CN107915772B

CN107915772B - 一种新的甘薯糖蛋白及包含该甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物

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Publication number: CN107915772B
Application number: CN201610876571.0A
Authority: CN
Inventors: 叶小利; 李学刚; 李滟临; 李亚松
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2016-10-08
Filing date: 2016-10-08
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2036-10-08
Also published as: CN107915772A

Abstract

本发明属于医药或食品领域，涉及一种新的甘薯糖蛋白及包含该甘薯糖蛋白的甘薯提取物，以及它们在制备抗肿瘤药物或保健品中的应用。本发明提供的甘薯糖蛋白为单组分物质，生物质谱分子量为7180‑9187，分子中糖的相对含量为73.4％，蛋白质的相对含量为26.6％，对肿瘤细胞的生长抑制作用显著。

Description

一种新的甘薯糖蛋白及包含该甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物

技术领域

本发明属于医药或食品领域，涉及一种新的甘薯糖蛋白及包含该甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物，以及它们在制备抗肿瘤药物或保健品中的应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的恶性疾病，在我国，癌症已成为疾病死因之首，且发病率和死亡率还在攀升，2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例，相当于平均每天新发12000例癌症，和281.4万例死亡病例，相当于平均每天7500人死于癌症。寻找开发疗效确切、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是药物创新研发的热点和难点。传统中药因其独特的优势，从中药中提取安全有效部位用于预防和/或治疗癌症一直是肿瘤化疗研究的热点。

甘薯是薯蓣科薯蓣属缠绕草质藤本，又称红薯、甜署、白薯、番薯、地瓜等，是我国的粮食作物之一，其种植面积及产量均居世界首位。据《本草纲目》记载，甘薯“味甘、平、无毒。主治补虚乏、益气力、健脾胃、强肾阴。功同薯蓣”。现有的营养学研究结果表明，甘薯中含有丰富多样的粘液蛋白，也就是糖蛋白，是蛋白与糖以共价键形式连接的一类重要活性成分，对人体有特殊的保护作用。但甘薯中糖蛋白种类繁多，含量极低，分离纯化困难，大部分随甘薯淀粉母液(俗称黄浆或淀粉废水)一并流失，无法得到有效利用。目前研究甘薯淀粉母液中糖蛋白的文献虽然不少，但基本限于对其功效的研究，对糖蛋白的分离提取、纯化、组分等方面的研究报道并不多，分离提取工艺也大都是将甘薯的水提液或黄浆通过简单地加入硫酸铵或乙醇沉淀，直接得到一些含有蛋白、多糖、黏蛋白等多种活性成分的混合物，或者进一步DEAE纤维柱层析、Sephadex柱层析或亲和色谱柱层析得到少数几个纯的糖蛋白单组分，如西南大学阚建全团队从北京2号甘薯中分离纯化得到4个甘薯糖蛋白(SPG-l、SPG-2、SPG-3、SPG-4)，用Sepharose G-100柱层析测定其分子量分别为499700、283600、106800、82500，分子中糖含量分别为97.32％、92.54％、76.65％、99.14％(阚建全，甘薯糖蛋白的糖链结构与保健功能研究，西南大学博士学位论文，2003)；程坷伟将甘薯淀粉生产的废水经过两次离心和过滤后，通过无机陶瓷膜超滤进行初级浓缩，然后再经过真空浓缩，加入乙醇得到沉淀甘薯粗糖蛋白，粗糖蛋白经过硫酸铵沉淀，离子交换，凝胶过滤，亲和层析，得到一种糖蛋白，其分子量为32359，其中蛋白占91.60％，糖占6.43％。到目前为止，甘薯糖蛋白的提取工艺均需要大量乙醇沉淀和反复柱层析，工艺复杂，成本极高，工业化生产困难，利用度不高。

因此，开发工艺简单、成本低廉、能够工业化生产的糖蛋白提取纯化工艺及纯化制备新的甘薯糖蛋白单组分物质，不仅具有重要的应用前景和经济价值，而且对甘薯糖蛋白的深入研究奠定了基础。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的甘薯糖蛋白，该糖蛋白的电泳分析结果表明，其电泳为一条带，是单组分物质。生物质谱显示其分子量为7180-9187，分子中糖的相对含量为73.4％，蛋白质的相对含量为26.6％。

本发明的第二个目的是提供本发明的甘薯糖蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的是提供含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物。

本发明的第四个目的是提供含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物的制备方法。

本发明的第五个目的是提供本发明甘薯糖蛋白或含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物的组合物。

本发明的第六个目的是提供本发明甘薯糖蛋白、含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物或本发明甘薯糖蛋白或含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物的组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的第七个目的是提供本发明甘薯糖蛋白、含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物或本发明甘薯糖蛋白或含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物的组合物在制备功能性食品、饮料中的应用。

上述发明目的，通过以下技术方案得以实现。

一种甘薯糖蛋白，生物质谱显示分子量为7180-9187，分子中糖的相对含量为73.4％，蛋白质的相对含量为26.6％。

根据本发明，所述的甘薯糖蛋白，其中单糖的相对含量为甘露糖1.18％、鼠李糖8.22％、葡萄糖醛酸8.62％、葡萄糖1.76％、半乳糖54.41％、阿拉伯糖25.79％，氨基酸的相对含量为天门冬氨酸11.30％、苏氨酸7.56％、丝氨酸10.01％、谷氨酸11.64％、甘氨酸5.62％、丙氨酸11.85％、缬氨酸6.01％、蛋氨酸0.13％、异亮氨酸4.77％、亮氨酸5.78％、酪氨酸1.86％、苯丙氨酸3.77％、赖氨酸8.19％、组氨酸1.76％、精氨酸2.48％、脯氨酸6.47％。

本发明的甘薯糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：一定温度下，向甘薯淀粉母液中加入沉淀剂，离心或过滤，除去沉淀，得到澄清滤液；

步骤2：将步骤1获得的澄清滤液通过树脂柱层析，得到甘薯糖蛋白粗品；

步骤3：将步骤2获得的甘薯糖蛋白粗品进行半透膜超滤浓缩至粗品原体积的5％-20％，补加蒸馏水至原体积，重复超滤浓缩5次以上，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白。

根据本发明，其中步骤1所述的温度为30-100℃。

在一些优选的实施方案中，其中步骤1所述的温度为60-90℃。

根据本发明，其中步骤1所述的沉淀剂选自二价或三价的金属盐、有机酸、葡萄糖酸内酯、海藻酸钠、黄原胶和卡拉胶。

在一些优选的实施方案中，步骤1所述的所述沉淀剂选自钙盐、镁盐、铝盐、醋酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸内酯、海藻酸钠、黄原胶和卡拉胶。

在进一步优选的实施方案中，步骤1所述的所述沉淀剂选自硫酸钙、硫酸镁、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和葡萄糖酸内酯。

根据本发明，按重量计，其中步骤1所述的沉淀剂加入量为甘薯淀粉母液重量的0.01％-5％(重量/重量)。

在一些优选的实施方案中，按重量计，步骤1所述沉淀剂的加入量为甘薯淀粉母液重量的0.05％-1％(重量/重量)。

根据本发明，其中步骤2所述的树脂选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、离子纤维交换素、大孔吸附树脂和聚酰胺树脂。

根据本发明，其中步骤2所述的柱层析条件为：树脂与淀粉母液按重量比1:1-1000的比例上柱，按照树脂体积的0.01-5％(V/V)/min的速度上柱，然后用0.5-5倍柱体积水洗脱树脂，再用1-5倍柱体积溶剂洗脱树脂，其中，所述的溶剂选自酸水溶液、碱水溶液、盐水溶液。

在一个优选的实施方案中，步骤2所述的柱层析条件中树脂与淀粉母液按重量比1:5-100的比例上柱。

在一个优选的实施方案中，步骤2所述的柱层析条件中上样速度为树脂体积的0.1-3％(V/V)/min。

在一个优选的实施方案中，步骤2所述的所述的柱层析条件中水洗脱液洗脱体积为1-3倍树脂体积。

在一个优选的实施方案中，步骤2所述的所述的柱层析条件溶剂洗脱液洗脱体积为2-3倍树脂体积。

在一个优选的实施方案中，步骤2所述的柱层析条件中所述的溶剂选自0.01-2mol/L的盐酸、硫酸或醋酸，0.01-2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，0.01-2mol/L的碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化铵、醋酸钠和醋酸铵水溶液。

在一个更为优选的实施方案中，步骤2所述的柱层析条件中所述的溶剂选自0.1-1mol/L的盐酸或醋酸溶液，0.1-1mol/L的氢氧化钠水溶液，0.05-1mol/L的碳酸氢钠、氯化钠和氯化铵水溶液。

根据本发明，步骤3所述的半透膜的截留分子量为1000-3000。

根据本发明，步骤3所述的超滤浓缩操作，每次超滤浓缩至溶液原体积的10％-20％。

根据本发明，步骤3所述的超滤浓缩步骤重复5-10次。

本发明还提供一种含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物，按重量计，所述甘薯糖蛋白的含量占提取物总量的40％以上(重量/重量)。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物，按重量计，所述甘薯糖蛋白的含量占提取物总量的的50％以上(重量/重量)。

在一些更为优选的实施方案中，本发明提供的含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物，按重量计，所述甘薯糖蛋白的含量占提取物总量的的60％以上(重量/重量)。

本发明提供含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤A：一定温度下，向甘薯淀粉母液中加入沉淀剂，离心或过滤，除去沉淀，得到澄清滤液；

步骤B：将步骤A获得的澄清滤液通过树脂柱层析，得到甘薯糖蛋白粗品；

步骤C：将步骤B获得的甘薯糖蛋白粗品进行半透膜超滤浓缩至粗品原体积的5％-20％，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。

根据本发明，其中步骤A所述的温度为30-100℃。

在一些优选的实施方案中，其中步骤A所述的温度为60-90℃。

根据本发明，其中步骤A所述的沉淀剂选自二价或三价的金属盐、有机酸、葡萄糖酸内酯、海藻酸钠、黄原胶和卡拉胶。

在一些优选的实施方案中，其中步骤A所述的沉淀剂选自钙盐、镁盐、铝盐、醋酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸内酯、海藻酸钠、黄原胶和卡拉胶。

在进一步优选的实施方案中，其中步骤A所述的沉淀剂选自硫酸钙、硫酸镁、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和葡萄糖酸内酯。

根据本发明，按重量计，其中步骤A所述的沉淀剂加入量为甘薯淀粉母液重量的0.01％-5％(重量/重量)。

在一些优选的实施方案中，按重量计，其中步骤A所述沉淀剂的加入量为甘薯淀粉母液重量的0.05％-1％(重量/重量)。

根据本发明，其中步骤B所述的树脂选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、离子纤维交换素、大孔吸附树脂和聚酰胺树脂。

根据本发明，其中步骤B所述的柱层析条件为：树脂与淀粉母液按重量比1:1-1000的比例上柱，上样速度为树脂体积的0.01-5％(V/V)/min，先用0.5-5倍柱体积水洗脱树脂，再用1-5倍柱体积溶剂洗脱树脂，其中，所述的溶剂选自酸水溶液、碱水溶液、盐水溶液。

在一个优选的实施方案中，步骤B所述的柱层析条件中树脂与淀粉母液按重量比10:1-100的比例上柱。

在一个优选的实施方案中，步骤B所述的柱层析条件中上样速度为树脂体积的0.1-3％(V/V)/min。

在一个优选的实施方案中，步骤B所述的柱层析条件中水洗脱液洗脱体积为1-3倍树脂体积。

在一个优选的实施方案中，步骤B所述的柱层析条件溶剂洗脱液洗脱体积为2-3倍树脂体积。

在一个优选的实施方案中，步骤B所述的柱层析条件中所述的溶剂选自0.01-2mol/L的盐酸、硫酸或醋酸，0.01-2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，0.01-2mol/L的碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化铵、醋酸钠或醋酸铵水溶液。

在一个更为优选的实施方案中，步骤B所述的柱层析条件中所述的溶剂选自0.1-1mol/L的盐酸或醋酸溶液，0.1-1mol/L的氢氧化钠水溶液，0.05-1mol/L的碳酸氢钠、氯化钠或氯化铵水溶液。

根据本发明，步骤C所述的超滤浓缩操作，每次超滤浓缩至醋品原体积的10％-20％。

在一些优选的实施方案中，步骤C所述的超滤浓缩步骤可以重复0-4次。

在一些更为优选的实施方案中，步骤C所述的超滤浓缩步骤可以重复2-3次。

本发明的甘薯糖蛋白、含本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物可以与药学上可接受的载体一起制成药物制剂，所述剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、粉针剂、注射剂、滴丸、缓释剂、控释剂、纳米制剂、包合物等。所述的药学上可接受的载体包括填充剂、崩解剂、润湿剂、抗氧剂、螯合剂、表面活性剂、矫味剂、螯合剂、pH调节剂、色素等。本发明的甘薯糖蛋白、含本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物与药学上可接受的载体制成药物制剂可以通过口服、喷雾、舌下含服、静脉注射、静脉输注、肌内注射、腹腔内给药、皮内给药等途径给药。

本发明的甘薯糖蛋白、含本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物可以单独用于预防和/或治疗肿瘤，也可以与其它抗肿瘤药物联合使用。

此外，本发明的甘薯糖蛋白、含本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物取自食材，对人体非常安全，可以用于功能性食品或饮料领域。本发明的甘薯糖蛋白或含本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物可以与食品添加剂制备成功能性食品或饮料，也可以与其它营养物质联合用于功能性食品或饮料的加工制备，发挥食疗功能。

本发明的甘薯糖蛋白和含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物对肿瘤细胞的生长抑制作用显著，甘薯糖蛋白提取物在50ppm浓度上，对肝癌细胞HepG2生长抑制率为50％、对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制率为70％、对结肠癌细胞HCT8生长抑制率为65％，含有本发明甘薯糖蛋白的甘薯提取物在50ppm浓度上，对肝癌细胞HepG2生长抑制率为41％、对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制率为52％、对结肠癌细胞HCT8生长抑制率为51％。

术语解释

本发明所述的甘薯淀粉母液是指除去了甘薯淀粉的母液，俗称黄浆或淀粉废水。可以是甘薯淀粉生产中产生的废液，也可以通过将甘薯与水一并粉碎，过筛得甘薯浆，然后除去淀粉，收集浆液的方法制备，如将甘薯与0-2倍水一并粉碎，过80目筛得甘薯浆，然后过滤除去淀粉，收集浆液的方法制备。

附图说明

图1是本发明甘薯糖蛋白的生物质谱。

图2是本发明甘薯糖蛋白的电泳图谱。

图3是本发明甘薯糖蛋白的多糖分析HPLC图谱。

图4是本发明甘薯糖蛋白的氨基酸分析图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步详细阐述，但本发明并不限于这些实施例。本文中使用的试剂和原料均可以通过商购或本领域常规方法制备得到。

实施例1甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

100℃下，向100L甘薯母液中加入重量为母液重量0.01％的硫酸钙，搅拌均匀，冷却到80℃，离心，收集上清液。上清液按照强酸性阳离子交换树脂(732)比溶液为1:1的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的0.01％/min(V/V)，上样完成后，利用5倍水洗涤树脂，然后，利用5倍0.01mol/L的盐酸溶液洗脱，收集盐酸溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为1000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的5％后，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为68％。

将糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作5次，获得甘薯糖蛋白。

实施例2甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

30℃下，向100L甘薯母液中加入重量为母液重量5％的氯化镁，搅拌均匀，离心，收集上清液。上清液按照弱酸性阳离子交换树脂(111)比溶液为1:1000的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的5％/min(V/V)，上样完成后，利用0.5倍水洗涤树脂，然后，利用1倍2mol/L的醋酸溶液洗脱，收集醋酸溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为3000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的20％后，加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作3次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为62％。

将甘薯糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作4次，获得甘薯糖蛋白。

实施例3甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

50℃下，向100L甘薯淀粉母液中加入重量为母液重量1％的硫酸铝，搅拌均匀，冷却到20℃，离心，收集上清液。上清液按照强碱性阳离子交换树脂(711)比溶液为1:100的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的0.1％/min(V/V)，上样完成后，利用1倍水洗涤树脂，然后，利用3倍0.5mol/L的碳酸氢钠溶液洗脱，收集碳酸氢钠溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为3000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的10％后，加水到原体积，重复超滤浓缩操作1次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为41％。

将甘薯糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作10次，获得甘薯糖蛋白。

实施例4甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

70℃下，向100L甘薯淀粉母液中加入重量为母液重量0.1％的醋酸，搅拌均匀，冷却到20℃，离心，收集上清液。上清液按照弱碱性阳离子交换树脂(330)比溶液为1:10的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的2％/min(V/V)，上样完成后，利用2倍水洗涤树脂，然后，利用2倍0.5mol/L的氢氧化钠溶液洗脱，收集氢氧化钠洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为2000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的10％后，加水到原体积，重复超滤浓缩操作2次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为68％。

将甘薯糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作8次，获得甘薯糖蛋白。

实施例5甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

90℃下，向100L甘薯淀粉母液中加入重量为母液重量0.05％的柠檬酸，搅拌均匀，冷却到30℃，离心，收集上清液。上清液按照离子纤维交换素(DEAE52)比溶液为1:50的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的0.2％/min(V/V)，上样完成后，利用5倍水洗涤树脂，然后，利用2倍0.2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集氯化钠溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为1000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的10％后，加水到原体积，重复超滤浓缩操作2次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为75％。

将甘薯糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作6次，获得甘薯糖蛋白。

实施例6甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

80℃下，向100L甘薯淀粉母液中加入重量为母液重量0.5％的苹果酸，搅拌均匀，冷却到40℃，离心，收集上清液。上清液按照大孔树脂树脂(D101)比溶液为1:20的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的1％/min(V/V)，上样完成后，利用4倍水洗涤树脂，然后，利用5倍0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集氯化钠溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为3000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的10％后，加水到原体积，重复超滤浓缩操作2次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为50％。

将甘薯糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作7次，获得甘薯糖蛋白。

实施例7甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

60℃下，向100L甘薯淀粉母液中加入重量为母液重量2％的葡萄糖酸内酯，搅拌均匀，冷却到25℃，离心，收集上清液。上清液按照聚酰胺比溶液为1:500的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的0.1％/min(V/V)，上样完成后，利用2倍水洗涤树脂，然后，利用2倍0.5mol/L的氯化铵溶液洗脱，收集氯化铵溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为2000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的10％后，加水到原体积，重复超滤浓缩操作2次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为63％。

实施例8甘薯糖蛋白和甘薯糖蛋白提取物的制备

60℃下，向100L新鲜的甘薯淀粉母液中加入重量为母液重量2％的海藻酸钠，搅拌均匀，冷却到25℃，离心，收集上清液。上清液按照弱碱性阳离子交换树脂(D301)比溶液为1:10的量(V/V)上柱，上样速度为树脂体积的1％/min(V/V)，上样完成后，利用1倍水洗涤树脂，然后，利用1倍0.1mol/L的氢氧化钠溶液洗脱，收集氢氧化钠溶液洗脱液得到甘薯糖蛋白粗品溶液，利用分子截留量为1000的半透膜透析浓缩，待体积减小到原体积的10％后，加水到原体积，重复超滤浓缩操作1次，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物。以牛血清为对照，分析蛋白含量，利用硫酸蒽酮法分析糖含量，得到糖蛋白含量为51％。将甘薯糖蛋白提取物继续加蒸馏水到原体积，重复超滤浓缩操作10次，获得甘薯糖蛋白。实施例9甘薯糖蛋白的鉴别和含量测定

以牛血清白蛋白为对照，利用280nm的吸收测定分子中蛋白质的含量；利用硫酸蒽酮法测定分子中糖的含量；利用生物质谱测定糖蛋白的分子量；利用电泳鉴别提取物的纯度；利用氨基酸分析仪分析甘薯糖蛋白分子中氨基酸组成；利用HPLC分析糖蛋白中糖的含量。

结果表明：电泳分析结果表明，该提取物电泳为一条带，为单组分物质，电泳分析图见图2；

本发明甘薯糖蛋白的分子量为7180-9187，生物质谱见图1；

分子中糖的相对含量为73.4％，蛋白质的相对含量为26.6％，其中单糖的相对含量为甘露糖1.18％、鼠李糖8.22％、葡萄糖醛酸8.62％、葡萄糖1.76％、半乳糖54.41％、阿拉伯糖25.79％，HPLC分析图谱见图3；氨基酸的相对含量为天门冬氨酸11.30％、苏氨酸7.56％、丝氨酸10.01％、谷氨酸11.64％、甘氨酸5.62％、丙氨酸11.85％、缬氨酸6.01％、蛋氨酸0.13％、异亮氨酸4.77％、亮氨酸5.78％、酪氨酸1.86％、苯丙氨酸3.77％、赖氨酸8.19％、组氨酸1.76％、精氨酸2.48％、脯氨酸6.47％，氨基酸分析图谱见图4。

实验例1本发明甘薯糖蛋白提取物的肿瘤细胞抑制活性

实验材料：HepG2肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、HCT8结肠癌细胞均购自第三军医大学，牛血清等其他生化试剂以及细胞培养材料购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

细胞的复苏和培养：将细胞冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，待其完全融化，迅速转移到超净工作台中，把溶液转入到灭菌后的10mL离心管中，加入7mL的RIPM-1640培养基(含10％FBS，1％青链霉素混合液)，于离心机中3000rmp离心5min，后弃掉上清，加入4mL RIPM-1640培养基(含10％FBS，1％青链霉素混合液)，吹打混匀后转到培养瓶中进行培养。培养条件为37℃，5％的CO₂。

细胞的给药：选择形态正常，长势良好的HepG2细胞、MCF-7细胞和HCT8细胞，待细胞长满到80％左右，用胰蛋白酶消化细胞，加入有血培养基，把细胞吹打下来，后转入到90mm培养皿，进行贴壁培养。培养24h后加入本发明实施例提取的甘薯糖蛋白提取物和甘薯糖蛋白，控制甘薯糖蛋白提取物和甘薯糖蛋白的终浓度为50mg/L，培养18h。利用MTT法检测细胞存活率，与空白对照组比较计算细胞存活率。不加药物为空白对照组。

实验结果表明，本发明的甘薯糖蛋白在50ppm浓度上，对肝癌细胞HepG2生长抑制率为50％、对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制率为70％、对结肠癌细胞HCT8生长抑制率为65％；甘薯糖蛋白提取物在50ppm浓度上，对肝癌细胞HepG2生长抑制率为41％、对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制率为52％、对结肠癌细胞HCT8生长抑制率为51％。

本发明的甘薯糖蛋白对HepG2肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、HCT8结肠癌细胞表现出明显的生长抑制作用，具有良好的肿瘤治疗前景。

Claims

1.一种甘薯糖蛋白，其特征在于，所述甘薯糖蛋白的生物质谱分子量为 7180-9187，分子中糖的相对含量为 73.4%，蛋白质的相对含量为 26.6%；其中单糖的相对含量为甘露糖1.18%、鼠李糖 8.22%、葡萄糖醛酸 8.62%、葡萄糖 1.76%、半乳糖 54.41%、阿拉伯糖25.79%，氨基酸的相对含量为天门冬氨酸 11.30%、苏氨酸 7.56%、丝氨酸 10.01%、谷氨酸11.64%、甘氨酸 5.62%、丙氨酸 11.85%、缬氨酸 6.01%、蛋氨酸 0.13%、异亮氨酸 4.77%、亮氨酸 5.78%、酪氨酸 1.86%、苯丙氨酸 3.77%、赖氨酸 8.19%、组氨酸 1.76%、精氨酸2.48%、脯氨酸 6.47%；

所述甘薯糖蛋白的制备方法包括以下步骤：

步骤 1：30-100℃下，向甘薯淀粉母液中加入沉淀剂，离心或过滤，除去沉淀，得到澄清滤液；所述沉淀剂选自钙盐、镁盐、铝盐、醋酸、苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸内酯或海藻酸钠；按重量计，所述的沉淀剂加入量为甘薯淀粉母液重量的 0.01%-5%

步骤 2：将步骤 1 获得的澄清滤液通过树脂柱层析，得到甘薯糖蛋白粗品；所述的树脂选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、离子纤维交换素、大孔吸附树脂和聚酰胺树脂；所述的柱层析条件为：树脂与淀粉母液按重量比 1:1-1000 的比例上柱，按照树脂体积的 0.01-5% /min 的速度上柱，然后用 0.5-5 倍柱体积水洗脱树脂，再用 1-5 倍柱体积溶剂洗脱树脂，其中，强碱性阴离子交换树脂的洗脱溶液为0.5mol/L 的碳酸氢钠，弱碱性阴离子交换树脂的洗脱溶液为0.1 mol/L 的氢氧化钠，强酸性阳离子交换树脂的洗脱溶液为0.01mol/L 的盐酸，弱酸性阳离子交换树脂的洗脱溶液为2mol/L 的醋酸，离子纤维交换素的洗脱溶液0.2mol/L 的氯化钠，大孔吸附树脂的洗脱溶液为0.1mol/L 的氯化钠，聚酰胺树脂的洗脱溶液为0.5mol/L 的氯化铵；

步骤 3：将步骤 2 获得的甘薯糖蛋白粗品进行半透膜超滤浓缩至粗品原体积的 5%-20%，补加蒸馏水至原体积，重复超滤浓缩操作 5 次以上，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白；所述的半透膜的截留分子量为 1000-3000；所述的超滤浓缩操作，每次超滤浓缩至溶液原体积的 10%-20%；所述的超滤浓缩步骤重复 5-10 次。

2.如权利要求1所述甘薯糖蛋白，其特征在于，步骤1中，所述的温度为 60-90℃，所述沉淀剂选自硫酸钙、硫酸镁、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和葡萄糖酸内酯；按重量计，步骤 1 所述沉淀剂的加入量为甘薯淀粉母液重量的0.05%-1%；

步骤2中，所述柱层析条件中树脂与淀粉母液按重量比 1:5-100 的比例上柱，上样速度为树脂体积的 0.1-3%/min，水洗脱液洗脱体积为 1-3 倍树脂体积，溶剂洗脱液洗脱体积为 2-3 倍树脂体积。

3.含有权利要求 1 或 2 所述甘薯糖蛋白的甘薯糖蛋白提取物，其特征在于，按重量计，所述甘薯糖蛋白的含量占提取物总量的 40%以上。

4.根据权利要求 3 所述的甘薯糖蛋白提取物，其特征在于，按重量计，所述甘薯糖蛋白的含量占提取物总量的 50%以上。

5.根据权利要求 4 所述的甘薯糖蛋白提取物，其特征在于，按重量计，所述甘薯糖蛋白的含量占提取物总量的 60%以上。

6.权利要求 3所述的甘薯糖蛋白提取物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

步骤 A：30-100℃下，向甘薯淀粉母液中加入沉淀剂，离心或过滤，除去沉淀，得到澄清滤液；所述沉淀剂为钙盐、镁盐、铝盐、醋酸、苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸内酯或海藻酸钠；所述的沉淀剂加入量为甘薯淀粉母液重量的 0.01%-5%；

步骤 B：将步骤 A 获得的澄清滤液通过树脂柱层析，得到甘薯糖蛋白粗品；所述的树脂选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、离子纤维交换素、大孔吸附树脂和聚酰胺树脂；所述的柱层析条件为：树脂与淀粉母液按重量比 1:1-1000 的比例上柱，按照树脂体积的 0.01-5%/min 的速度上柱，然后用 0.5-5 倍柱体积水洗脱树脂，再用 1-5 倍柱体积溶剂洗脱树脂，其中，强碱性阴离子交换树脂的洗脱溶液为0.5mol/L 的碳酸氢钠，弱碱性阴离子交换树脂的洗脱溶液为0.1mol/L 的氢氧化钠，强酸性阳离子交换树脂的洗脱溶液为0.01mol/L 的盐酸，弱酸性阳离子交换树脂的洗脱溶液为2mol/L 的醋酸，离子纤维交换素的洗脱溶液0.2mol/L 的氯化钠，大孔吸附树脂的洗脱溶液为0.1mol/L 的氯化钠，聚酰胺树脂的洗脱溶液为0.5mol/L的氯化铵；

步骤 C：将步骤 B 获得的甘薯糖蛋白粗品进行半透膜超滤浓缩至粗品原体积的 5%-20%，冷冻干燥，得到甘薯糖蛋白提取物；所述的半透膜的截留分子量为 1000-3000；所述的超滤浓缩操作，每次超滤浓缩至溶液原体积的 10%-20%；所述的超滤浓缩操作步骤重复0-4 次。

7.如权利要求6所述甘薯糖蛋白提取物，其特征在于，

步骤 A 中，所述的温度为 60-90℃；所述的沉淀剂选自硫酸钙、硫酸镁、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和葡萄糖酸内酯；按重量计，所述沉淀剂的加入量为甘薯淀粉母液重量的0.05%-1%；

步骤 B 中，所述柱层析条件中树脂与淀粉母液按重量比 1:5-100 的比例上柱，上样速度为树脂体积的 0.1-3%/min，水洗脱液洗脱体积为 1-3 倍树脂体积，溶剂洗脱液洗脱体积为 2-3 倍树脂体积；

步骤 C 中，所述的超滤浓缩操作步骤重复 2-3 次。

8.一种药物组合物，其包含权利要求 1 或 2 所述的甘薯糖蛋白和/或权利要求3～7任一项所述的甘薯糖蛋白提取物和至少一种药学可接受的载体。

9.权利要求 1 或 2 所述的甘薯糖蛋白和/或权利要求 3～7任一项所述甘薯糖蛋白提取物和/或权利要求 8 所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肝癌、乳腺癌或结肠癌的药物中的用途。

10.一种保健食品，其包含权利要求 1 或 2 所述的甘薯糖蛋白和/或权利要求3～7任一项所述的甘薯糖蛋白提取物和至少一种食品添加剂。

11.权利要求 1 或 2 所述的甘薯糖蛋白和/或权利要求 3～7任一项所述的甘薯糖蛋白提取物和/或权利要求 10 所述的保健食品在制备食品、保健品中的应用。