CN105669480B - 一种γ‑氨基丁酸的提取方法 - Google Patents

一种γ‑氨基丁酸的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种γ‑氨基丁酸的提取方法。该提取方法包括下述步骤：(1)将瓜蒌皮粗提取液上阳离子交换树脂柱，用水洗涤，然后用氨水进行洗脱，将洗脱液浓缩干燥得到固体；(2)将固体用常压正相柱纯化，先用二氯甲烷：甲醇＝1:1进行洗脱，然后用二氯甲烷：甲醇＝1:(2～3)进行洗脱，分段接收3～5个柱体积的洗脱液，将检测只有一个斑点的洗脱液合并，浓缩得到粗品；(3)将粗品用常压正相柱纯化，先用二氯甲烷：甲醇＝1:1进行洗脱，然后用二氯甲烷：甲醇＝1:(2～3)进行洗脱，分段接收3～5个柱体积的洗脱液，浓缩即得到γ‑氨基丁酸纯品。本发明的方法所得γ‑氨基丁酸纯度高，可直接用于瓜蒌皮药材的质量控制。

Description

一种γ-氨基丁酸的提取方法
技术领域
本发明涉及药物化学，具体涉及一种γ-氨基丁酸的提取方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，简称GABA)，广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有GABA。在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量大约为0.1-0.6mg/克组织，免疫学研究表明，其浓度最高的区域为中脑中黑质。GABA是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。在人体，GABA还直接调控肌肉张力。
瓜蒌(拉丁学名：Trichosanthes kirilowii Maxim)的根(中药名天花粉)、果肉(中药名栝楼实)、果皮(中药名栝楼皮)、种子(中药名栝楼仁)都是有名的中药。其中瓜蒌皮被制成注射液(瓜蒌皮注射液，上海上药第一生化药业有限公司)，凭其优良的品质和疗效，在国内被广泛用于心绞痛，冠心病等。之前有人报道过瓜蒌根中含有GABA(柱前衍生反相高效液相色谱法测定天花粉中γ-氨基丁酸含量，潘建，中国药业)，但是作为主要成分，瓜蒌皮中的GABA情况至今未有报道。
瓜蒌皮的化学成分比较复杂，其真正的有效成分至今没有明确的报道，因此对其化学成分进行仔细研究，具有重要的意义。现有较多文献报道瓜蒌皮的化学成分，瓜蒌果皮化学成分(山东中医药大学博士学位论文，李爱峰，2011)中对瓜蒌皮化学成分进行了详尽的综述和分析，在做水溶性化学成分分离时，其选用826型树脂，分离得到极性相对较小的化合物，对于瓜蒌皮中含量高，极性较大的γ-氨基丁酸却没有分离得到。李爱峰等人的专利：一种从瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分的方法(CN 103304613A)、一种从瓜蒌皮中分离纯化5种嘌呤及嘧啶碱基的方法(CN 103304490A)、一种从瓜蒌皮中分离纯化3种黄酮苷的方法(CN 103304611A)等，也只是采用反相制备色谱对其中的黄酮类、嘌呤类、嘧啶类化学成分进行研究，γ-氨基丁酸在反相色谱中无保留，因此没有分离得到γ-氨基丁酸。
瓜蒌皮注射液作为年销量过两亿的中药注射液，其所使用的原料瓜蒌皮的化学成分分离和鉴定具有十分重要的意义。因此，从瓜蒌皮中分离、鉴定出γ-氨基丁酸，并将其应用于生物制药领域，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种γ-氨基丁酸的提取方法，本发明利用该方法首次从瓜蒌皮中提取出了γ-氨基丁酸，该方法操作简便，重复性好，环保安全。
本发明是通过以下技术方案实现上述目的的：
本发明提供一种γ-氨基丁酸的提取方法，其包括下述步骤：
(1)将瓜蒌皮粗提取液上阳离子交换树脂柱，用水洗涤，然后用氨水作为洗脱剂进行洗脱，将洗脱液浓缩干燥得到固体；
(2)将步骤(1)中的固体用常压正相柱纯化，先用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:(2～3)作为洗脱剂进行洗脱，分段接收3～5个柱体积的洗脱液，将检测只有一个斑点的洗脱液合并，浓缩得到粗品；
(3)将步骤(2)中的粗品用常压正相柱纯化，先用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:(2～3)作为洗脱剂进行洗脱，分段接收3～5个柱体积的洗脱液，将检测只有一个斑点的洗脱液合并，浓缩即得到γ-氨基丁酸纯品。
其中，步骤(1)中所述的瓜蒌皮粗提取液较佳地通过下述步骤制得：将瓜蒌皮与水混合后，常压下回流提取3～4次，合并提取液；减压浓缩，加入质量百分比浓度为90％～95％的乙醇，加至乙醇质量百分比为70％～75％，静置，过滤，取上清液即得瓜蒌皮粗提取液。
其中，所述的减压浓缩较佳地为减压浓缩至瓜蒌皮的原料重量的0.75～1倍。
其中，步骤(1)中所述的阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂较佳地为购自于上海树脂厂的732型强酸性阳离子交换树脂。
其中，步骤(1)中所述的水较佳地为去离子水。
其中，步骤(1)中所述的洗脱的流速较佳地为200～250mL/min。
其中，步骤(1)中所述的氨水的浓度较佳地为1～2mol/L。
其中，步骤(2)与步骤(3)中，所述的二氯甲烷：甲醇＝1:1作为洗脱剂的用量较佳地以检测黄酮苷类条带完全洗脱下来为止。
其中，步骤(2)中，常压正相柱的填料较佳地为200～300目硅胶，所述的硅胶的用量为所述的固体重量的20～30倍。
其中，步骤(2)中，常压正相柱的型号优选如下：直径为2～3cm、长度为40～50cm。
其中，步骤(2)中，所述的检测较佳地采用薄层层析法(TLC法)进行检测。
其中，步骤(3)中，常压正相柱的填料较佳地为200～300目硅胶，所述的硅胶的用量为所述的粗品重量的40～60倍。
其中，步骤(3)中，常压正相柱的型号优选如下：直径为0.7～0.8cm、长度为20～30cm。
其中，步骤(3)中，所述的检测较佳地采用薄层层析法(TLC法)进行检测。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明的提取方法不需要复杂的设备，且所使用的试剂和材料安全易得。
(2)本发明的提取方法能最大程度的提取出瓜蒌皮中的γ-氨基丁酸，节约原料。
(3)本发明所得γ-氨基丁酸纯度较高，可直接用于瓜蒌皮药材的质量控制。
附图说明
图1为瓜蒌皮提取液中氨基酸检测情况图，其中Pro指脯氨酸，Asp指天冬氨酸，Thr指苏氨酸，Ser指丝氨酸，AspNH2指天冬酰胺，Glu指谷氨酸，a-AAA指a-氨基己二酸，Gly指谷氨酸，Ala指丙氨酸，Cit指瓜氨酸，a-ABA指a-氨基丁酸，Val指缬氨酸，Cys指半胱氨酸，Met指甲硫氨酸，Cysthi指胱硫醚，Ile指异亮氨酸，Leu指亮氨酸，Tyr指酪氨酸，Phe指苯丙氨酸，b-Ala指b-丙氨酸，GABA指γ-氨基丁酸，Trp指色氨酸，EOHNH2指乙醇胺，NH3指氨，Orn指鸟氨酸，Lys指赖氨酸，His指组氨酸，3Mehis指3-甲基组氨酸，Arg指精氨酸。
图2为分离得到的γ-氨基丁酸色谱图。
图3为分离得到的γ-氨基丁酸H1NMR谱图。
图4为分离得到的γ-氨基丁酸C13NMR谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：制备瓜蒌皮提取液
将瓜蒌皮5000g切成小块后，加入15L去离子水，常压下回流提取3次，每次2小时，合并提取液。减压浓缩所得提取液至5000g，向其中加入95％乙醇至提取液含醇量为75％，25℃静置24小时，过滤，将上清液浓缩至5L，回收乙醇。浓缩物即为瓜蒌皮提取液。
图1为瓜蒌皮提取液中氨基酸检测情况图，从图中可以看出，瓜蒌皮提取液富含多种氨基酸，且γ-氨基丁酸(简称GABA)含量也较高。
实施例2：阳离子柱分离
取实施例1所得瓜蒌皮提取液1L，上732型阳离子交换树脂柱(其树脂取购自上海树脂厂的强酸性阳离子树脂，装入直径20cm长度1.5m的色谱柱，用5L蒸馏水预洗)，流速为250mL/min。吸附有效成分，弃去流出液，上样结束后用5L去离子水洗涤，然后用1.5mol/L的氨水作为洗脱剂洗脱，富集氨基酸类化合物。将洗脱液浓缩干燥得固体3.0g。
实施例3：阳离子柱分离
取实施例1所得瓜蒌皮提取液1L，上732型阳离子交换树脂柱(其树脂取购自上海树脂厂的强酸性阳离子树脂，装入直径20cm长度1.5m的色谱柱，用5L蒸馏水预洗)，流速为250mL/min。吸附有效成分，弃去流出液，上样结束后用适量去离子水洗涤，然后用2mol/L的氨水作为洗脱剂洗脱，富集氨基酸类化合物。将洗脱液浓缩干燥得固体3.4g。
实施例4：正相柱分离
取实施例3所得浓缩干燥品1g用常压正相柱进行进一步纯化，色谱填料选用青岛海洋的200-300目硅胶，重量为30g，色谱柱直径2cm长度40cm，流动相选用国药试剂的分析纯甲醇和二氯甲烷。
上样后，先用二氯甲烷：甲醇＝1:1的流动相2L除去实施例3浓缩干燥品中的黄酮苷类和核苷类等相对极性较小成分，待黄酮苷类条带完全洗脱下来后换用二氯甲烷：甲醇＝1：3进行洗脱，分段接收4个柱体积的洗脱液，接下来的洗脱液用TLC法检测纯度，将只有一个γ-氨基丁酸斑点的洗脱液合并，浓缩即得γ-氨基丁酸粗品40mg。
将所得粗品用常压正相柱进行进一步纯化，色谱填料选用青岛海洋的200-300目硅胶2g，色谱柱直径0.8cm长度20cm，流动相选用国药试剂的分析纯甲醇和二氯甲烷。上样后先用二氯甲烷：甲醇＝1:1除去未除净的黄酮苷类和核苷类等相对极性较小成分，待黄酮苷类条带完全洗脱下来后换用二氯甲烷：甲醇＝1：3进行洗脱，分段接收5个柱体积的洗脱液，接下来的洗脱液用TLC法检测纯度，将只有一个γ-氨基丁酸斑点的洗脱液合并，浓缩得γ-氨基丁酸纯品30mg。
图2为分离得到的γ-氨基丁酸纯品色谱图，从图中可以看出，γ-氨基丁酸的纯度较高，HPLC纯度达99.8％，基本无杂质。
图3为分离得到的γ-氨基丁酸的H1NMR谱图，图4为分离得到的γ-氨基丁酸的C13NMR谱图，从图谱中可以确认分离得到的产品是γ-氨基丁酸。
实施例5：正相柱分离
取实施例3所得浓缩干燥品2g用常压正相柱进行进一步纯化，色谱填料选用青岛海洋的200-300目硅胶，重量为60g，色谱柱直径3cm长度50cm流动相选用国药试剂的分析纯甲醇和二氯甲烷。
上样后，先用二氯甲烷：甲醇＝1:1的流动相3.5L除去实施例3浓缩干燥品中的黄酮苷类和核苷类等相对极性较小成分，待黄酮苷类条带完全洗脱下来后换用二氯甲烷：甲醇＝1：2.5进行洗脱，分段接收5个柱体积的洗脱液，接下来的洗脱液用TLC法检测纯度，将只有一个γ-氨基丁酸斑点的洗脱液合并，浓缩既得γ-氨基丁酸粗品78mg。
将所得粗品用常压正相柱进行进一步纯化，色谱填料选用青岛海洋的200-300目硅胶，重量为3.8g，色谱柱直径0.8cm长度20cm流动相选用国药试剂的分析纯甲醇和二氯甲烷。上样后先用二氯甲烷：甲醇＝1:1除去未除净的黄酮苷类和核苷类等相对极性较小成分，待黄酮苷类条带完全洗脱下来后换用二氯甲烷：甲醇＝1：2.5进行洗脱，分段接收5个柱体积的洗脱液，接下来的洗脱液用TLC法检测纯度，将只有一个γ-氨基丁酸斑点的洗脱液合并，浓缩得γ-氨基丁酸纯品50mg。
该实施例得到的γ-氨基丁酸纯品的检测数据同实施例4。

Claims (9)

1.一种γ-氨基丁酸的提取方法，其包括下述步骤：
(1)将瓜蒌皮粗提取液上阳离子交换树脂柱，用水洗涤，然后用氨水作为洗脱剂进行洗脱，将洗脱液浓缩干燥得到固体；
(2)将步骤(1)中的固体用常压正相柱纯化，先用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:(2～3)作为洗脱剂进行洗脱，分段接收3～5个柱体积的洗脱液，将检测只有一个斑点的洗脱液合并，浓缩得到粗品；
(3)将步骤(2)中的粗品用常压正相柱纯化，先用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:(2～3)作为洗脱剂进行洗脱，分段接收3～5个柱体积的洗脱液，将检测只有一个斑点的洗脱液合并，浓缩即得到γ-氨基丁酸纯品；
步骤(1)中所述的瓜蒌皮粗提取液通过下述步骤制得：将瓜蒌皮与水混合后，常压下回流提取3～4次，合并提取液；减压浓缩，加入质量百分比浓度为90％～95％的乙醇，加至乙醇质量百分比为70％～75％，静置，过滤，取上清液即得瓜蒌皮粗提取液；
步骤(2)中，常压正相柱的型号如下：直径为2～3cm、长度为40～50cm；
步骤(3)中，常压正相柱的型号如下：直径为0.7～0.8cm、长度为20～30cm。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的减压浓缩为减压浓缩至瓜蒌皮的原料重量的0.75～1倍。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的阳离子交换树脂为购自于上海树脂厂的732型强酸性阳离子交换树脂；
和/或，步骤(1)中所述的水为去离子水。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的洗脱的流速为200～250mL/min；
和/或，步骤(1)中所述的氨水的浓度为1～2mol/L。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)与步骤(3)中，所述的二氯甲烷：甲醇＝1:1作为洗脱剂的用量以检测黄酮苷类条带完全洗脱下来为止。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，常压正相柱的填料为200～300目硅胶，所述的硅胶的用量为所述的固体重量的20～30倍。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的检测采用薄层层析法进行检测。
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，常压正相柱的填料为200～300目硅胶，所述的硅胶的用量为所述的粗品重量的40～60倍。
9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的检测采用薄层层析法进行检测。
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