CN104367987B - 兽用黄芪制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
兽用黄芪制剂及其制备方法，属于植物中药有效成分提取及应用技术领域，所述药物中含有黄芪多糖和黄芪多肽两种活性成分，其剂型为注射液、口服液或者粉剂。其制备方法为：综合利用酶水解提取技术有效的从黄芪原料中提取到了高活性的黄芪多肽和高含量、高纯度的黄芪多糖并进行有效配置成黄芪制剂，解决了综合提取制备技术难题，有利于对黄芪多糖和黄芪多肽的进一步系统、深入研究，大大提高了得率和纯度，减少资源浪费，降低成本，有利于产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物中药有效成分提取及应用技术领域，具体涉及一种兽用黄芪制剂及其制备方法。
背景技术
黄芪是豆科植物，内蒙（膜荚）黄芪的干燥根中含有多糖、黄酮类化合物、生物碱类、皂苷类、多肽、氨基酸、微量元素等众多的生物活性物质，具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌的功能。其有效成分中黄芪多糖具有提高机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、抗突变、降血脂、降血糖以及改善动物生产性能等功能，同时由于它自身对细胞毒性极小，对正常细胞影响很小，因此将多糖作为药物对于治疗多种免疫缺损疾病和自身免疫疾病有显著效果。
多肽是蛋白质的初级形式，几乎涉及动物机体神经、生长、生殖等生命的全过程，是具有调节机体代谢、维持生命活动等功能的活性物质。随着医学、药学、医学免疫学以及分子药理学理论及技术的不断发展，人们逐渐认识到中药材中所含的生物活性多肽在动物机体中所发挥的作用，如抗菌，降低胆固醇，抗氧化，促进矿物质吸收，提高生物利用度，增强免疫等等。
传统中药往往侧重动物类中药所含多肽和蛋白质的研究，而忽视了植物类中药材所含的生物活性多肽和蛋白质的提取及应用。传统植物中药提取工艺（如蒸煮法、浸渍法、渗滤法、回流法等）存在反应条件恶劣、某些有效成分提取率不高（如黄芪多肽）、杂质清除率低等问题，这些问题制约着中药所含生物活性多肽的开发和研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兽用黄芪制剂，提供其制备方法是本发明的另一发明目的。
基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：兽用黄芪制剂，所述黄芪制剂的活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽。
所述活性成分的重量组成为：黄芪多糖10～60份、黄芪多肽1.0～12.0份。
所述活性成分的重量组成为：黄芪多糖10～20份、黄芪多肽1.0～4.0份，或是黄芪多糖20～40份、4.0～8.0份，或是黄芪多糖40～60份、黄芪多肽8.0～12.0份。
所述黄芪多肽的分子量≤10KDa。
所述制剂为注射液、口服液或者粉剂。
所述兽用黄芪制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）黄芪粉碎后加10～20倍重量的水，并加入果胶酶和纤维素酶进行水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
2）对步骤1）所得液相分离物进行醇沉，分别收集上清液和沉淀物；
3）合并步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物并加水分散，加入中性蛋白酶进行进一步水解，水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
4）合并步骤2）的醇沉上清液和步骤3）所得的液相分离物，醇沉，分别收集上清液和沉淀物；
5）对步骤4）所得上清液进行膜分离、浓缩得到黄芪多肽溶液；或进一步干燥成黄芪多肽粉末；
6）将步骤4）所得沉淀物与步骤3）所得固相分离物合并，加水分散，除去不溶物，经氧化脱色处理后，加入乙酸钾后冷藏8～12h，收集沉淀物，精制，得到黄芪多糖。
7）取步骤5）所得黄芪多肽浓缩液和步骤6）所得黄芪多糖配制成液体制剂，或取步骤5）所得黄芪多肽粉末和步骤6）所得黄芪多糖配成粉剂。
步骤1）中所述果胶酶的用量为黄芪重量的0.05～0.2wt%，所述纤维素酶为Onozuka型纤维素酶，其用量为黄芪重量的0.5～2wt%，水解温度为40～55℃，水解pH为4.0～6.5，水解时间为1～2h。
步骤3）中所述中性蛋白酶为A.S1398中性蛋白酶，其加入量为步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物总重的0.05～0.1wt%，酶解温度为33～37℃，pH为6.0～8.0，酶解时间1～2h。
步骤5）中所述膜分离控制黄芪多肽的分子量≤10KDa。
步骤6）中所述精制操作为：将收集到的沉淀物经去离子水洗涤，配成20～35%水溶液，再经透析、醇沉、洗涤处理，制得精制黄芪多糖浓溶液；或进一步经喷雾干燥制得黄芪多糖粉，所述精制操作中醇沉次数至少为三次。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种药效成分配比合理的黄芪药物制剂，它不仅含有足量的黄芪多糖而且含有适当含量、高生物活性的黄芪多肽活性成分。该药物制剂对于提升家禽（鸡、鸭、鹅等）和家畜（猪、牛、羊等）的抗体水平和免疫器官指数，提高靶动物生长性能，以及某些常见病毒病的预防和辅助治疗方面均具有较好的作用，其治疗效果优于传统的黄芪多糖提取技术。
2、本发明工艺首先采用酶破壁技术对黄芪多肽进行水解，再采用中性蛋白酶进一步水解，保证了黄芪多肽较高的提取率以及高纯度的黄芪多糖的制备；整个水解过程可在全自动水解反应器中进行，水解条件容易控制。反应条件温和，在保证黄芪多糖的提取前提下，能够实现不破坏氨基酸结构和其他营养成分，保留了有效成分黄芪多肽。
3、本发明工艺提取的黄芪多糖和黄芪多肽的得率均很高，其中黄芪多糖的得率达到10.06%，是传统水提醇沉法的5倍左右；总蛋白的得率在0.105%以上，远远高于传统水提醇沉法，其中分子量≤10KDa的多肽占总蛋白的85%以上，其得率最高可达0.125%，远远高于传统水提醇沉法所得多肽。
4、本发明工艺解决了综合提取制备技术难题，有利于对黄芪多糖和黄芪多肽的进一步系统、深入研究，大大提高了得率和纯度，减少资源浪费，降低成本，有利于产业化生产。
5、本发明制剂的剂型可以为注射液、口服液或者粉剂，使用或者存储都比较方便。
附图说明
图1是实施例1-9中注射液的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。
实施例1-7
兽用黄芪制剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽；剂型为注射液，每ml注射液中活性成分的重量组成见表1所示。
表1 含有不同浓度黄芪多糖和黄芪多肽的兽用黄芪注射液（实施例1-7）
实施例1-7注射液的制备方法为，如图1所示：
1）取中药黄芪经40目球磨机粉碎后加15倍重量的水，并加入黄芪重量的0.1wt%果胶酶（100000U/g）和黄芪重量的1.0wt%Onozuka型纤维素酶（10000U/g）在50℃、pH为5.0进行水解，水解2h后，90℃，35min下酶灭活，离心分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
2）对步骤1）所得液相分离物进行醇沉，即加入乙醇至体系中乙醇体积分数为55%，静置8h后离心，分别收集上清液和沉淀物；
3）合并步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物并加水分散，加入上述沉淀物重量的0.08wt%中性蛋白酶A.S1398（1500U/mg）在35℃、pH为7.0进行进一步水解2h，水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
4）合并步骤2）的醇沉上清液和步骤3）所得的液相分离物，加入乙醇至体系中乙醇体积分数为55%，静置12h后离心，分别收集上清液和沉淀物；
5）对步骤4）所得上清液加入5倍体积的去离子水，通过超滤膜分离，收集分子量≤10KDa的多肽溶液，得到黄芪多肽溶液，浓缩至黄芪多肽的含量为200mg/ml；
6）将步骤4）所得沉淀物与步骤3）所得固相分离物合并，加水分散，除去不溶物经双氧水氧化脱色处理后，加入乙酸钾冷藏12h，收集沉淀物，将收集到的沉淀物经去离子水洗涤，配成30%水溶液，再经透析、三次醇沉（乙醇与水的体积比为9:1）、洗涤得黄芪多糖，测得黄芪多糖的含量为65mg/ml；
7）取步骤5）所得黄芪多肽浓缩液和步骤6）所得黄芪多糖溶液，按照表1中所示比例进行配制注射液并调节pH，具体见表1所示。
实施例1-7所制备的注射液药效成分配比合理，含有黄芪多糖和适当含量、高生物活性的黄芪多肽成分。该注射液对于提升家禽（鸡、鸭、鹅等）和家畜（猪、牛、羊等）的抗体水平和免疫器官指数，提高靶动物生长性能，以及某些常见病毒病的预防和辅助治疗方面均具有较好的作用，当每ml注射液中含有黄芪多糖10～60mg、黄芪多肽1.0～12.0mg时所起到的效果为最好。
实施例8
兽用黄芪制剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽；其剂型为注射液，每ml注射液中含有黄芪多糖40mg、黄芪多肽8.0mg。
如图1所示，其制备方法为：
1）取中药黄芪经40目球磨机粉碎后加10倍重量的水，并加入黄芪重量的0.05wt%果胶酶（100000U/g）和黄芪重量的0.5wt%Onozuka纤维素酶（10000U/g）在55℃、pH为5.5进行水解，水解2h后，100℃，30min下酶灭活，离心分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
2）对步骤1）所得液相分离物进行醇沉，即加入乙醇至体系中乙醇体积分数为60%，静置8h后离心，分别收集上清液和沉淀物；
3）合并步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物并加水分散，加入上述沉淀物重量的0.05wt%中性蛋白酶A.S1398（1500U/mg）在36℃、pH为6.0进行进一步水解2h，水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
4）合并步骤2）的醇沉上清液和步骤3）所得的液相分离物，加入乙醇至体系中乙醇体积分数为55%，静置8h后离心，分别收集上清液和沉淀物；
5）对步骤4）所得上清液加入5倍体积的去离子水，通过超滤膜分离，收集分子量≤10KDa的多肽溶液，将其置于旋转蒸发器进行浓缩处理，采用福林酚法测得黄芪多肽的含量；
6）将步骤4）所得沉淀物与步骤3）所得固相分离物合并，加水分散，除去不溶物经双氧水氧化脱色处理后，加入乙酸钾冷藏10h，收集沉淀物，将收集到的沉淀物经去离子水洗涤，配成20%水溶液，再经透析、三次醇沉（乙醇与水的体积比为9:1）、洗涤得黄芪多糖，采用蒽酮比色法测定黄芪多糖的含量；
7）取步骤5）所得黄芪多肽浓缩液和步骤6）所得黄芪多糖进行配制成每ml含有黄芪多糖40mg、黄芪多肽8.0mg的注射液，并调节pH为5.0。
实施例9
兽用黄芪制剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽；其剂型为注射液，每ml注射液中活性成分的重量组成为黄芪多糖20mg、黄芪多肽4.0mg。
如附图1所示，其制备方法为：
1）取中药黄芪经80目球磨机粉碎后加10倍重量的水，并加入黄芪重量的0.2wt%果胶酶（100000U/g）和黄芪重量的0.2wt%Onozuka型纤维素酶（10000U/g）在45℃、pH为6.0进行水解，水解2h后，80℃，40min下酶灭活，离心分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
2）对步骤1）所得液相分离物进行醇沉，即加入乙醇至体系中乙醇体积分数为65%，静置8h后离心，分别收集上清液和沉淀物；
3）合并步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物并加水分散，加入上述沉淀物重量的0.1wt%中性蛋白酶A.S1398（1500U/mg）在37℃、pH为7.0进行进一步水解2h，水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
4）合并步骤2）的醇沉上清液和步骤3）所得的液相分离物，加入乙醇至体系中乙醇体积分数为55%，静置8h后离心，分别收集上清液和沉淀物；
5）对步骤4）所得上清液加入5倍体积的去离子水，通过超滤膜分离，收集分子量≤10KDa的多肽溶液，将其置于旋转蒸发器进行浓缩处理，采用福林酚法测得黄芪多肽的含量；
6）将步骤4）所得沉淀物与步骤3）所得固相分离物合并，加水分散，除去不溶物经双氧水氧化脱色处理后，加入乙酸钾冷藏过夜，收集沉淀物，将收集到的沉淀物经去离子水洗涤，配成35%水溶液，再经透析、三次醇沉（乙醇与水的体积比为8.5:1.5）、洗涤得黄芪多糖，采用蒽酮比色法测定黄芪多糖的含量；
7）取步骤5）所得黄芪多肽浓缩液和步骤6）所得黄芪多糖进行配制成每ml含黄芪多糖20mg、黄芪多肽4.0mg的注射液，并调节pH为7.0。
对比例1 参考中药成分制剂第十七册中黄芪注射液制备方法
黄芪加水煎煮三次，合并煎液，滤液浓缩，用乙醇沉淀处理二次，二次溶液中含乙醇浓度分别为75%和85%，每次均冷藏放置，回流乙醇并浓缩至每ml相当于原生药10g，注射用水稀释至每ml相当于原药材0.75g，冷藏放置12h，滤过，滤液浓缩至每ml相当于原药材6g，放冷，用20%氢氧化钠溶液调节pH值为7.5，煮沸，加入0.125%活性炭，煮沸5min，趁热滤过，加注射用水使成1000ml，滤过，再用20%氢氧化钠溶液调节pH至7.5，滤过，灌装，灭菌即得。
对比例2 参考CN99106225.6的实施例2
具体制备方法为：取黄芪2kg加水煎煮2次，每次2小时，合并煎液经滤器过滤；滤液常压加热浓缩至每ml相当于原药材2g；用乙醇沉淀3次，第一次在滤液中加入含量为70%的乙醇5升，醇沉后，冷藏0℃放置6小时，第二次再加入含量为80%的乙醇3升，醇沉后，冷藏0℃放置6小时，第三次再加入含量为85%的乙醇5升，醇沉后，冷藏0℃放置6小时；回流乙醇并浓缩至每ml相当于原药材10g；用注射用水稀释至每ml相当于原药材1g，冷藏至冷藏0℃放置24小时；过滤、滤液浓度至每ml相当于原药材6g，冷却；用20%氢氧化钠溶液调节pH值至8；煮沸加入0.175%的活性炭搅拌均匀，并煮沸5min，冷却至50℃用滤器趁热过滤，加注射用水使成1000ml；再加20%氢氧化钠溶液2mol/ml，调节pH值至7.5；最后过滤、灌装、灭菌、质检、包装而成。
对实施例7、实施例8、实施例9和对比例1-2所采用的制备方法制备注射液时的黄芪多糖得率、总蛋白得率、分子量≤10KDa的多肽比例以及黄芪多肽活性进行测定并进行对比：
1. 黄芪多糖得率的测定
首先采用蒽酮比色法测出1ml注射液中黄芪多糖的含量，再进而得出黄芪多糖的总含量从而计算出黄芪多糖的得率。
其中，蒽酮比色法具体为：多糖在硫酸的作用下水解成单糖分子并迅速脱水形成糖醛衍生物，再将其与蒽酮缩合形成有色化合物，在适当波长下和一定浓度范围内，吸收值与糖浓度成一定的线性关系，从而比色测定其含量。配制一系列不同浓度梯度的标准葡萄糖溶液，分别取1ml注射液置于试管中浸于冰水浴中冷却，然后在冰浴条件下加入蒽酮试剂，同时将各管置于沸水浴汇总准确加热7分钟，立即去除置冰浴中冷却至室温，按上述步骤操作，由回归方程得到相应的多糖的含量。
2.总蛋白含量的测定
采用微量凯氏定氮法对蛋白进行测定。
3.多肽的纯化
磷钼酸沉淀法：利用磷钼酸可以沉淀分子量10000以上的含氮物质。取灭酶后的酶解液20ml置于50ml容量瓶中，加入15ml水以及2ml钼酸钠溶液，摇匀，立即用滤纸重复过滤至滤液澄清，将滤液稀释适当倍数后取1ml用福林酚法测定多肽的含量。上述根据是硫酸和钼酸钠作用生产钼酸，然后和试样中存在的磷酸盐作用生产磷钼酸。
4.黄芪多肽含量的测定
采用福林酚法对黄芪多肽进行测定。
多肽含量（%）=多肽量/总蛋白含量×稀释倍数×100
5.黄芪多肽活性的测定
参考国家食品药品监督管理局国家药品标准《T细胞活性测定-脱E受体法》测定所制得药液中黄芪多肽的活性。
黄芪多肽活性＝供试品测定管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率
6.含量测定结果见表2
表2实施例7-9及对比例1-2测试含量对比
从表2可以看出，采用本发明制备注射液时，黄芪多糖和黄芪多肽的提取率都比较高，其中多糖得率可达到10.06%，是传统水提醇沉法（对比例1和2）的5倍左右；总蛋白的得率均在0.105%以上，远远高于传统水提醇沉法（对比例1和2），其中分子量≤10KDa的多肽占85%以上，其得率最高可达0.125%，本发明制得黄芪多肽得率和活性均远远高于传统水提醇沉法所得（对比例1和2）。
实施例10 黄芪注射液临床试验（以AA+肉仔鸡为例）：
10.1试验药物制备：按照上述实施例7和对比例1方法，制得黄芪注射液，分别命名为药物1（每ml含有黄芪多糖60mg、黄芪多肽12.0mg）和药物2（每ml含有黄芪多糖60mg），各用药组鸡只按照黄芪多糖每kg体重20mg注射给药。
10.2.试验动物及处理：选取270羽健康的1日龄艾拔益加肉鸡（AA+肉仔鸡），随机分成试验组、对照组和空白组，每组3个重复，每个重复30只。试验组、对照组分别于开口和免疫期间注射用药，试验组用药为药物1，对照组用药为药物2，空白组仅使用开口药，不做其它处理，试验周期为42d。
常规日常管理，采用笼养方式进行饲养，自由采食和饮水。免疫程序：7d采用新支-H120疫苗(厂商：乾元浩生物股份有限公司)滴鼻点眼，21d采用新城疫La Sota疫苗（厂商：乾元浩生物股份有限公司）滴鼻点眼。用药程序：1）开口用药：2～4d，试验组和对照组配合牧翔菌特威（厂商：河南牧翔动物药业有限公司）作为开口药。空白组仅使用开口药；2）免疫同期用药：7～8d，新支H120饮水，配合肌肉注射给药；20～21d，新城疫La Sota饮水，配合肌肉注射给药。各免疫用药阶段均采用集中饮水，4h内饮完。
10.3结果评价
10.3.1本发明对ND-HI抗体水平影响
每组鸡群分别于第6、14、21、28、35、42天样品采集前停饲8h，正常供水。随机选取大小接近的10只鸡，进行鸡只翅下静脉采血0.3～0.5ml，37℃温箱静置30min后，2000r/min离心分离血清，4℃冰箱保存。
将各采血样本采用血凝抑制试验（HI）测定新城疫（ND）抗体效价。计算各组平均抗体滴度。结果如下：（试验数据均以平均值+标准差表示）
表3 各组不同时间ND-HI 血清抗体效价 单位：log2
注：同行数据肩标相邻字母表示差异显著(P<0.05)，肩标为相间字母者表示差异极显著(P<0.01)。肩标为相同字母者表示差异不显著(P＞0.05)。
从表3可见：首免前（6d）/首免后7日（14d），各组抗体水平相当；首免后14日（21d），试验组抗体滴度高于对照组和空白组，但差异不显著；二免后7日（28d），试验组和对照组抗体水平均高于空白组，差异显著。试验组和对照组差异不显著；二免后14日（35d），试验组抗体滴度高于对照组，差异显著，明显高于空白组，差异极显著。对照组与空白组差异不显著；二免后21日（42d），试验组抗体滴度明显高于空白组，差异极显著，略高于对照组，差异显著。对照组高于空白组，差异显著。说明实施例7所制得黄芪注射液能明显提升肉仔鸡的抗体水平，效果优于对照例1所制得药物。
10.3.2本发明对鸡只免疫器官指数影响
分别在20d、42d，从各组随机抽取6只鸡空腹称重，采血后剖杀，剥离胸腺、脾脏和法氏囊，用滤纸吸净脏器表明液体，称重。
免疫器官指数（g/kg）=免疫器官质量/剖杀前空腹活体质量
结果如下：
表4实施例7和对比例1药物对AA+肉仔鸡免疫器官指数的影响 单位：g/kg
注：同行数据肩标相邻字母表示差异显著(P<0.05)，肩标为相间字母者表示差异极显著(P<0.01)。肩标为相同字母者表示差异不显著(P＞0.05)。
从表4可见：1）20d试验组与空白组相比，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数分别高4.12%、10.71%和9.64%，其中胸腺指数差异不显著，脾脏指数差异显著，法氏囊指数差异极显著。试验组与对照组先比，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数分别高3.06%、6.90%和3.35%，其中法氏囊指数差异显著；42d试验组与空白相比，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数分别高6.98%、8. 45%和9.50%，其中脾脏指数差异极显著，法氏囊指数差异显著。试验组与对照组相比，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数分别高5.99%、0.65%和3.92%。说明实施例7所制得黄芪注射液能明显提高肉鸡免疫器官指数，效果优于对比例1制得药物。
本发明对雏鸡开口配合牧翔菌特威（阿莫西林可溶性粉）提高7日龄健雏率的测定
自1日龄起，每日记录病死鸡只数量，至7日龄，淘汰弱病雏，计算各组健雏率。
健雏率=（雏鸡总数-淘汰鸡只数）/雏鸡总数×100%。
结果如下：
表5 实施例7和对比例1药物对AA+肉仔鸡7日龄健雏率的影响
注：同行数据肩标相邻字母表示差异显著(P<0.05)，肩标为相间字母者表示差异极显著(P<0.01)。肩标为相同字母者表示差异不显著(P＞0.05)。
从表5可见，试验组药物配合牧翔菌特威作为开口药，较对照组和空白组健雏率分别提高4.45个百分点和6.67个百分点，较对照组差异显著，较空白组差异极显著。说明实施例7（试验组）所制得黄芪多肽注射液能明显提高肉仔鸡7日龄健雏率，效果明显优于对比例1（对照组）所制得药物。
本发明对平均日采食量、平均日增重以及料肉比影响
每日记录各组鸡只总采食量，并于20d、42d，称取全部鸡只空腹重量。
结果如下：
表6 实施例7和对比例1药物对AA+肉仔鸡生产性能的影响
注：同行数据肩标相邻字母表示差异显著(P<0.05)，肩标为相间字母者表示差异极显著(P<0.01)。肩标为相同字母者表示差异不显著(P＞0.05)。
从表6可见，1）在1～20d阶段，试验组鸡群平均日采食量、平均日增重量均明显高于对照组和空白组，差异均极显著。料肉比高于对照组和空白组，差异显著；2）在21～42d阶段，试验组鸡群日平均采食量高于对照组，差异显著，且明显高于空白组，差异极显著。平均日证重量、料重比均高于试验组和空白组，差异显著；3）在整个生产周期内（1～42d），试验组鸡群平均日采食量、平均日增重量均明显高于对照组和空白组，差异极显著。料重比高于试验组和空白组，差异显著。其中特别值得注意的是：1～42d，与空白组相比，试验组平均日采食量提高了7.59%，平均日增重量提高了13.82%，料肉比降低了5.47%。以上数据说明实施例7所制得黄芪注射液能明显提升肉仔鸡生产性能，效果优于对比例1制得药物。
实施例11
兽用黄芪制剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽；其剂型为口服液，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽，每ml口服液中含有黄芪多糖40mg、黄芪多肽8.0mg。
其制备方法同实施例1，不同的是，步骤1）中加入果胶酶和纤维素进行水解的温度为40℃，水解pH为4.0，水解时间为1h；步骤2）中加入A.S1398中性蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为8.0，酶解时间为1h。
实施例12
兽用黄芪制剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽；其剂型为口服液，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽，每ml口服液中含有黄芪多糖60mg、黄芪多肽8.0mg。
其制备方法同实施例1，不同的是，步骤1）中加入果胶酶和纤维素进行水解的温度为55℃，水解pH为6.5，水解时间为1.5h；步骤2）中加入A.S1398中性蛋白酶的酶解温度为35℃，pH为6.0，酶解时间为1.5h。
实施例13
兽用黄芪制剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽；其剂型为黄芪粉剂，其活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽，其中含有黄芪多糖与黄芪多肽的重量比为10：1.0。
其制备方法同实施例1，不同的是，将步骤5）中得到的黄芪多肽浓缩液进一步冷冻干燥制成粉末和步骤6）中四次醇沉、洗涤后经喷雾干燥制得黄芪多糖粉，然后按黄芪多糖与黄芪多肽的重量比制成粉剂。
Claims (3)
1.一种兽用黄芪制剂的制备方法，其特征在于，所述黄芪制剂的活性成分为黄芪多糖和黄芪多肽，所述黄芪多糖和黄芪多肽的重量组成为：黄芪多糖10 ～ 60 份、黄芪多肽1.0～ 12.0份，其制备方法包括以下步骤：
1）黄芪粉碎后加10 ～ 20 倍重量的水，并加入果胶酶和纤维素酶进行水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
2）对步骤1）所得液相分离物进行醇沉，分别收集上清液和沉淀物；
3）合并步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物并加水分散，加入中性蛋白酶进行进一步水解，水解后，酶灭活，固液分离，分别收集液相分离物和固相分离物；
4）合并步骤2）的醇沉上清液和步骤3）所得的液相分离物，醇沉，分别收集上清液和沉淀物；
5）对步骤4）所得上清液进行膜分离、浓缩得到黄芪多肽浓缩液；或进一步冷冻干燥成黄芪多肽粉末；
6）将步骤4）所得沉淀物与步骤3）所得固相分离物合并，加水分散，除去不溶物，经氧化脱色处理后，加入乙酸钾后冷藏8 ～ 12h，收集沉淀物，精制，得到黄芪多糖；
7）取步骤5）所得黄芪多肽浓缩液和步骤6）所得黄芪多糖配制成液体制剂，或取步骤5）所得黄芪多肽粉末和步骤6）所得黄芪多糖配成粉剂；
步骤1）中所述果胶酶的用量为黄芪重量的0.05 ～ 0.2wt%，所述纤维素酶为Onozuka型纤维素酶，其用量为黄芪重量的0.5 ～ 2wt%，水解温度为40 ～ 55℃，水解pH 为4.0 ～6.5，水解时间为1 ～ 2h；
步骤3）中所述中性蛋白酶为A.S1398 中性蛋白酶，其加入量为步骤2）所得醇沉沉淀物与步骤1）的固相分离物总重的0.05 ～ 0.1wt%，酶解温度为33 ～ 37℃，pH 为6.0 ～8.0，酶解时间为1 ～ 2h。
2.如权利要求1 所述兽用黄芪制剂的制备方法，其特征在于，步骤5）中所述膜分离控制黄芪多肽的分子量≤ 10KDa。
3.如权利要求1 所述兽用黄芪制剂的制备方法，其特征在于，步骤6）中所述精制操作为：将收集到的沉淀物经去离子水洗涤，配成20 ～ 35% 水溶液，再经透析、醇沉、洗涤处理，制得精制黄芪多糖浓溶液；或进一步经喷雾干燥制得黄芪多糖粉，所述精制操作中醇沉次数至少为三次。
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