洗），准确称取准噶尔乌头干燥根5.0 kg，粉碎机粉碎后过20目筛，筛过后待用。
（2）酸溶碱沉法提取：
对准噶尔乌头药材粉末，加入5倍体积量浓度为95%的甲醇（用稀盐酸调pH值至2～3），在70℃温度回流提取8h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氢氧化钠调pH值至9～10。
（3）有机溶剂萃取法提取生物碱：
将步骤（2）得到的提取液用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至溶剂挥干，得到固体状物质288g，即为粗生物碱组分A，待用。
（4）大孔吸附树脂分离法纯化生物碱：
将组分A用50%的乙醇溶液溶解，后通过大孔吸附树脂（D101）色谱柱进行纯化。所用填料大孔吸附树脂的体积应为乙醇溶液体积的6倍。将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，首先使用纯水洗脱大孔吸附树脂色谱柱，所用纯水量为3倍色谱柱体积，除去糖、多酚、蛋白质和鞣质类成分。然后使用50％的乙醇洗脱，所用量为3倍色谱柱体积，除去皂苷、黄酮苷类成分。最后使用75％的乙醇洗脱，所用量为4倍色谱柱体积，收集此部分乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质173g，即为生物碱组分B，待用。
（5）聚酰胺色谱纯化生物碱：
将组分B用丙酮溶剂溶解，后通过聚酰胺色谱柱进行纯化，所用填料聚酰胺的体积应为丙酮溶剂体积的8倍。首先将丙酮溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，使用2倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（石油醚和丙酮体积比10:1）进行洗脱，进一步除去低极性的杂质，该部分洗脱液弃用。然后使用5倍量色谱柱体积的石油醚和丙酮混合溶剂（石油醚和丙酮体积比4:1）进行洗脱，收集此部分洗脱液，用旋转蒸发仪回收洗脱液至溶剂挥干，得到固体状物质140 g，即为生物碱组分C，待用。
（6）阳离子交换树脂纯化生物碱：
在组分C中，逐渐加入浓度为95%的乙醇（用稀盐酸调pH值至2～3），至整个溶液pH值至2为止。将该溶液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为组分C质量的9倍。首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为10％的氢氧化钠水溶液洗脱碱化，所用氢氧化钠体积量为树脂体积的1倍；再将树脂从色谱柱中取出，置连续回流提取器中，用浓度为80％的乙醇进行提取，所用80％的乙醇体积量为树脂体积的3倍，在80℃下回流提取5 h，收集此部分乙醇提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至溶剂挥干，得到固体状物质49 g，即为生物碱组分D。
实施例6
各提取组分生物碱含量检测如下：
采用高效液相色谱法（HPLC）检测各组分中生物碱含量，过程如下。
色谱条件：使用日立高效液相色谱系统（日本）和Inertsil NH2柱（150×4.6mm, 5μm, GL Sciences Inc.）。日立液相色谱系统是由单泵（L-2130）和一个二极管阵列检测器（L-2455）以及D-2000组成的工作站。HPLC采用Inertsil NH2柱（150×4.6mm，5μm）；检测波长为270 nm、流速1.0 ml/min、进样量10μL、柱温30℃；流动相为正己烷和无水乙醇（92:8）。在此条件下7种生物碱能够得到有效的分离。
对照品溶液的制备：精密称取对照品尼奥灵、准噶尔碱、12-乙酰欧乌头碱、15-乙酰宋果灵、欧乌碱、宋果灵、12-表-欧乌碱各10 mg，置于同一10 mL容量瓶中，加氯仿定容至刻度，配成含有7种对照品均为1.0 mg/mL的混合对照品储备液；再精密量取混合对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL分别置10 mL容量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，配成浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的系列对照品溶液，待用。
对照品曲线的绘制：生物碱的每个标准曲线设计六个不同浓度，就其峰面积与相对应的分析物浓度作图，得线性回归方程y=ax+b，y代表对照品的峰面积，x代表对照品的浓度（mg/mL），最终表明所有化合物在其峰面积和相对浓度范围内均有良好线性（r 2 >0.999）。数据见表2：
供试品溶液的制备：对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中制备出的各A、B、C和D生物碱组分，分别取4 g，置于50 mL容量瓶中，加氯仿定容至刻度；再分别精密量取各供试液2.0 mL置50 mL容量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀待用，即为供试品溶液。
供试品溶液的检测：从供试品上清液吸取溶液10 μL，通过0.45 μm的微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱仪进行分析，用外标法测定以上7种生物碱含量。根据峰面积测定供试品中各生物碱含量，所建立的分析方法能较好地测定准噶尔乌头中7种生物碱的含量。
具体计算如下：例如，对实施例1中A组分的尼奥灵含量的计算，由高效液相色谱仪测得其峰面积为4207.6，根据回归方程y=1.636×105x+6.084×102计算出其浓度为0.022 mg/mL。以此类推，可以计算出准噶尔碱、12-乙酰欧乌碱、15-乙酰宋果灵、欧乌碱、宋果灵、12-表-欧乌碱的浓度，将这7种生物碱的浓度加和就是供试品溶液中总生物碱的浓度，这里通过计算得出为0.336 mg/mL。
实例1中A组分中7种生物碱的峰面积和浓度如表3所示：
。
但是，最后得出实施例1中A组分中总生物碱的含量还需要如下计算：
以此类推，可以分别计算出实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中各个A、B、C、D组分总生物碱的含量，计算结果见表4～表22：
各实施例中生物碱含量结果如表23所示：
从上表结果中可以看出，实例1中所涉及的各工艺参数均是经过优化考察的，因此各个组分所含生物碱含量均高于其它过程。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1. 一种准噶尔乌头总生物碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）药材准备：将准噶尔乌头干燥根粉碎，过10～40目筛；
（2）提取：在准噶尔乌头药材粉末中加入3～6倍体积量的70%～100%的低级醇溶液，在60℃～100℃温度回流提取8h～12h，冷却后过滤得到提取液，提取液用无机碱溶液调pH值至9～10；其中，所述低级醇溶液用稀盐酸调pH值为2～3；所述低级醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；所述无机碱溶液为氨水或氢氧化钠溶液；
（3）萃取：将步骤（2）得到的提取液用等体积的萃取剂萃取3次，合并3次的萃取液，减压回收溶剂至干，得到固体物质组分A即准噶尔乌头总生物碱；其中，所述萃取剂为乙酸乙酯和/或氯仿；所述准噶尔乌头总生物碱通过大孔吸附树脂纯化：组分A用40%～70%的乙醇溶液溶解，将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中，先用纯水洗脱，然后用20%～50%的乙醇溶液洗脱，最后用60%～100%的乙醇溶液洗脱，收集60%～100%乙醇溶液洗脱液，减压回收溶剂至干，得到进一步纯化的准噶尔乌头总生物碱组分B；
（4）聚酰胺纯化：准噶尔乌头总生物碱组分B用有机溶剂溶解，将溶解液加入到聚酰胺色谱柱上，先用石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ进行洗脱，然后用石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ进行洗脱，收集石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ洗脱液，减压回收溶剂至干，得到进一步纯化的准噶尔乌头总生物碱组分C；其中，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ中石油醚和丙酮体积比为8～15:1，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ中石油醚和丙酮体积比为2～6:1；
（5）阳离子交换树脂纯化：用稀盐酸调节 70%～100%的低级醇溶液pH值至2～3，将其加入准噶尔乌头总生物碱组分C中，至整个溶液pH值为2，将所得溶液加入到阳离子交换树脂色谱柱中，先用去离子水冲洗该色谱柱至中性，然后用浓度为5％～40％的无机碱溶液洗脱，再将树脂从色谱柱中取出，用70%～100%的低级醇溶液在60℃～100℃回流提取4h～10h，收集提取液，减压回收溶剂至干，得到进一步纯化的准噶尔乌头总生物碱组分D。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述填料大孔吸附树脂的体积应为溶解组分A的40%～70%乙醇溶液体积的4～8倍；所述纯水用量为2～6倍色谱柱体积；所用20%～50%的乙醇溶液用量为2～5倍色谱柱体积；所用60%～100%的乙醇溶液用量为2～6倍色谱柱体积。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿和丙酮中的一种或多种；所述填料聚酰胺的体积应为有机溶剂体积的4～10倍，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ用量为1～5倍量色谱柱体积；所述石油醚和丙酮混合溶剂Ⅱ用量为4～8倍量色谱柱体积。
4. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂为强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂；所述无机碱溶液为氨水和氢氧化钠溶液；所述阳离子交换树脂质量为组分C质量的5～10倍；所述无机碱溶液体积为树脂体积的1～4倍；所述70%～100%的低级醇溶液体积为树脂体积的1～5倍。
5. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）药材准备：将准噶尔乌头干燥根粉碎，过20目筛；
（2）提取：在准噶尔乌头药材粉末中加入5倍体积量的浓度为95%的乙醇溶液，在70℃温度下回流提取8 h，期间每隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取液，提取液用氨水调pH值至9～10；其中，所述乙醇溶液用稀盐酸调pH值为2～3；
（3）萃取：将步骤（2）得到的提取液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次的乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂至干，得到固体物质组分A即准噶尔乌头总生物碱；
（4）大孔吸附树脂纯化：组分A用50%的乙醇溶液溶解，将乙醇溶解液加入大孔吸附树脂色谱柱中 ，先用纯水洗脱，然后用50％的乙醇溶液洗脱，最后用75％的乙醇溶液洗脱，收集75％乙醇溶液洗脱液，减压回收溶剂，得到固体状物质即为生物碱组分B；其中，所述填料大孔吸附树脂的体积应为溶解组分A的50%乙醇溶液体积的6倍；所述纯水量用量为3倍色谱柱体积；所用50％的乙醇洗脱用量为3倍色谱柱体积；所用75％的乙醇洗脱用量为4倍色谱柱体积。
6. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述填料聚酰胺的体积应为乙酸乙酯体积的8倍，石油醚和丙酮混合溶剂Ⅰ用量为2倍量色谱柱体积，其中石油醚和丙酮体积比为10:1；所述石油醚和丙酮混合溶剂用量Ⅱ为5倍量色谱柱体积的，其中石油醚和丙酮体积比为4:1。
7. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述准噶尔乌头总生物碱通过阳离子交换树脂纯化：用稀盐酸调节95%的乙醇溶液pH值至2～3，将其加入组分C中，使整个溶液pH为2，将所得溶液加入到强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂中，先用去离子水冲洗该色谱柱至中性，然后用浓度为10％的氨水洗脱，再将树脂从色谱柱中取出，用80％的乙醇溶液在80℃回流提取5 h，收集乙醇提取液，减压回收溶剂，得到固体物质即本发明的准噶尔乌头总生物碱；其中，所述树脂质量为组分C质量的9倍；所述氨水体积为树脂体积的1倍；所述80％的乙醇溶液体积为树脂体积的3倍。
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