CN110881629A - 一种红枣酶解物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红枣酶解物，它是由红枣经过酶解制备而成，其中，环磷酸腺苷含量为0.48～1.34mg/g，多糖含量为10.00～50.40％，黄酮含量为0.42～0.68％、蛋白质含量为4.79～8.98％。本发明还公开了前述红枣酶解物的制备方法和用途。本发明红枣酶解物的有效成分含量高，药效优良。
Description
技术领域
本发明属于生物技术在食品深加工领域的应用，特别是酶工程技术用于红枣深加工 生产方法。
背景技术
红枣又名大枣、华枣等，是鼠李科植物的成熟果实。我国种植红枣的历史悠久，在《齐民要术》、《伤寒论》、《本草纲目》等中医著作中都有所阐述。红枣中含有的营养 成分及其丰富，且美味香甜，与李、栗、杏、桃，共同称为我国的古代五种著名果品。随 着近年来社会生活水平的提高，人们的自我保健意识逐渐增强，由于大枣具有特殊的医药 保健作用，使得它已成为越来越多人关注的健康产品，同时也受到了国内外很多研究人员 的重视，并对其含有的营养成分进行了深入的研究。
红枣中含有的化学成分约有多种，主要化学成分有糖类、有机酸和三萜类、蛋白质、 黄酮、腺苷和皂苷类、维生素和矿物质元素及其它成分。已有研究结果显示，鲜果含糖量 约在35％以上，且其中主要起到生理活性作用的是酸性多糖和中性多糖。红枣中含有的有机酸的种类很多，其中尼克酸具有能使人体的毛细血管得到健全的作用，同时它的含量高于其它的果品。在大枣植物中发现的三帖酸类成分有很多，含量较多的是羽扇豆烷型、齐墩果烷型三萜类。氨基酸的种类也很多，有必需氨基酸，也有非必需氨基酸，特别是脯 氨酸含量占总氨基酸含量的20％以上。人们都说红枣是天然的维生素丸，其中维生素C 的含量甚至超过红枣中和多糖的测定及提取工艺研究了猕猴桃，此外，维生素B、E的含 量也很高。矿物质和微量元素的含量由于地区的影响有所不同，但主要含有铁、钾、憐等。 红枣中主要含有的黄酮类物质是2(S)-柑橘素-6，8二葡萄糖碳苷，含量较高。据报道红枣 中含有的环核苷酸类物质已经达到了30-40nmol，皂昔类物质主要是酸枣仁皂苷。除此之 外，还含有生物碱、树脂、挥发油等其它成分。
红枣具有非常多的生物活性物质，其中包括通过调节免疫系统达到的抗肿瘤活性和 抗过敏反应活性，由于红枣中特有的营养成分能够去除自由基，促进皮肤的细胞代谢，起 到养血养颜、安神益气的作用；由于红枣中特有的丰富的环磷酸腺苷和尼克酸等物质，红 枣具有防止心血管疾病、治疗心律不齐和心动过速的作用。所以，红枣深加工产品用于特 殊营养膳食食品，具有非常广阔的应用前景。
环磷酸腺苷(简称为cAMP)，它在熔点为220℃的时候容易被分解，且在水中微溶。环磷酸腺苷是一种由核糖、腺嘌呤和磷酸组成的一种衍生物，由于核糖的3’,5’位与磷酸相连成环状，所以因此而得名。环磷酸腺苷是蛋白酶激活剂，在生物体内起着重要的生物活性作用。它在机体中的分布式是很广的，无论是低等的微小生物，还是高等的哺乳动物中都含有，但是所含有的量都不是很高。在生物的机体中，环磷酸鸟苷和环磷酸腺苷在共同的相互制约相互影响下，在生物中起着重要的活性作用。当对生物体起到有利而增强的作用时需要这两者要保持一定的比值，同时要求这两者之间的比值要适当，过高或过低都会产生不利的影响，甚至有可能引起疾病的发生。经过许多研究者的研究结果表明：环磷酸腺苷具有改善睡眠质量、提高记忆力、保肝护肾及改善横纹肌、骨骼肌、内心肌的疲劳 程度的作用。
目前红枣的加工主要还留存在将其制成蜜枣，脆枣，或是用于其他食品中作为添加 配料。如中国专利号201310550707.5公开的“一种玉竹红枣锅巴”，中国专利号201110460881.1公开的“一种红枣浓浆”，均是粗加工后作为配料添加剂，未能充分发挥 红枣之营养价值与功效。中国专利号201410818834.3公开的“一种提取大枣多糖的方法” 以水为溶液媒介以纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶酶解；分离得到滤液后， 将滤液浓缩后加入无水乙醇醇沉4～5次，离心干燥后得大枣多糖。此种方法多糖得率较 高，但营养结构单一，仅收集了红枣多糖，对于蛋白质，黄酮，腺苷等未做提及，且后期 需要乙醇萃取，增加了工业生产成本与难度。尤妍，“哈密大枣环磷酸腺苷提取纯化工艺 研究”，新疆农业大学2011-06-01公开了大枣中环磷腺苷的提取纯化工艺，具体是采用 水提后，采用树脂纯化的工艺，但是其只能得到环磷腺苷，而红枣中的其他有效成分则丢 失。
发明内容
本发明的目的是利用先进的酶解技术方案生产红枣低分子多糖和多肽，充分富集环 磷酸腺苷、黄酮等生物活性小分子，产品收率高，生产周期短的红枣深加工产品，可用于生产高营养活性的红枣干粉及红枣饮料，可用于心脑血管疾病的辅助治疗的营养干预食品。
本发明红枣酶解物，它是由红枣经过酶解制备而成，其中，环磷酸腺苷含量为0.48～1.34mg/g，多糖含量为10.00～50.40％，黄酮含量为0.42～0.68％、蛋白质含量为4.79～8.98％。
其中，所述红枣为新疆红枣、山西红枣、河北红枣、甘肃红枣、新疆阿克苏枣。
所述红枣酶解物是由如下方法制备：
(1)取红枣果肉，加入8～12倍体积(v/w)的水，在30～65℃条件下，调pH值至 5，加入红枣果肉1～8％(w/w)的糖酶，反应0.5～12小时；
(2)30～65℃条件下，恒定pH值至8～9，加入红枣果肉1～8％(w/w)的碱性蛋白酶，反应0.5～12小时；
(3)30～65℃条件下，加入红枣果肉1～8％(w/w)的中性蛋白酶，反应0.5～12 小时；
(4)使酶失活，过滤，得上清液，浓缩，真空冻干，即可。
步骤(1)中，加入10倍体积的水，加入红枣果肉2％(w/w)的糖酶，反应3小时； 所述糖酶是纤维素酶与果胶酶的混合酶；优选地，所述纤维素酶与果胶酶的比例为1:1。
步骤(2)中，恒定pH值至8，恒温搅拌下加入红枣果肉2％(w/w)的碱性蛋白酶， 反应2小时。
步骤(3)中，加入红枣果肉2％(w/w)的中性蛋白酶，反应2小时。
本发明种制备前述红枣酶解物的方法，步骤如下：
(1)取红枣果肉，加入8～12倍体积(v/w)的水，在30～65℃条件下，调pH值至 5，加入红枣果肉1～8％(w/w)的糖酶，反应0.5～12小时；
(2)30～65℃条件下，恒定pH值至8～9，加入红枣果肉1～8％(w/w)的碱性蛋白酶，反应0.5～12小时；
(3)30～65℃条件下，加入红枣果肉1～8％(w/w)的中性蛋白酶，反应0.5～12 小时；
(4)使酶失活，过滤，得上清液，浓缩，真空冻干，即可。
步骤(1)中，加入10倍体积的水，加入红枣果肉2％(w/w)的糖酶，反应3小时； 所述糖酶是纤维素酶与果胶酶的混合酶；优选地，所述纤维素酶与果胶酶的比例为1:1。
步骤(2)中，恒定pH值至8，恒温搅拌下加入红枣果肉2％(w/w)的碱性蛋白酶， 反应2小时。
步骤(3)中，加入红枣果肉2％(w/w)的中性蛋白酶，反应2小时。
本发明还提供了前述的红枣酶解物环磷酸腺苷的含量高，同时多糖、黄酮和蛋白质和 氨基酸含量也较高，可以有效预防/治疗心动过速，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实 现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1新疆大枣酶解物的环磷酸腺苷含量检测图
图2新疆大枣酶解物的环磷酸腺苷含量检测图
图3大枣酶解物的环磷酸腺苷含量检测图
图4河北大枣原料的环磷酸腺苷含量检测图
图5河北大枣酶解物的环磷酸腺苷含量检测图
图6陕西大枣酶解物的环磷酸腺苷含量检测图
图7陕西大枣酶解物的环磷酸腺苷含量检测图
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂如下：
糖酶(包括：纤维素酶(2万活力单位)、果胶酶(1万活力单位))：购自山东苏 柯汉生物技术有限公司，应用时为二者的重量比为1:1混合物，
碱性蛋白酶(10万U/g)和中性蛋白酶(2万U/g)购自诺维信(中国)生物技术有 限公司。
检测方法：
一、采用高压液相法进行红枣环磷酸腺苷含量测定：
(一)标准曲线绘制
1.准确称取0.05g环磷酸腺苷，用0.02mol/L磷酸氢二钾定容至500mL，得到0.1mg/mL储备液。
2.分别量取环磷酸腺苷储备液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0mL至100mL容量瓶，用0.02mol/L磷酸氢二钾定容，得到浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL 使用液，过0.45针式过滤头
3.分别吸取不同浓度标准使用液20μL，注入色谱仪，测定其吸光度值
4.以吸收峰面积为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，y＝77495x-2642.4，R2＝0.9995。
(二)样液测定
1.准确称取20g红枣果肉，放入500mL烧杯中，加水250mL，室温下浸泡17h。
2.过滤收集上清液，向残渣中加入125mL蒸馏水，超声4h，过滤收集上清液。
3.合并两次上清液，旋转蒸发浓缩定容至100mL。
4.准确吸取200μL样液，加入10mL容量瓶，用0.02mol/L磷酸氢二钾定容至10mL，过0.45针式过滤头。
5.吸取20μL样液，注入色谱仪，测定其吸光度，计算出含量。
二、大枣多糖的含量测定
1.苯酚试液的配制：取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，于182℃ 下收集馏分。称取5g馏分，加蒸馏水溶解，定容于100mL容量瓶中，转入棕色瓶备用。
2.标准曲线制备：准确移取葡萄糖标准液0.75mL，1.5mL，2.25mL，3.0mL，3.75 mL，4.5mL，分别置于25mL具塞试管中，加5％苯酚试液5.0mL混匀，快速沿管壁加 浓硫酸15.0mL，混匀，加水定容，室温下放置15min，置于40℃水中10min，取出静置 15min，以蒸馏水同法操作作为空白对照，在491nm处测吸光度A。计算其标准曲线回 归方程。
(最终所得标准曲线回归方程Y＝0.0015X+0.0727，r＝0.9998，表明葡萄糖标准液在 30～180ug/mL范围内线性良好。)
3.样品中大枣多糖含量测定：准确称取大枣粗多糖0.0501g，用蒸馏水溶解，稀释定 容于50mL容量瓶中，摇匀，准确移取该溶液5.00mL，测其吸光度，由回归方程求出样 品多糖含量，计算出大枣提取物中多糖含量。
三、大枣总黄酮含量测定方法
1.总黄酮的提取：将红枣酶解液冷冻干燥，磨碎，称取4.0g粉末，加8mL纯净水 润湿，用30mL甲醇超声提取25min，上清液移至50mL容量瓶中，残渣再用甲醇提取 2次，合并提取液并用甲醇定容，摇匀，过0.45滤膜，作为供试液。
2.芦丁对照品溶液配制：准确称取干燥到恒温的芦丁对照品12.0mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇完全溶解并稀释至刻度，此时浓度为0.240mg/mL。准确吸取该溶液10.0 mL于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀得芦丁对照品溶液。
3.最大吸收波长确定：准确吸取0.096mg/mL芦丁标准品溶液4.0mL于10mL比色 管中，加0.3mL5％亚硫酸钠溶液，振摇6min，加0.3mL 10％硝酸铝溶液，振摇6min， 加4mL 5％氢氧化钠溶液，并加甲醇至刻度，振摇并放置15min后，用分光光度计在 420～540nm测定吸收值，标准品芦丁呈现最大吸收处即为测定波长。
4.标准曲线绘制：准确吸取0.096mg/mL芦丁标准溶液0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0于10 mL比色管中，加0.3mL 5％亚硫酸钠溶液，振摇6min，加0.3mL 10％硝酸铝溶液，振摇6min，加4mL 5％氢氧化钠溶液，并加甲醇至刻度，振摇并放置15min后，以标准 试验品做空白，用1cm比色皿于最大吸收波长处测吸光值。以浓度对吸光度进行回归， 计算得出回归方程为Y＝25.625X+0.0237，R＝0.9990，表明在0.0048～0.0479mg/mL范围 内线性良好。
5.总黄酮含量测定：将供试液测吸光度，按回归方程计算总黄酮量。
总黄酮含量：(mg/100g)＝(C*V)/m2*100，
其中C为试液中总黄酮浓度；
V是试液定容体积(mL)；
m2为样品质量。
实施例1本发明红枣酶解物的制备(以去核红枣果肉为原料制备红枣酶解物)
将100克干净的新疆产红枣去核果肉，加入水1000毫升恒温45℃，调pH值至5， 加入2克糖酶，反应3小时；之后同样温度下，恒定pH值至8，恒温搅拌下加入2克碱 性蛋白酶反应2小时；再之后同样温度条件下加入2克中性蛋白酶反应2小时；之后升温 至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～ 65℃减压浓缩，最后真空冻干，即得固态红枣酶解物干粉。收率62.1％。
经测定，其中：粗蛋白含量5.92％，氨基酸总含量：4.31％；环磷酸腺苷1.34毫克/1克干燥红枣酶解干粉；总黄酮0.52％红枣酶解物干粉。
实施例2本发明红枣酶解物的制备
将100克干净的新疆产红枣去核果肉，加入水800毫升恒温50℃，调pH值至5，加 入1克糖酶，反应12小时；之后同样温度下，恒定pH值至9，恒温搅拌下加入1克碱性 蛋白酶反应12小时；再之后同样温度条件下加入1克中性蛋白酶反应12小时；之后升温 至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～ 65℃减压浓缩，最后真空冻干，即得固态红枣酶解物干粉。收率58.1％。
经测定，其中：粗蛋白含量5.01％，氨基酸总含量：4.68％；环磷酸腺苷1.05毫克/1克干燥红枣酶解干粉；总黄酮0.52％红枣酶解物干粉。
实施例3本发明红枣酶解物的制备
将100克干净的新疆产红枣去核果肉，加入水1200毫升恒温65℃，调pH值至5， 加入8克糖酶，反应0.5小时；之后同样温度下，恒定pH值至9，恒温搅拌下加入8克 碱性蛋白酶反应0.5小时；再之后同样温度条件下加入8克中性蛋白酶反应0.5小时；之 后升温至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温 度40～65℃减压浓缩，最后真空冻干，即得固态红枣酶解物干粉。收率62.1％。
经测定，其中：粗蛋白含量6.25％，氨基酸总含量：5.63％；环磷酸腺苷1.12毫克/1克干燥红枣酶解干粉；总黄酮0.62％红枣酶解物干粉。
实施例4本发明红枣酶解物的制备(以去核山西红枣为原料制备红枣酶解物干粉)
将100克干净的去核山西红枣，加入无离子水1000毫升恒温45℃，调pH值至5， 加入2克糖酶，反应2小时；之后同样温度下，恒定pH值至8，恒温搅拌下加入2克碱 性蛋白酶反应2小时；再之后同样温度条件下加入2克中性蛋白酶反应2小时；之后升温 至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～ 65℃减压浓缩，最后真空冻干，即得固态红枣酶解物干粉。收率为57.8％。
经测定，其中：粗蛋白含量3.56％，氨基酸总含量：2.74％；环磷酸腺苷0.48毫克/1克干燥红枣酶解干粉；总黄酮0.42％红枣酶解物干粉。
实施例5不同来源红枣的酶解物环磷酸腺苷含量
1、实验方法
取新疆大枣、河北大枣和陕西大枣，按照实施例1的方法制备酶解物，分别检测原料 和酶解物的环磷酸腺苷含量。
2、实验结果
环磷酸腺苷检测图谱如图1～图6所示。
其中，实施例1中新疆大枣原料和酶解物的环磷酸腺苷含量分别如图1和图2所示：
其中，采用河北大枣，按照实施例1的方法制备酶解物，原料和酶解物的含量分别如 图3和图4所示：
其中，采用陕西大枣，按照实施例1的方法制备酶解物，原料和媒介物的酶解分别如 图5和图6所示：
实验结果说明，采用本发明方法制备的红枣酶解物，环磷酸腺苷的含量明显高于原料 大枣的含量。
试验例6本发明红枣酶解物多糖、黄酮、蛋白含量的测定
1、实验方法
分别取新疆红枣、山西红枣、河北红枣、甘肃红枣、新疆阿克苏枣，按照本发明实施例1的方式制备酶解物，检测其多糖、黄酮、蛋白含量。
2、实验结果
实验结果如下表1所示：
表1本发明红枣酶解物的成分分析
实验结果说明，本发明方法制备的红枣酶解物的多糖、黄酮和蛋白质含量高。
综上，本发明方法制备的红枣酶解物，环磷酸腺苷的含量高，同时多糖、黄酮和蛋白 质和氨基酸含量也较高。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
试验例1本发明红枣酶解物效果检测(红枣酶解物在心动过速的应用实验)
病例资料：共计10例患者，年龄：55-70岁，其中男性4例，女性6例，高血压病 人7例，更年期综合症患者3例。主诉，心动过速和心律不齐，医院诊断报告中，窦性心 律不齐7例，心急缺血3例。
口服红枣酶解物，每天2次，每次5克，连续服用1个月。其中，5例心动过速者基 本恢复正常，2例心动过速好转，其他3例心动过速有改善，总有效率70％。
综上，本发明方法制备得到的红枣酶解物的环磷酸腺苷含量高，多糖、黄酮和蛋白质 等有效成分的含量也比较高，应用前景优良。
Claims (10)
1.一种红枣酶解物，其特征在于：它是由红枣经过酶解制备而成，其中，环磷酸腺苷含量为0.48～1.34mg/g，多糖含量为10.00～50.40％，黄酮含量为0.42～0.68％、蛋白质含量为4.79～8.98％。
2.根据权利要求1所述的红枣酶解物，其特征在于：所述红枣为新疆红枣、山西红枣、河北红枣、甘肃红枣、新疆阿克苏枣。
3.根据权利要求1或2所述的红枣酶解物，其特征在于：它是由如下方法制备：
(1)取红枣果肉，加入8～12倍体积(v/w)的水，在30～65℃条件下，调pH值至5，加入红枣果肉1～8％(w/w)的糖酶，反应0.5～12小时；
(2)30～65℃条件下，恒定pH值至8～9，加入红枣果肉1～8％(w/w)的碱性蛋白酶，反应0.5～12小时；
(3)30～65℃条件下，加入红枣果肉1～8％(w/w)的中性蛋白酶，反应0.5～12小时；
(4)使酶失活，过滤，得上清液，浓缩，真空冻干，即可。
4.根据权利要求3所述的红枣酶解物，其特征在于：步骤(1)中，加入10倍体积的水，加入红枣果肉2％(w/w)的糖酶，反应3小时；所述糖酶是纤维素酶与果胶酶的混合酶；优选地，所述纤维素酶与果胶酶的比例为1:1。
5.根据权利要求3所述的红枣酶解物，其特征在于：步骤(2)中，恒定pH值至8，恒温搅拌下加入红枣果肉2％(w/w)的碱性蛋白酶，反应2小时；和/或，步骤(3)中，加入红枣果肉2％(w/w)的中性蛋白酶，反应2小时。
6.一种制备前述权利要求1～5任意一项所述的红枣酶解物的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取红枣果肉，加入8～12倍体积(v/w)的水，在30～65℃条件下，调pH值至5，加入红枣果肉1～8％(w/w)的糖酶，反应0.5～12小时；
(2)30～65℃条件下，恒定pH值至8～9，加入红枣果肉1～8％(w/w)的碱性蛋白酶，反应0.5～12小时；
(3)30～65℃条件下，加入红枣果肉1～8％(w/w)的中性蛋白酶，反应0.5～12小时；
(4)使酶失活，过滤，得上清液，浓缩，真空冻干，即可。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，加入10倍体积的水，加入红枣果肉2％(w/w)的糖酶，反应3小时；所述糖酶是纤维素酶与果胶酶的混合酶；优选地，所述纤维素酶与果胶酶的比例为1:1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，恒定pH值至8，恒温搅拌下加入红枣果肉2％(w/w)的碱性蛋白酶，反应2小时。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，加入红枣果肉2％(w/w)的中性蛋白酶，反应2小时。
10.权利要求1～5任意一项所述的红枣酶解物在制备预防/治疗心动过速的药物中的用途。
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