CN108685978A - 一种用于提高免疫力的中药提取物及其制备方法 - Google Patents

一种用于提高免疫力的中药提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于提高免疫力的中药提取物的制备方法，包括如下步骤：(a)取罗勒在水中加热，形成第一混合物；(b)过滤第一混合物，取滤液离心，取上清，形成第二混合物；(c)乙醇中醇沉第二混合物，离心，弃上清，得到初级罗勒提取物；(d)脱脂纯化所述初级罗勒提取物，得到次级罗勒提取物；(e)除去所述次级罗勒提取物中的蛋白，得到罗勒提取物粗品。通过该方法所制备的中药提取物能够现住地提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，进而提高小鼠的免疫力。

Description

一种用于提高免疫力的中药提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于医学领域，涉及一种用于提高免疫力的中药提取物及其制备方法。
背景技术
疏毛罗勒(Ocimum basiliam Linn var.ppilosum(wild.)Benth)，一年生草本植物，为唇形科植物，是一种药食两用植物，全草入药，治胃肠胀气、消化不良、肠炎腹泻、外感风寒、跌打损伤瘀肿、风湿性关节炎等疾病，可广泛应用于食用、食品工业、日用化工和医药保健等方面，目前在河南、安徽淮河以北多有种植。罗勒多糖是其中重要的生物活性物质，而目前对罗勒多糖的研究主要集中在肿瘤浸润、转移、抗血栓抗氧化等相关方面[1]，罗勒多糖用在对巨噬细胞影响方面鲜有报道。
巨噬细胞(Macrophages)属于免疫细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)，主要功能是吞噬细胞残片及病原体，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应，促进机体康复[2-3]。
参考文献:
[1]朱庆均，闫丹丹，张成华，等.罗勒多糖抑制TGF-β诱导的A549细胞侵袭运动能力研究.
[2]康峰:灵芝多糖对长期运动大鼠巨噬细胞吞噬功能及NO和IL-1β表达的影响[J].动物医学进展,2017,38(6):61-65.
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[4]国果,吴建伟,付萍,等.家蝇幼虫分泌物对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响[J].时珍国医国药,2011,22(10):2450-2451.
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明探究了罗勒多糖对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响，为罗勒新的药用价值的开发提供理论参考。
较为具体地，本发明第一方面提供了一种用于提高免疫力的中药提取物的制备方法，所述中药提取物的活性成分来自罗勒。
在一些事实方式中，所述罗勒是疏毛罗勒。
在一些事实方式中，所述中药提取物的活性成分来自罗勒的多糖。
在一些事实方式中，所述提高免疫力是提高巨噬细胞吞噬活力，或通过提高巨噬细胞吞噬活力引起或介导的免疫效应，或巨噬细胞吞噬异体物质引起或介导的免疫效应。
在一些事实方式中，所述中药提取物的制备方法包括如下步骤：
(a)取罗勒在水中加热，形成第一混合物；
(b)过滤所述第一混合物，取滤液离心，取上清，形成第二混合物；
(c)乙醇中第一次醇沉所述第二混合物，离心，弃上清，得到初级罗勒提取物。
在一些事实方式中，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：
(d)脱脂纯化所述初级罗勒提取物，得到次级罗勒提取物。
在一些事实方式中，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：
(e)除去所述次级罗勒提取物中的蛋白，得到罗勒提取物粗品。
在一些事实方式中，在步骤(a)之前，先将罗勒粉碎待用；和/或
在步骤(a)之前，先将罗勒粉末在水中浸泡，优选，12-36h，
更优选，24h；和/或
在步骤(a)中，85-95℃加热0.5-2h，
优选，90℃加热1h；和/或
在步骤(b)中，3000-4000r/min离心10-20min，
优选，3500r/min离心15min；和/或
在步骤(c)中，加入所述第二混合物2-6倍体积无水乙醇，2-6℃低温静置12-36h醇沉，3000-4000r/min下离心10-20min，弃上清液；
优选，加入所述第二混合物4倍体积无水乙醇，4℃低温静置24h醇沉，3500r/min下离心15min，弃上清液；和/或
在步骤(d)中，依次用无水乙醇、无水丙酮、无水乙醚纯化所述初级罗勒提取物；和/或
在步骤(e)中，取所述次级罗勒提取物溶液，加入Sevag液，形成第三混合物，离心所述第三混合物，收集上清液，对离心所述第三混合物形成的所述上清液用乙醇第二次醇沉，形成第四混合物，离心所述第四混合物，取沉淀物，其中，所述Sevag液的成分为体积比为3-5:1优选4:1的氯仿与戊醇混合液；
优选，所述次级罗勒提取物溶液是用蒸馏水溶解所述初级罗勒提取物得到的；
优选，所述离心所述第三混合物的条件为3000-4000r/min离心3-10min，更优选3500r/min离心5min；
优选，所述离心所述第三混合物之前对所述第三混合物进行振摇；
优选，所述第二次醇沉的条件为70-90％的乙醇在2-6℃下静置12-36h，更有选所述第二次醇沉的条件为80％的乙醇在4℃下静置24h；
优选，所述离心所述第四混合物的条件为3000-4000r/min离心3-10min，更优选3500r/min离心15min；
优选，将离心所述第四混合物得到的沉淀物在40-60℃优选50℃水浴锅中蒸发，然后干燥至恒重。
本发明第二方面提供了一种用于提高免疫力的中药提取物，所述中药提取物是通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到的。
本发明第三方面提供了一种用于提高免疫力的组合物，所述组合物含有通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到的中药提取物。
本发明提取疏毛罗勒多糖，研究其不同浓度对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力的影响。用不同浓度的罗勒多糖(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)处理小鼠腹腔巨噬细胞，用中性红法测定罗勒多糖对巨噬细胞的吞噬活力。结果显示随着罗勒多糖浓度的升高，巨噬细胞的吞噬活力增强，当罗勒多糖浓度达到100μg/mL时，与对照组相比达到极显著水平(P<0.01)。综上所述罗勒多糖可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。
附图说明
图1为罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力的影响柱状图，其中，*表示与对照组相比，P＜0.05，**表示与对照组相比P＜0.01。
图2为不同浓度的罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响曲线图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
1材料与方法
1.1实验材料
昆明小白鼠(购于安徽医科大学动物饲养中心)；疏毛罗勒(购于阜阳农贸市场，为4月份采摘，经阜阳师范学院生物与食品工程学院鉴定，洗净晾干)；低糖DMEM培养液(Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青)；中性红(天津市河北区海晶精细化工厂)；CO2培养箱(FormaScientific公司)；全自动酶标仪(Bio-Tek公司)；自动双重纯水蒸馏器(MERCK MILLIPORE公司)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)。
1.2实验方法
1.2.1罗勒多糖的提取
采用水煮醇沉法：取阴干的疏毛罗勒，粉碎机粉碎待用。称取40g疏毛罗勒粉末加200mL蒸馏水浸泡24h，90℃加热1h，纱布过滤，取滤液3500r/min离心15min，取上清液，加入4倍体积无水乙醇，4℃低温静置24h醇沉，3500r/min下离心15min，弃上清液，先后依次用无水乙醇、无水丙酮、无水乙醚脱脂纯化离心所得沉淀物，用蒸馏水溶解脱脂纯化沉淀物(不离心)，得粗多糖初提液，
用Sevag法去除蛋白[Sevag液为氯仿:戊醇＝4:1(V:V)]，取4mL粗多糖初提液，加入Sevag液1mL，充分振摇30min，3500r/min离心5min，重复多次，收集上清液，在上清液中加入无水乙醇使乙醇浓度达到80％，4℃低温静置24h醇沉，3500r/min离心15min，沉淀物在50℃水浴锅蒸发，然后自然晾干至恒重，干品即为罗勒粗多糖。
称100mg溶于10mL的蒸馏水，充分溶解，即为10mg/mL的罗勒多糖溶液。
1.2.2小鼠腹腔巨噬细胞的制备与处理
将小鼠断颈处死，将整只小鼠放入75％的乙醇浸泡2min，放入超净工作台解剖盘内。先把小鼠腹部皮肤剪开一条线，然后双手持镊子撕开皮肤拉向两侧，暴露腹膜，用注射器吸取无菌PBS(pH7.2)4～6mL注入小鼠腹腔，然后轻柔小鼠腹腔5min再吸回PBS注入试管中，1000r/min离心PBS6min，弃上清，重复3次，细胞沉淀用DMEM低糖培养液调整细胞浓度，以2×105～4×105个/cm2的密度接种细胞于96孔板，每孔120μL。放置于37℃、5％CO2培养箱中培养，4h后吸弃培养液并用PBS洗去未贴壁细胞，然后加入罗勒多糖浓度梯度培养液0.5mL(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，放入CO2培养箱中继续培养。
1.2.3中性红法测定巨噬细胞吞噬活性[4]
罗勒多糖浓度梯度培养液培养48h后每孔加入100μL的0.1％中性红溶液，继续37℃孵育4h后弃去孔内液体，用PBS液缓慢冲洗3次，然后每孔加120μL细胞裂解液(无水乙醇:冰乙酸＝1:1(V:V))，于微孔振荡器上震荡15min，用酶标仪在490nm处测定吸光度(OD)，以OD值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。计算吞噬率，巨噬细胞吞噬率(％)＝OD实验组/OD对照组×100％。
1.2.4统计学处理
采用统计学的方法，对数据进行分析，文中所用的数据都是以(平均数±标准差)表示，采用SPSS 21.0对实验组和对照组进行显著性差异分析，当P＜0.05时，说明实验组与对照组有显著性差异，其中，当P＜0.01时，说明实验组与对照组之间有极显著差异。
2结果
罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力的影响和不同浓度的罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响的数据参见表1，直观比较参见图1和图2。
由图1可看出，随罗勒多糖浓度升高OD值增大，表明罗勒多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性有促进作用，浓度升到100μg/mL时，与对照组相比达到极显著水平。
由吞噬曲线图2可以看出，罗勒多糖在0～100μg/mL范围内吞噬率明显升高，100μg/ml之后吞噬率增加的缓慢。
表1小鼠巨噬细胞吞噬活力和吞噬率
罗勒多糖浓度(μg/mL) 0 50 100 150 200
OD值 0.357 0.371 0.444 0.473 0.482
巨噬细胞吞噬率(％) 100 104 124 132 135
3讨论
本发明通过小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红颗粒，发现罗勒多糖具有较强的增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，提高机体免疫功能。我们得出，罗勒多糖能够提高机体免疫功能，一是抑制体外病菌，二是提高机体免疫监视。本实验结果证明，罗勒多糖还可以通过增强巨噬细胞的吞噬能力来提高机体免疫监视。
本实验采用的水煮醇沉法提取的罗勒多糖为粗多糖。罗勒多糖能够提高机体免疫监视，并可能成为一种增强免疫的新型药物，本实验也为罗勒多糖药用价值的进一步开发和临床应用提供理论指导。
由此可以推断，罗勒多糖能够提高巨噬细胞吞噬活力，能够通过提高巨噬细胞吞噬活力引起或介导的免疫效应，提高巨噬细胞吞噬异体物质引起或介导的免疫效应。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的
各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于提高免疫力的中药提取物的制备方法，所述中药提取物的活性成分来自罗勒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述罗勒是疏毛罗勒。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的活性成分来自罗勒的多糖。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提高免疫力是提高巨噬细胞吞噬活力，或通过提高巨噬细胞吞噬活力引起或介导的免疫效应，或巨噬细胞吞噬异体物质引起或介导的免疫效应。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的制备方法包括如下步骤：
(a)取罗勒在水中加热，形成第一混合物；
(b)过滤所述第一混合物，取滤液离心，取上清，形成第二混合物；
(c)乙醇中第一次醇沉所述第二混合物，离心，弃上清，得到初级罗勒提取物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：
(d)脱脂纯化所述初级罗勒提取物，得到次级罗勒提取物。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：
(e)除去所述次级罗勒提取物中的蛋白，得到罗勒提取物粗品。
8.如权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，
在步骤(a)之前，先将罗勒粉碎待用；和/或
在步骤(a)之前，先将罗勒粉末在水中浸泡，优选，12-36h，
更优选，24h；和/或
在步骤(a)中，85-95℃加热0.5-2h，
优选，90℃加热1h；和/或
在步骤(b)中，3000-4000r/min离心10-20min，
优选，3500r/min离心15min；和/或
在步骤(c)中，加入所述第二混合物2-6倍体积无水乙醇，2-6℃低温静置12-36h醇沉，3000-4000r/min下离心10-20min，弃上清液；
优选，加入所述第二混合物4倍体积无水乙醇，4℃低温静置24h醇沉，3500r/min下离心15min，弃上清液；和/或
在步骤(d)中，依次用无水乙醇、无水丙酮、无水乙醚纯化所述初级罗勒提取物；和/或
在步骤(e)中，取所述次级罗勒提取物溶液，加入Sevag液，形成第三混合物，离心所述第三混合物，收集上清液，对离心所述第三混合物形成的所述上清液用乙醇第二次醇沉，形成第四混合物，离心所述第四混合物，取沉淀物，其中，所述Sevag液的成分为体积比为3-5:1优选4:1的氯仿与戊醇混合液；
优选，所述次级罗勒提取物溶液是用蒸馏水溶解所述初级罗勒提取物得到的；
优选，所述离心所述第三混合物的条件为3000-4000r/min离心3-10min，更优选3500r/min离心5min；
优选，所述离心所述第三混合物之前对所述第三混合物进行振摇；
优选，所述第二次醇沉的条件为70-90％的乙醇在2-6℃下静置12-36h，更有选所述第二次醇沉的条件为80％的乙醇在4℃下静置24h；
优选，所述离心所述第四混合物的条件为3000-4000r/min离心3-10min，更优选3500r/min离心15min；
优选，将离心所述第四混合物得到的沉淀物在40-60℃优选50℃水浴锅中蒸发，然后干燥至恒重。
9.一种用于提高免疫力的中药提取物，所述中药提取物是通过权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的。
10.一种用于提高免疫力的组合物，所述组合物含有通过权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的中药提取物。
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