CN102993267A - 一种灵芝活性肽的制取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝活性肽的制取方法，以灵芝菌丝体粉为原料，经水提取、超滤分离、活性炭脱色、Cu2+-SephadexG-25柱配位色谱分离、螯合树脂脱铜、大孔树脂脱盐、冷冻干燥，获得灵芝活性肽。本发明灵芝活性肽产品的肽含量达92％以上，具有保肝、抗氧化、抗疲劳、抑制肿瘤等功效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种灵芝活性肽的制取方法，尤其是以灵芝菌丝体粉为原料，采用现代生物技术制取灵芝活性肽的方法。
背景技术
灵芝属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科灵芝属植物。灵芝又称为瑞草，俗称“仙草”，日本人称之为万年草。灵芝最早收载于东汉的《神农本草经》中，被列为上药。所谓上药，指在中药或者复方里面可作为君药，即主药，认为“主养命，以应天”。而且毒性非常低，“多服，久服不伤人”。“益气、轻身”，即要想身体好、抵抗力强、长寿，应该用上药。灵芝有效成份非常丰富，其中主要有效成份有多糖、三萜类(灵芝酸)、蛋白质类、腺苷类、生物碱及各种微量元素等。现代药理学和临床医学研究表明，灵芝具有多种生理活性和极高的药用价值。
多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，多肽和蛋白质都是由氨基酸构成，从氨基酸营养的角度来分析，两者是一样的；但是多肽的分子量比蛋白质小很多，而且有些具有蛋白质所没有的生理调节功能。作为基础营养物质，多肽比氨基酸更易吸收，生物利用率高。生物活性肽(Bioactivepeptides，BAP)是指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称，又称为功能肽。科学研究表明：BAP具有降低血压、延缓衰老、抗氧化、保肝、美体养颜、抗疲劳、改善睡眠、增强记忆、抑制肿瘤、增强免疫、促进人体对蛋白质及各种有益微量元素的吸收等多种功效。BAP的开发应用是当前生物工程领域的热门课题，广泛应用于医药、保健、食品、化妆品等行业，正在形成具有广阔前景的新产业。20世纪80年代，国际上如日本、韩国、美国和欧洲等国家和地区都已经有了专业的多肽经营企业进行产业化运作。
目前国内外关于灵芝多糖及灵芝三萜类化合物的提取纯化与药理作用研究透彻，然而对灵芝肽(GLP)的研究却鲜有涉及。何云庆等从灵芝子实体热水提取物中分离出两种肽多糖，肽含量分别占26.3％和12.3％，分子量分别为12800Da和14100Da。何国亮等用硫酸-苯酚法和氨基酸分析仪测定了灵芝肽多糖，并计算了肽糖比。1979年湖南医药工业研究所201组首先发现灵芝肽具有提高人体耐缺氧能力的活性。他们以氨水作洗脱液，采用732[H]型阳离子树脂分离灵芝发酵液的醇、水提取物，得到四个肽，两个酸性肽(由11种氨基酸组成)、一个碱性四肽和一个中性肽(9种氨基酸组成)，其中中性肽的活性最强。1993年，董颖等先采用732[H]型阳离子树脂，以3％氨水为洗脱液，从灵芝子实体的热水、乙醇提取物中分离得到粗肽，再通过DA-201大孔吸附树脂柱，以0.01mol/L醋酸洗脱，除去粗肽中的色素。洗脱液经浓缩后，上Sephadex G-15柱，以水为洗脱液将多肽与氨基酸和盐分开；再采用DEAE-Cellulose柱进一步分离，用NH4HCO3阶段梯度洗脱得到5个肽，其中酸性肽和碱性肽各两种，中性肽一种。研究表明，酸性肽及碱性肽均能有效清除氧自由基，从而保护红细胞膜免遭氧化，延缓衰老。研究表明灵芝发酵液中的肽类具有较好的抑制羟基自由基，而含有灵芝肽的提取物(分子量小于1万部分)所表现出的抗S-180肉瘤的活性可能也与此有关。
活性肽类化合物具有较强的生理活性，是中草药治疗癌症、心脑血管疾病等疑难病症的有效成分之一，因此对灵芝活性肽的深入研究具有重要的意义。本发明提供了一种灵芝活性肽的分离纯化方法，为充分发挥灵芝活性肽的功效提供依据。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术缺陷，提供一种灵芝活性肽的制取方法，为开发灵芝保健品和灵芝药物提供依据。
本发明的技术方案是：以灵芝菌丝体粉为原料，经水提取、超滤分离、活性炭脱色、Cu2+-SephadexG-25柱配位色谱分离、螯合层析柱脱铜、大孔树脂脱盐、冷冻干燥，获得灵芝活性肽，包括如下步骤：
1.灵芝菌丝体粉的水提取
用蒸馏水于室温下，按1∶3-5(W∶V)的料液比浸提灵芝菌丝体粉2-3次，每次4-6h。
2.超滤分离
采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜对灵芝菌丝体粉水提液进行超滤分离，得到含氨基酸、肽类及小分子糖等低分子化合物的超滤液。
3.活性炭脱色
超滤液中加入1-3％的活性炭充分吸附，过滤，5000rpm离心10-20min。
4.葡聚糖凝胶配位色谱分离
取一定量的脱色超滤液上Cu2+-SephadexG-25柱(φ1.6×70cm)，用硼砂缓冲液(pH值11，50mmol/L)以0.2-0.3mL/min的流速洗脱，收集Cu-肽螯合物洗脱液。
本发明采用Cu2+-SephadexG-25柱可有效地将灵芝活性肽分离，其分离原理是铜可与葡聚糖、氨基酸、肽形成稳定性不同的螯合物，其中Cu-肽螯合物的稳定性最强，Cu-氨基酸螯合物与Cu-葡聚糖凝胶螯合物的稳定性相当，当含有氨基酸和肽的溶液流经以Cu-葡聚糖凝胶为固定相的层析柱时，形成稳定性强的螯合物的肽优先夺取Cu-葡聚糖凝胶螯合物中的Cu2+，以Cu-肽螯合物的形式流出，而糖类化合物不能与铜形成螯合物，故肽也能与糖类化合物分离，得到的肽的纯度较高，此方法的重现性很好，上样体积大，是一种较理想的分离灵芝活性肽的方法。
5.螯合树脂脱铜
调节Cu-肽螯合物洗脱液的pH值为5-7，上D401螯合树脂柱，用0.1-0.5mol/LHCl洗脱去Cu2+。
螯合树脂是一类能与金属离子形成多配位络合物的交联功能高分子材料。D401螯合树脂为氨基羧酸类树脂，其带有的亚氨基二乙酸基可与二价金属离子形成稳定的螯合结构，具有与金属结合能力强、吸附容量高、操作简单等优点。本发明采用D401螯合树脂，可简便、高效地去除Cu-肽螯合物中的Cu2+，去除率可达90％以上。
6.大孔树脂脱盐
采用大孔吸附树脂DA201-C吸附脱盐，上样流速为1.5-2.0mL/min，pH值为5.5，上样浓度为1.5-2.5mg/mL，2-3倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
经配位色谱分离得到的灵芝活性肽，由于采用pH值11.0的硼酸盐作为洗脱液，因此要对灵芝活性肽的硼砂洗脱液进行脱盐处理，本发明采用大孔树脂DA201-C脱盐，处理量小于或等于树脂用量的3/4时，可以达到100％的吸附率而不发生穿透，采用70％乙醇洗脱，灵芝活性肽的洗脱率达到98％以上，脱盐率达到95％以上。
7.冷冻干燥
脱盐后的洗脱液经冷冻干燥，得到灵芝活性肽(GLP)，肽含量达92％以上。
目前，国内外研究灵芝的现状是对灵芝多糖、三萜类化合物的研究较为深入，而关于灵芝小分子肽的研究报道比较少。本发明工艺简单，灵芝活性肽产品的肽含量达92％以上，具有保肝、抗氧化、抗疲劳、抑制肿瘤等功效，可作为生产灵芝保健品和灵芝药物的组分。
附图说明
附图1是以灵芝菌丝体粉为原料，经水提取、超滤分离、活性炭脱色、Cu2+-SephadexG-25柱配位色谱分离、螯合层析柱脱铜、大孔树脂脱盐、冷冻干燥，获得灵芝活性肽的工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1.
1.灵芝菌丝体粉的水提取
用蒸馏水于室温下，按1∶3(W∶V)的料液比浸提灵芝菌丝体粉2次，每次4h。
2.超滤分离
采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜对灵芝菌丝体粉水提液进行超滤分离，得到含氨基酸、肽类及小分子糖等低分子化合物的超滤液。
3.活性炭脱色
超滤液中加入1％的活性炭充分吸附，过滤，5000rpm离心15min。
4.葡聚糖凝胶配位色谱分离
取一定量的脱色超滤液上Cu2+-SephadexG-25柱(φ1.6×70cm)，用硼砂缓冲液(pH值11，50mmol/L)以0.2mL/min的流速洗脱，收集Cu-肽螯合物洗脱液。
5.螯合树脂脱铜
调节Cu-肽螯合物洗脱液的pH值为5，上D401螯合树脂柱，用0.15mol/L HCl洗脱去Cu2+。
6.大孔树脂脱盐
采用大孔吸附树脂DA201-C吸附脱盐，上样流速为1.5mL/min，pH值为5.5，上样浓度为1.5mg/mL，2倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
7.冷冻干燥
大孔吸附树脂洗脱液经冷冻干燥，得到灵芝活性肽(GLP)，肽含量达92.5％。
实施例2.
1.灵芝菌丝体粉的水提取
用蒸馏水于室温下，按1∶3(W∶V)的料液比浸提灵芝菌丝体粉3次，每次4h。
2.超滤分离
采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜对灵芝菌丝体粉水提液进行超滤分离，得到含氨基酸、肽类及小分子糖等低分子化合物的超滤液。
3.活性炭脱色
超滤液中加入1％的活性炭充分吸附，过滤，5000rpm离心12min。
4.葡聚糖凝胶配位色谱分离
取一定量的脱色超滤液上Cu2+-SephadexG-25柱(φ1.6×70cm)，用硼砂缓冲液(pH值11，50mmol/L)以0.2mL/min的流速洗脱，收集Cu-肽螯合物洗脱液。
5.螯合树脂脱铜
调节Cu-肽螯合物洗脱液的pH值为5.5，上D401螯合树脂柱，用0.15mol/LHCl洗脱去Cu2+。
6.大孔树脂脱盐
采用大孔吸附树脂DA201-C吸附脱盐，上样流速为1.5mL/min，pH值为5.5，上样浓度为1.8mg/mL，2倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
7.冷冻干燥
大孔吸附树脂洗脱液经冷冻干燥，得到灵芝活性肽(GLP)，肽含量达92.9％。
实施例3.
1.灵芝菌丝体粉的水提取
用蒸馏水于室温下，按1∶4(W∶V)的料液比浸提灵芝菌丝体粉3次，每次5h。
2.超滤分离
采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜对灵芝菌丝体粉水提液进行超滤分离，得到含氨基酸、肽类及小分子糖等低分子化合物的超滤液。
3.活性炭脱色
超滤液中加入1.5％的活性炭充分吸附，过滤，5000rpm离心15min。
4.葡聚糖凝胶配位色谱分离
取一定量的脱色超滤液上Cu2+-SephadexG-25柱(φ1.6×70cm)，用硼砂缓冲液(pH值11，50mmol/L)以0.25mL/min的流速洗脱，收集Cu-肽螯合物洗脱液。
5.螯合树脂脱铜
调节Cu-肽螯合物洗脱液的pH值为6，上D401螯合树脂柱，用0.25mol/L HCl洗脱去Cu2+。
6.大孔树脂脱盐
采用大孔吸附树脂DA201-C吸附脱盐，上样流速为1.5mL/min，pH值为5.5，上样浓度为2.0mg/mL，3倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
7.冷冻干燥
大孔吸附树脂洗脱液经冷冻干燥，得到灵芝活性肽(GLP)，肽含量达93.1％。
实施例4.
1.灵芝菌丝体粉的水提取
用蒸馏水于室温下，按1∶5(W∶V)的料液比浸提灵芝菌丝体粉3次，每次4h。
2.超滤分离
采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜对灵芝菌丝体粉水提液进行超滤分离，得到含氨基酸、肽类及小分子糖等低分子化合物的超滤液。
3.活性炭脱色
超滤液中加入2％的活性炭充分吸附，过滤，5000rpm离心15min。
4.葡聚糖凝胶配位色谱分离
取一定量的脱色超滤液上Cu2+-SephadexG-25柱(φ1.6×70cm)，用硼砂缓冲液(pH值11，50mmol/L)以0.3mL/min的流速洗脱，收集Cu-肽螯合物洗脱液。
5.螯合树脂脱铜
调节Cu-肽螯合物洗脱液的pH值为6，上D401螯合树脂柱，用0.3mol/L HCl洗脱去Cu2+。
6.大孔树脂脱盐
采用大孔吸附树脂DA201-C吸附脱盐，上样流速为2.0mL/min，pH值为5.5，上样浓度为2.2mg/mL，3倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
7.冷冻干燥
大孔吸附树脂洗脱液经冷冻干燥，得到灵芝活性肽(GLP)，肽含量达92.8％。
实施例5.
1.灵芝菌丝体粉的水提取
用蒸馏水于室温下，按1∶4(W∶V)的料液比浸提灵芝菌丝体粉3次，每次6h。
2.超滤分离
采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜对灵芝菌丝体粉水提液进行超滤分离，得到含氨基酸、肽类及小分子糖等低分子化合物的超滤液。
3.活性炭脱色
超滤液中加入3％的活性炭充分吸附，过滤，5000rpm离心18min。
4.葡聚糖凝胶配位色谱分离
取一定量的脱色超滤液上Cu2+-SephadexG-25柱(φ1.6×70cm)，用硼砂缓冲液(pH值11，50mmol/L)以0.3mL/min的流速洗脱，收集Cu-肽螯合物洗脱液。
5.螯合树脂脱铜
调节Cu-肽螯合物洗脱液的pH值为7，上D401螯合树脂柱，用0.3mol/L HCl洗脱去Cu2+。
6.大孔树脂脱盐
采用大孔吸附树脂DA201-C吸附脱盐，上样流速为2.0mL/min，pH值为5.5，上样浓度为1.5mg/mL，3倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
7.冷冻干燥
大孔吸附树脂洗脱液经冷冻干燥，得到灵芝活性肽(GLP)，肽含量达93.2％。
Claims (8)
1.一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于：以灵芝菌丝体粉为原料，经水提取、超滤分离、活性炭脱色、Cu2+-SephadexG-25柱配位色谱分离、螯合树脂脱铜、大孔树脂脱盐、冷冻干燥等工艺处理后，获得灵芝活性肽。
2.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的水提取步骤为：灵芝菌丝体粉与蒸馏水的料液比为1∶3-5(W∶V)，室温下浸提2-3次，每次4-6h。
3.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的超滤分离技术为：采用截留分子量为10000Da的中空纤维膜。
4.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的活性碳脱色工艺为：活性炭用量为1-3％，过滤，5000rpm离心10-20min。
5.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的葡聚糖凝胶配位色谱法分离工艺为：采用Cu2+-SephadexG-25柱，洗脱液采用pH值11，浓度50mmol/L的硼砂缓冲液，洗脱流速0.2-0.3mL/min。
6.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的螯合树脂脱铜工艺为：Cu-肽螯合物洗脱液的pH值调至5-7，采用D401螯合树脂，树脂用量与Cu-肽螯合物上样量为1∶1，0.1-0.5mol/L HCl洗脱去Cu2+。
7.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的大孔树脂脱盐工艺为：采用DA201-C大孔吸附树脂，上样流速为1.5-2.0mL/min，pH值为5.5，上样浓度为1.5-2.5mg/mL，2-3倍柱床体积的70％乙醇洗脱。
8.根据权利要求1所述一种灵芝活性肽的制取方法，其特征在于，所述的灵芝活性肽中肽含量达到92％以上。
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