CN106631868B - 石菖蒲中含氮化合物的制备方法 - Google Patents

石菖蒲中含氮化合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其包含以下步骤：(1)将经水提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液，用大孔吸附树脂吸附，洗脱树脂，得洗脱液，即获得石菖蒲提取物；(2)将所述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同比移植斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5；分别得流分Fr.2、Fr3、Fr4，即可；其中薄层色谱检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水体积比为4∶1∶1的混合溶液；所述的三种石菖蒲中含氮化合物分别为乙酰胺、胍基化合物和半胱氨酸。使用本发明的制备方法，首次从石菖蒲中分离得到乙酰胺、胍基化合物和半胱氨酸等含氮类化合物。

Description

石菖蒲中含氮化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及石菖蒲中含氮化合物的制备方法。
背景技术
石菖蒲为天南星科菖蒲属植物，是一种常用中药，其根茎入药。《名医别录》记载：“久服聪耳明目，益心智，高智不老”，近年来药理报道，石菖蒲对小鼠学习和记忆有促进作用，对东莨菪碱造成的记忆获得障碍有明显的改善，可望治疗老年痴呆症。
我国石菖蒲植物资源丰富，其化学成分除挥发油有较多研究外，其余成分却很少有报道。仅发现授权专利CN1101812C报道了用石菖蒲经乙醇渗漉，渗漉液依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，提取物采用硅胶，Sephadex LH-20及大孔树脂等不同填充剂作层析分离得到了三个石菖蒲碱。目前，未发现从石菖蒲中提取分离酰胺、胍基、氨基酸类等含氮化合物的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术不能从石菖蒲中分离提取包括乙酰胺、胍基化合物、半胱氨酸的含氮化合物等缺点，而提供了石菖蒲中含氮化合物新的制备方法。本发明首次从石菖蒲中分离得到了乙酰胺、胍基化合物、半胱氨酸等含氮化合物，所述的乙酰胺(SCP-H-1)、胍基化合物(SCP-H-5和SCP-H-6)的结构式如下所示：
因此，本发明的方案之一是提供了一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其包含以下步骤：
(1)将经水提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液，用大孔吸附树脂吸附，洗脱树脂，得洗脱液，即获得石菖蒲提取物；
(2)将所述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过薄层色谱(TLC)检测，合并相同比移植(Rf)斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5；得流分Fr.2，即可；其中TLC检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水体积比为4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；所述的含氮化合物为乙酰胺。
步骤(1)中，所述的石菖蒲药材为本领域常规用来制备石菖蒲提取物的石菖蒲药材。所述水提醇沉的方法和条件可参照本领域常规提取石菖蒲提取物的方法和条件。较佳地，将石菖蒲药材和水混合提取后，收集提取液；向所述提取液中加醇类溶剂，沉降，收集上清液，即为本发明所述的经水提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液。本发明特别优选以下条件：在所述水提的过程中，水的用量较佳地为石菖蒲质量的6～10倍，更佳地为6～8倍，最佳地为8倍；所述的水提的提取温度较佳地为90℃～100℃；所述的水提的提取时间较佳地为30～120分钟，更佳地为60～120分钟；所述的水提的提取次数较佳地为1～4次，更佳地为2～3次，最佳地为3次。
较佳地，在所述的醇沉之前，将提取液按本领域常规的浓缩方法进行浓缩，如减压浓缩；较佳地，将所述的提取液浓缩至1mL/1g石菖蒲药材～2mL/1g石菖蒲药材为止，更佳地浓缩至1mL/1g石菖蒲药材，收集浓缩液。
在所述的醇沉的过程中，所述的醇类溶剂为本领域常规的石菖蒲水提醇沉所用醇类溶剂，较佳地为乙醇；所述的乙醇较佳地为95％乙醇，百分数为体积百分数；所述的醇类溶剂的加入量较佳地为在所述的醇类溶剂与所述的浓缩液的混合溶液中，加入至含有65～80％的醇类溶剂，更佳地为含有65～75％的醇类溶剂，百分数均为体积百分数；所述的沉降的时间较佳地为加入醇类溶剂后沉降8～12小时；所述的上清液的收集方法可参照本领域常规方法，如：离心收集上清液。
在步骤(1)所述的石菖蒲提取物的制备方法中，较佳地，将所述的上清液浓缩至干并和水混合溶解后，再用大孔吸附树脂吸附。所述的浓缩可按本领域常规的浓缩方法进行操作，如减压浓缩；所述的水的用量为0.2mL/1g石菖蒲药材～0.5mL/1g石菖蒲药材。
所述的用大孔吸附树脂吸附可参照本领域常规的树脂吸附方法，本发明特别优选以下条件：所述的大孔吸附树脂较佳地为D101大孔吸附树脂，更佳地为D101大孔吸附树脂柱；所述的D101大孔吸附树脂柱的径高比较佳地为1∶4～1∶12，更佳地为1∶8～1∶12；所述的用大孔吸附树脂吸附的上样流速较佳地为1～2BV/h，更佳地为1～1.5BV/h。所述的大孔吸附树脂的用量较佳地为0.5mL树脂/1g石菖蒲药材～1mL树脂/1g石菖蒲药材，更佳地为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材。
所述洗脱树脂的方法和条件可参照本领域常规树脂洗脱的方法和条件，较佳地，用树脂洗脱剂洗脱吸附后的大孔吸附树脂，收集树脂洗脱液，即可。本发明特别优选以下条件：所述的树脂洗脱剂较佳地为水，所述树脂洗脱剂的用量较佳地为4～6倍树脂体积，更佳地为5倍树脂体积。
在步骤(1)所述的石菖蒲提取物的制备方法较佳地还包括活性炭吸附步骤：将所述树脂洗脱液用活性炭吸附，洗脱活性炭，收集活性炭洗脱液，干燥，即可。
较佳地，在所述的树脂洗脱液用活性炭吸附之前，将所述的树脂洗脱液按本领域常规的浓缩方法进行浓缩，如减压浓缩。较佳地，将树脂洗脱液浓缩至0.2mL/1g石菖蒲药材～0.5mL/1g石菖蒲药材为止。
所述的用活性炭吸附的方法和条件可参照本领域常规活性炭吸附的方法，本发明优选以下条件：所述的活性炭较佳地为活性炭柱，径高比较佳地为1∶4～1∶12，更佳地为1∶8～1∶12；所述的活性炭吸附的上样流速较佳地为1～2BV/h，更佳地为1～1.5BV/h。活性炭的用量较佳地为0.5mL活性炭/1g石菖蒲药材～1mL活性炭/1g石菖蒲药材，更佳地为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材。
所述的洗脱活性炭的方法和条件可参照本领域常规洗脱活性炭的方法和条件，较佳地，用不同活性炭洗脱剂依次洗脱吸附后的活性炭，收集活性炭洗脱液，即可。本发明特别优选以下条件：所述的不同活性炭洗脱剂较佳地为水和乙醇水溶液；所述的乙醇水溶液较佳地为体积分数为30％的乙醇水溶液；所述的洗脱活性炭较佳地用所述的水洗脱活性炭后再用所述的乙醇水溶液洗脱活性炭；所述的水的用量较佳地为3～5倍活性炭体积，更佳地为4倍活性炭体积；所述的乙醇水溶液的用量较佳地为3～5倍活性炭体积，更佳地为4倍活性炭体积；所述的收集活性炭洗脱液较佳地收集30％乙醇水溶液的活性炭洗脱液。
所述的干燥可按本领域常规干燥方法操作，较佳地为减压浓缩后干燥。
步骤(2)中，所述的硅胶柱层析可参照本领域常规的硅胶柱层析的方法和条件进行。所述的梯度洗脱较佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度较佳地为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1∶0；最终梯度较佳地乙酸乙酯与甲醇的体积比为0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1；所述的TLC检测条件还可包括显色剂为茚三酮试剂。
本发明所述的石菖蒲中含氮化合物的制备方法较佳地还包括步骤(3)：将步骤(2)中获得的Fr.2流分经十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析，洗脱，得到ODS柱洗脱液，经薄层制备，即可。
步骤(3)中，所述的ODS柱层析可参照本领域常规的ODS柱层析的方法和条件进行。所述的洗脱可参照本领域常规的洗脱ODS柱的方法和条件进行，较佳的用水洗脱。所述的薄层制备可参照本领域常规的薄层制备的方法和条件进行，本发明优选以下条件：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液，显色剂较佳地为碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地为4∶1∶1。
本发明的方案之二是提供了一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其包含以下步骤：
(1)将上述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过TLC检测，合并相同Rf值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5，得Fr.3流分，即可；其中TLC检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比为4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；
(2)将步骤(1)所述的Fr.3流分经活性炭柱层析，洗脱活性炭柱，得活性炭柱洗脱液，将所述的活性炭柱洗脱液经阳离子交换树脂吸附，洗脱阳离子交换树脂，得阳离子减缓树脂洗脱液，将所述的阳离子交换树脂洗脱液经薄层制备，即可；
其中，以正丁醇、乙酸和水体积比为4∶1∶1的混合溶液为展开剂的所述含氮化合物的Rf值为0.4。
该含氮化合物具有SCP-H-5结构式所示的结构；较佳地以碱金属盐和/或碱土金属盐的形式存在，例如钠盐、钾盐、镁盐。
步骤(1)中，所述的硅胶柱层析可参照本领域常规的硅胶柱层析的方法和条件进行。所述的梯度洗脱较佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度较佳地为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1∶0；最终梯度较佳地乙酸乙酯与甲醇的体积比为0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1；所述的TLC检测条件还可包括显色剂为茚三酮试剂。
步骤(2)中，所述的活性炭柱层析可参照本领域常规的活性炭柱层析的方法和条件进行；所述的洗脱活性炭柱可参照本领域常规的洗脱活性炭柱的方法和条件进行，较佳地用10％-30％乙醇水溶液洗脱，百分数为体积百分数；所述的洗脱阳离子交换树脂可参照本领域常规的洗脱阳离子交换树脂的方法和条件进行，较佳地用5％氨水洗脱，百分数为体积百分数。
步骤(2)中，所述的Rf值为特定展开剂下获得的检测值；所述的特定展开剂为正丁醇、乙酸和水体积比为4∶1∶1的混合溶液；所述的特定展开剂仅为检测时使用的展开剂，并不能因此限制所述的薄层制备中使用的展开剂；所述的薄层制备可参照本领域常规的薄层制备的方法和条件进行，本发明优选以下条件：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液，显色剂较佳地为碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地为4∶1∶1。
本发明的方案之三是提供了一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其包含以下步骤：
(1)将上述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过TLC检测，合并相同Rf值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5，得Fr.3流分，即可；其中TLC检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比为4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；
(2)将步骤(1)所述的Fr.3流分经活性炭柱层析，洗脱活性炭柱，得活性炭柱洗脱液，将所述的活性炭柱洗脱液经阳离子交换树脂吸附，洗脱阳离子交换树脂，得阳离子减缓树脂洗脱液，将所述的阳离子交换树脂洗脱液经薄层制备，即可；所述的含氮化合物的结构式如下：
其中，以正丁醇、乙酸和水体积比为4∶1∶1的混合溶液为展开剂的SCP-H-6的Rf值为0.7。
步骤(1)中，所述的硅胶柱层析可参照本领域常规的硅胶柱层析的方法和条件进行。所述的梯度洗脱较佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度较佳地为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1∶0；最终梯度较佳地乙酸乙酯与甲醇的体积比为0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1；所述的TLC检测条件还可包括显色剂为茚三酮试剂。
步骤(2)中，所述的活性炭柱层析可参照本领域常规的活性炭柱层析的方法和条件进行；所述的洗脱活性炭柱可参照本领域常规的洗脱活性炭柱的方法和条件进行，较佳地用10％-30％乙醇水溶液洗脱，百分数为体积百分数；所述的洗脱阳离子交换树脂可参照本领域常规的洗脱阳离子交换树脂的方法和条件进行，较佳地用5％氨水洗脱，百分数为体积百分数。
步骤(2)中，所述的Rf值为特定展开剂下获得的检测值；所述的特定展开剂为正丁醇、乙酸和水体积比为4∶1∶1的混合溶液；所述的特定展开剂仅为检测时使用的展开剂，并不能因此限制所述的薄层制备中使用的展开剂；所述的薄层制备可参照本领域常规的薄层制备的方法和条件进行，本发明优选以下条件：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液，显色剂较佳地为碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地为4∶1∶1。
本发明的方案之四是提供了一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其包含以下步骤：
(1)将上述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过TLC检测，合并相同Rf值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5；其中TLC检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比为4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；
(2)将步骤(1)所获得的Fr.4流分经硅胶柱层析，洗脱，通过TLC检测，合并相同Rf值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到4个流分Fr.4-1～Fr.4-4；将流分Fr.4-4薄层制备，即可获得所要制备的含氮化合物；其中TLC检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；所述的含氮化合物为半胱氨酸。
步骤(1)中，所述的硅胶柱层析可参照本领域常规的硅胶柱层析的方法和条件进行。所述的梯度洗脱较佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度较佳地为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1∶0；最终梯度较佳地乙酸乙酯与甲醇的体积比为0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1；所述的TLC检测条件还可包括显色剂为茚三酮试剂。
步骤(2)中所述的硅胶柱层析可参照本领域常规的柱层析的方法和条件进行。所述的洗脱可参照本领域常规的洗脱方法和条件进行，本发明优选用添加甲酸的正丁醇水溶液洗脱；其中，甲酸的添加量较佳地为正丁醇水溶液体积的0.1％，正丁醇水溶液的浓度较佳地为95％～100％；百分数为体积百分数；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1；所述的TLC检测条件还可包括显色剂为茚三酮试剂；所述的薄层制备可参照本领域常规的薄层制备的方法和条件进行，本发明优选以下条件：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液，显色剂较佳地为碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比较佳地为4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地为4∶1∶1。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：采用本发明的制备方法，首次从石菖蒲中分离得到乙酰胺、胍基化合物、半胱氨酸等含氮类化合物。
附图说明
图1为实施例8中所述的SCP-H-8衍生化试剂的液相色谱图谱。
图2为实施例8中所述的半胱氨酸衍生化试剂的液相色谱图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材3.0kg，加入6倍量水，100℃下提取1小时，提取3次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约3L，即浓缩至约1mL/g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为70％，沉降8h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加1000mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材，即1800mL树脂，柱径高比为1∶8，上样流速为1.0BV/h，上样结束后，用5BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约600mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材，即1800mL活性炭柱，柱径高比为1∶8，上样流速为1.0BV/h。上样结束后，先用4BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用4BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品20.62g，得率约0.69％。
实施例2石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材5.0kg，加入8倍量水，100℃下提取1小时，提取3次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约5L，即浓缩至1mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为70％，沉降12h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加1500mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材，即3000mL树脂柱，柱径高比为1∶8，上样流速为1.0BV/h，上样结束后，用5BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约1000mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材，即3000mL，柱径高比为1∶8，上样流速为1.0BV/h。上样结束后，先用4BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用4BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品68.03g，得率约1.36％。
实施例3石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材5.0kg，加入10倍量水，95℃下提取0.5小时，提取4次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约10L，即浓缩至2mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为65％，沉降12h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加2500mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为1mL树脂/1g石菖蒲药材，即5000mL树脂柱，柱径高比为1∶4，上样流速为2.0BV/h，上样结束后，用4BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约2500mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为1mL活性炭/1g石菖蒲药材，即5000mL，柱径高比为1∶4，上样流速为2.0BV/h。上样结束后，先用3BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用3BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品55.26g，得率约1.11％。
实施例4石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材3.0kg，加入10倍量水，90℃下提取2小时，提取1次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约6L，即浓缩至2mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为80％，沉降10h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加900mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.5mL树脂/1g石菖蒲药材，即1500mL树脂柱，柱径高比为1∶12，上样流速为1.5BV/h，上样结束后，用6BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约900mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.5mL活性炭/1g石菖蒲药材，即1500mL，柱径高比为1∶12，上样流速为1.5BV/h。上样结束后，先用5BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用5BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品29.18g，得率约0.97％。
实施例5石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材3.0kg，加入6倍量水，100℃下提取2小时，提取2次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约3L，即浓缩至1mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为75％，沉降12h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加600mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.7mL树脂/1g石菖蒲药材，即2100mL树脂柱，柱径高比为1∶8，上样流速为1BV/h，上样结束后，用5BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约1000mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.7mL活性炭/1g石菖蒲药材，即2100mL，柱径高比为1∶8，上样流速为1BV/h。上样结束后，先用5BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用5BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品30.09g，得率约1.00％。
实施例6乙酰胺(SCP-H-1)的制备
获得石菖蒲提取物的方法如实施例2。取提取物8g上硅胶柱层析，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脱，TLC检测(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：茚三酮试剂)，合并相同色谱斑点，得到5个Fr.1～Fr.5流分，Fr.2流分经ODS柱层析，得到水洗脱部分，经薄层制备(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：碘)得化合物SCP-H-1(纯度＞95％；15.2mg)。各制备条件中，百分数为体积百分数，比例均为体积比。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.64(3H，s，-CH3)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：25.3(-CH3)，176.3(＞CO)。
实施例7胍基化合物(SCP-H-5和SCP-H-6)的制备
获得石菖蒲提取物的方法如实施例2。取提取物8g上硅胶柱层析，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脱，TLC检测(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：茚三酮试剂)，合并相同色谱斑点，得到5个Fr.1～Fr.5流分。Fr.3流分经活性炭柱层析，10％-30％乙醇洗脱，阳离子交换树脂5％氨水洗脱部分，经薄层制备(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：碘)得化合物SCP-H-5(纯度＞95％；Rf值0.4；1.2mg；)和SCP-H-6(纯度＞95％；Rf值0.7；2.4mg)。各制备条件中，百分数为体积百分数，比例均为体积比。其中，SCP-H-5以盐的形式存在，例如以钠、钾或镁盐形式存在，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.46(4H，brs，-NH2)。SCP-H-6，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：13.96(1H，brs，-COOH)，8.39(2H，brs，-NH2)，8.13(1H，brs，-NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：143.2(＞C＝NH)，150.4(＞C＝O)。
实施例8半胱氨酸(SCP-H-8)的制备
获得石菖蒲提取物的方法如实施例2。取提取物26.38g上硅胶柱层析，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脱，TLC检测(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：茚三酮试剂)，合并相同色谱斑点，得到5个Fr.1～Fr.5流分。其中Fr.4流分合并经硅胶柱层析，水饱和的正丁醇溶液(正丁醇体积分数为95％)+0.1％甲酸洗脱，TLC检测(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：茚三酮试剂)，合并相同色谱斑点，得到4个Fr.4-1～Fr.4-4流分。Fr.4-4经薄层制备(展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，显色剂：碘)得SCP-H-8(纯度＞95％；20.0mg)。各制备条件中，百分数为体积百分数，比例均为体积比。
将SCP-H-8与对照品半胱氨酸经HPLC柱前氨基酸衍生化后进行比较。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-30mmol/1醋酸铵溶液(pH7.5)为流动相；柱温30℃；流速1.0ml/min；检测波长分别为275nm；按表1进行梯度洗脱。
表1
对照品溶液的制备：准确称取半胱氨酸标准品，用0.1mol/L的HC1配制成储备液(每种氨基酸浓度约为1.5mmol/L)。移取50μL储备液置于2mL具有磨口塞的试管内，加入邻硝基苯磺酰氯的乙醇溶液(60mmol/L)150μL、硼砂缓冲液(0.05mmoL/L，pH 9.0)1mL，混匀，塞紧后于25℃水浴中衍生反应10min后立即经0.45μm滤膜过滤，即得。
供试品溶液的制备：准确称取SCP-H-8，用0.1mol/L的HC1配制成储备液(浓度约为50mg/L)。移取50μL储备液置于2mL的具塞磨口试管内，加入邻硝基苯磺酰氯的乙醇溶液(60mmol/L)150μL、硼砂缓冲液(0.05mmoL/L，pH 9.0)1mL，混匀，塞紧后于25℃水浴中衍生反应10min后立即经0.45μm滤膜过滤，即得。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
SCP-H-8衍生化试剂的液相色谱图如图1所示，半胱氨酸衍生化试剂的液相色谱图如图2所示。可以看出，图1和图2在保留时间6min以及7.3min左右均出现了保留峰，6min左右的保留峰为SCP-H-8(图1)或半胱氨酸(图2)衍生化试剂的保留峰，7.3min左右的保留峰为未衍生化的SCP-H-8(图1)或半胱氨酸(图2)的保留峰。这一结果表明SCP-H-8为半胱氨酸。
效果实施例1石菖蒲提取物对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
采用记忆获得障碍模型分别研究实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物对动物记忆障碍的改善作用。实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物分别简称为SCPd-1和SCPd-2。
实验动物采用小鼠。记忆获得障碍药理实验方法：动物经口灌胃给药，阴性对照组和模型组小鼠给予饮用水，多奈哌齐组给予多奈哌齐1.6mg/kg，SCPd-1高剂量组和低剂量组石菖蒲提取物分别给予5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-1，SCPd-2高剂量组、中剂量和低剂量组分别给予7g生药/kg、5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-2，连续给药两周。除阴性对照组外其他组别的小鼠最后一次给药后1小时，腹腔注射东莨菪碱3mg/kg。30min后，将所有组别小鼠放入跳台仪内适应5min。然后通电，动物受到电击后的正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台，如此训练5min。24小时后重测，记录受电击的动物数，第一次跳下平台的潜伏期和5min内的错误总数。
石菖蒲提取物SCPd-1结果如表2所示，SCPd-2的结果如表3所示.由表2和表3数据可见，石菖蒲提取物SCPd-1和SCPd-2都有明显的改善小鼠学习的作用。
表2.SCPd-1对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
表3.SCPd-2对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
效果实施例2石菖蒲提取物对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
采用记忆再现障碍模型分别研究实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物对动物记忆障碍的改善作用。实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物分别简称为SCPd-1和SCPd-2。
记忆再现障碍药理实验方法：动物经口灌胃给药，阴性对照组和第模型组小鼠给予饮用水，多奈哌齐组给予多奈哌齐1.6mg/kg，SCPd-1高剂量组和低剂量组石菖蒲提取物分别给予5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-1，SCPd-2高剂量组、中剂量和低剂量组分别给予7g生药/kg、5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-2，连续给药两周。末次给药后1小时，所有组别的小鼠分别以避暗法训练一次。将小鼠放入避暗箱内，背朝洞口放入明室，同时启动计时器，动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时自动停止。取出小鼠，记录每鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间，此即潜伏期。24小时后进行测试，测试前30min，除阴性对照组外其他组别的小鼠口服给予45％的乙醇溶液(0.1mL/10g)。记录动物由明室进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数(错误次数)。
石菖蒲提取物SCPd-1结果如表4所示，SCPd-2的结果如表5所示。由表4和表5数据可见，石菖蒲提取物SCPd-1和SCPd-2都有明显的改善小鼠记忆的作用。
表4.SCPd-1对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
表5.SCPd-2对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
将本发明制备的石菖蒲提取物与授权专利一种石菖蒲提取物、含其药物组合物及其制备方法和应用(授权公告号：CN101785816B)中制备的石菖蒲提取物进行比较，结果如对比例1和对比例2所示。
对比例1所述授权专利的石菖蒲提取物对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
所述授权专利效果实施例的实验方法和步骤参照本发明的效果实施例，不同之处在于，用石杉碱甲替换本发明使用的多奈哌齐，并且错误次数的统计时间为3min。其实验结果如表6所示。
表6.SCP-3对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
##P＜0.01，与空白对照组相比
*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比
结合表2、表3和表6中的数据可知，用药量超过2.5g生药/kg的SCPd-1、SCPd-2和SCP-3在小鼠记忆获得障碍的实验中均有效。特别地，在5min内的错误总次数方面，与相应的模型组数据相比可知，本发明的提取物均具有明显区别，具有显著的药效。
对比例2所述授权专利的石菖蒲提取物对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
所述授权专利效果实施例的实验方法和步骤参照本发明的效果实施例，不同之处在于，用石杉碱甲替换本发明使用的多奈哌齐。其实验结果如表7所示。
表7.SCP-3对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
##P＜0.01，与空白对照组相比
*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比
结合表4、表5和表7中数据可知，用药量超过5g生药/kg的SCPd-1、SCPd-2和SCP-3在小鼠记忆再现障碍的实验中均有效。特别地，在5min内的错误总次数方面，与相应的模型组数据相比可知，本发明提取物SCPd-2在2.5g生药/kg时的数据有明显区别，具有显著的药效。

Claims (53)

1.一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将经水提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液，用大孔吸附树脂吸附，洗脱树脂，得洗脱液，即获得石菖蒲提取物；
(2)将所述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同比移植斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5；得流分Fr.2，即可；其中薄层色谱检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1～4:1:5的混合溶液；所述的含氮化合物为乙酰胺。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的水提醇沉的步骤为将石菖蒲药材和水混合提取后，收集提取液；向所述提取液中加醇类溶剂，沉降，收集上清液，即为所述的经水提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的水提的步骤中，水的用量为石菖蒲质量的6～10倍；
和/或，提取的温度为90℃～100℃；
和/或，提取时间为30～120分钟；
和/或，提取次数为1～4次；
和/或，所述的醇沉的步骤中，醇类溶剂为乙醇；
和/或，所述的醇沉的时间为加入醇类溶剂后沉降8～12小时。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的水提的步骤中，所述的水的用量为石菖蒲质量的6～8倍；
和/或，所述的提取时间为60～120分钟；
和/或，所述的提取次数为2～3次；
和/或，所述的醇类溶剂为95％乙醇，百分数为体积百分数。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述的醇沉的步骤之前，将所述的水提的提取液减压浓缩，收集浓缩液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将所述的水提的提取液浓缩至1mL/1g石菖蒲药材～2mL/1g石菖蒲药材为止。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的醇类溶剂的加入量为在所述的醇类溶剂与所述的浓缩液的混合溶液中，加入至含有65～80％的醇类溶剂，百分数为体积百分数。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的醇类溶剂的加入量为在所述的醇类溶剂与所述的浓缩液的混合溶液中，加入至含有65～75％的醇类溶剂，百分数为体积百分数。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的醇类溶剂的加入量为在所述的醇类溶剂与所述的浓缩液的混合溶液中，加入至含有65～80％的醇类溶剂，百分数为体积百分数。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的醇类溶剂的加入量为在所述的醇类溶剂与所述的浓缩液的混合溶液中，加入至含有65～75％的醇类溶剂，百分数为体积百分数。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的用大孔吸附树脂吸附的步骤中，大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂；
和/或，用大孔吸附树脂吸附的上样流速为1～2BV/h；
和/或，大孔吸附树脂的用量为0.5mL树脂/1g石菖蒲药材～1mL树脂/1g石菖蒲药材。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂柱；
和/或，所述的上样流速为1～1.5BV/h；
和/或，所述的大孔吸附树脂的用量为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的D101大孔吸附树脂柱的径高比为1:4～1:12。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述的D101大孔吸附树脂柱的径高比为1:8～1:12。
15.如权利要求11-14任一所述的制备方法，其特征在于，在所述的用大孔吸附树脂吸附的步骤之前，将上清液浓缩至干并和水混合溶解。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，在所述的用大孔吸附树脂吸附的步骤之前，将上清液浓缩至干并和水混合溶解，所述的水的用量为0.2mL/1g石菖蒲药材～0.5mL/1g石菖蒲药材。
17.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩为减压浓缩。
18.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)所述的洗脱树脂的步骤中，树脂洗脱剂为水；
和/或，树脂洗脱剂的用量为4～6倍树脂体积。
19.如权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述的树脂洗脱剂的用量为5倍树脂体积。
20.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)还包含以下步骤：将树脂洗脱液用活性炭吸附，洗脱活性炭，收集活性炭洗脱液，干燥，即可。
21.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，在所述的树脂洗脱液用活性炭吸附之前，将所述的树脂洗脱液减压浓缩。
22.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，将所述的树脂洗脱液浓缩至0.2mL/1g石菖蒲药材～0.5mL/1g石菖蒲药材为止。
23.如权利要求20-22任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的活性炭为活性炭柱，径高比为1:4～1:12；
和/或，所述的活性炭吸附的上样流速为1～2BV/h；
和/或，活性炭的用量为0.5mL活性炭/1g石菖蒲药材～1mL活性炭/1g石菖蒲药材。
24.如权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述的活性炭柱的径高比为1:8～1:12；
和/或，所述的活性炭吸附的上样流速为1～1.5BV/h；
和/或，所述的活性炭的用量为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材。
25.如权利要求20-22任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述的洗脱活性炭的步骤中，活性炭洗脱剂为水和乙醇水溶液；
和/或，所述的干燥为减压浓缩后干燥。
26.如权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述的洗脱活性炭为用所述的水洗脱活性炭后再用所述的乙醇水溶液洗脱活性炭。
27.如权利要求25所述的制备方法，其特征在于，在所述的洗脱活性炭的步骤中，所述的乙醇水溶液为体积分数为30％的乙醇水溶液；
和/或，所述的水的用量为3～5倍活性炭体积；
和/或，所述的乙醇水溶液的用量为3～5倍活性炭体积。
28.如权利要求27所述的制备方法，其特征在于，在所述的洗脱活性炭的步骤中，所述的水的用量为4倍活性炭体积；
和/或，所述的乙醇水溶液的用量为4倍活性炭体积。
29.如权利要求28所述的制备方法，其特征在于，所述的收集活性炭洗脱液为收集30％乙醇水溶液的活性炭洗脱液。
30.如权利要求26所述的制备方法，其特征在于，在所述的洗脱活性炭的步骤中，所述的乙醇水溶液为体积分数为30％的乙醇水溶液；
和/或，所述的水的用量为3～5倍活性炭体积；
和/或，所述的乙醇水溶液的用量为3～5倍活性炭体积。
31.如权利要求30所述的制备方法，其特征在于，在所述的洗脱活性炭的步骤中，所述的水的用量为4倍活性炭体积；
和/或，所述的乙醇水溶液的用量为4倍活性炭体积。
32.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述的收集活性炭洗脱液为收集30％乙醇水溶液的活性炭洗脱液。
33.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的梯度洗脱以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:0；最终梯度乙酸乙酯与甲醇的体积比为0:1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1。
34.如权利要求33所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层色谱检测条件还包括显色剂为茚三酮试剂。
35.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的石菖蒲中含氮化合物的制备方法还包括步骤(3)：将步骤(2)中获得的Fr.2流分经十八烷基硅烷键合硅胶柱层析，洗脱，得到十八烷基硅烷键合硅胶柱洗脱液，经薄层制备，即可。
36.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗脱的洗脱剂为水；所述的薄层制备条件如下：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液。
37.如权利要求36所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层制备条件：显色剂为碘。
38.如权利要求36所述的制备方法，其特征在于，所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1～4:1:5。
39.一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将权利要求1的步骤(1)中所述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同迁移值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5，得Fr.3流分，即可；其中薄层色谱检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比为4:1:1～4:1:5的混合溶液；
(2)将步骤(1)所述的Fr.3流分经活性炭柱层析，洗脱活性炭柱，得活性炭柱洗脱液，将所述的活性炭柱洗脱液经阳离子交换树脂吸附，洗脱阳离子交换树脂，得阳离子减缓树脂洗脱液，将所述的阳离子交换树脂洗脱液经薄层制备，即可；所述的含氮化合物具有SCP-H-5结构式所示的结构，以碱金属盐和/或碱土金属盐的形式存在：
其中，以正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1的混合溶液为展开剂的所述含氮化合物的迁移值为0.4。
40.一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将权利要求1的步骤(1)中所述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同迁移值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5，得Fr.3流分，即可；其中薄层色谱检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比为4:1:1～4:1:5的混合溶液；
(2)将步骤(1)所述的Fr.3流分经活性炭柱层析，洗脱活性炭柱，得活性炭柱洗脱液，将所述的活性炭柱洗脱液经阳离子交换树脂吸附，洗脱阳离子交换树脂，得阳离子减缓树脂洗脱液，将所述的阳离子交换树脂洗脱液经薄层制备，即可；所述的含氮化合物的结构式如下：
其中，以正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1的混合溶液为展开剂的SCP-H-6的迁移值为0.7。
41.如权利要求39或40所述的制备方法，其特征在于，所述的梯度洗脱以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:0；最终梯度乙酸乙酯与甲醇的体积比为0:1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1。
42.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层色谱检测条件还包括显色剂为茚三酮试剂。
43.如权利要求39或40所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的洗脱活性炭柱用10％-30％乙醇水溶液洗脱，所述的洗脱阳离子交换树脂用5％氨水洗脱，百分数均为体积百分数；所述的薄层制备的条件如下：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液。
44.如权利要求43所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层制备的条件如下：显色剂为碘。
45.如权利要求43所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层制备的条件如下：所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1～4:1:5。
46.一种石菖蒲中含氮化合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将权利要求1的步骤(1)中所述的石菖蒲提取物经过经硅胶柱层析，梯度洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同迁移值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到5个流分Fr.1～Fr.5；其中薄层色谱检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比为4:1:1～4:1:5的混合溶液；
(2)将步骤(1)所获得的Fr.4流分经硅胶柱层析，洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同迁移值斑点对应的硅胶柱洗脱液，先后得到4个流分Fr.4-1～Fr.4-4；将流分Fr.4-4薄层制备，即可获得所要制备的含氮化合物；其中薄层色谱检测的条件如下，展开剂为正丁醇、乙酸和水的体积比4:1:1～4:1:5的混合溶液；所述的含氮化合物为半胱氨酸。
47.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的梯度洗脱以乙酸乙酯的甲醇溶液为洗脱剂，初始梯度为乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:0；最终梯度乙酸乙酯与甲醇的体积比为0:1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1；
和/或，在步骤(2)中，所述的洗脱为用添加甲酸的正丁醇水溶液洗脱；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1；所述的薄层制备的条件如下：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液。
48.如权利要求47所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的薄层色谱检测条件还包括显色剂为茚三酮试剂。
49.如权利要求47所述的制备方法，其特征在于，所述的甲酸的添加量为所述的正丁醇水溶液的体积的0.1％，百分数为体积百分数。
50.如权利要求47所述的制备方法，其特征在于，所述的正丁醇水溶液中正丁醇的浓度为95％～100％，百分数为体积百分数。
51.如权利要求47所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的薄层色谱检测条件还包括显色剂为茚三酮试剂。
52.如权利要求47所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层制备的条件如下：显色剂为碘。
53.如权利要求47所述的制备方法，其特征在于，所述的薄层制备的条件如下：所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水体积比为4:1:1～4:1:5。
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