CN101961376A - 一种罗勒提取物的精制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种罗勒提取物的精制方法，主要的步骤包括：将罗勒切段约1-2cm，用8-10倍量蒸馏水或60％至95％的乙醇回流或超声提取后，回收溶剂得流浸膏，将流浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，回收各溶剂后，得到罗勒的乙酸乙酯或正丁醇提取物；或将罗勒药材直接放入连续加热回流提取器中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯回流提取，减压浓缩回收溶剂，冷冻干燥后即得罗勒的氯仿或乙酸乙酯提取物。采用超声振荡提取为2-3次，每次30min，使用频率为25Hz，控制温度为＜60℃。精制后的提取物比直接用水或乙醇进行提取的粗提取物具有更好的抗炎、抗血栓等防治心血管疾病的作用。

Description

一种罗勒提取物的精制方法

技术领域

本发明涉及的罗勒药材的提取，尤其是精制后的罗勒提取物，在抗炎及防治血栓形成等心血管疾病的医治中有突出的效果。

背景技术

罗勒Ocimum basilicum L.，英文名称Sweet Basil，是唇形科罗勒属一年生草本植物，《中药大辞典》谓其有疏风解表、化湿和中、行气活血、强心安神、解毒消肿等功效。罗勒作为药用的历史可以追溯到古希腊和罗马时代，其叶水煎剂可用于治疗心血管疾病、糖尿病、疼痛、发烧、呕吐、支气管炎、耳痛、关节炎和哮喘。其叶汁可用于治疗慢性发烧、出血、痢疾和消化不良，也可用于治疗癣菌病和皮肤疾病。

据文献报道，罗勒全草含挥发油，主要成分为丁子香酚(70％)包括：甲基丁子香酚和丁子香素，有助血液循环，加强新陈代谢，令呆滞皮肤恢复健康等作用，与药理学活性有关的成分有：三萜类、生物碱、皂甙和黄酮类等。罗勒的种子含精油(含有约17％亚麻酸和50％以上的亚油酸)。

国内有关罗勒提取精加工方法的披露较少，用于疾病治疗有些报道，如：专利公开号为CN1078644的“丁香罗勒乳膏及其制造工艺和用途”的专利，主要有用于治疗疥疮和阴虱；专利公开号为CN1823913的“复方丁香罗勒制剂”的专利，主要用于治疗腹泻；专利公开号为CN1498625的“罗勒多糖在制备治疗抗肿瘤转移的药品中的应用”的专利，主要用于治疗肿瘤转移等。用于治疗疥疮的丁香罗勒油已被收入中华人民共和国国家标准。但在国内未见罗勒的精制提取及其精制物用于治疗心血管疾病的相关信息。

发明内容

本发明的目的在于：采用该精制的方法，使罗勒提取物产生极好的临床效果，即更好的发挥抗炎、抗血栓作用，为本地药资源的开发提供有价值的实验数据。

本发明的目的是这样实现的：一种罗勒提取物的精制方法，包括以下步骤；

其1将罗勒干草切段1-2cm，用8-10倍量的蒸馏水浸泡1-2h，经超声振荡提取，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为55-70℃；将浓缩液与正丁醇以1∶1体积比实施萃取，用力振摇，静止2-4h后，分离正丁醇层，连续萃取3-4次，合并正丁醇层溶液，置于旋转蒸发仪中减压回收正丁醇，温度为85-100℃；将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒正丁醇提取物；

其2将罗勒干草切段1-2cm，用8-10倍量的75％或95％的乙醇溶液浸泡1h后，经超声振荡提取，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为50-60℃，回收乙醇得流浸膏；用1倍量的蒸馏水溶解浸膏，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，其体积比为1∶1；用力振摇静止2-4h后，分离有机层，继续萃取2-3次，直至无色，合并乙酸乙酯层，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收乙酸乙酯，温度为35-50℃；再将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒乙酸乙酯提取物；其次将回收的乙酸乙酯残液以1∶1体积比继续用正丁醇进行萃取，用力振摇后，静止2-4h，分出正丁醇层，连续萃取3-4次，合并正丁醇层，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收正丁醇，温度为85-100℃；将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒正丁醇提取物；

其3将罗勒干草切段1-2cm，置于连续加热的回流提取器中，并加入8-10倍量石油醚，加热到60-90℃，煎煮2-3次，每次1-3h，弃滤液，将末次残渣的石油醚完全挥发后，加入8-10倍量氯仿，加热到60-70℃，煎煮2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收氯仿，温度为35-50℃；再将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒氯仿提取物；其次将回收的氯仿残渣，加入8-10倍量乙酸乙酯，加热75-90℃，煎煮2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩回收乙酸乙酯，温度为35-50℃；将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒乙酸乙酯提取物。

所述的精制方法，采用超声振荡提取为2-3次，每次30min；使用频率为25Hz，控制温度为＜60℃。

所述的精制方法，精制后的提取物比直接用水或乙醇进行提取的粗提取物具有更好的抗炎、抗血栓等防治心血管疾病的作用。

所述的精制方法，选用的试剂均为市售产品。

本发明来源于国家自然科学基金资助项目，该项目首次研究了新疆罗勒的化学成分，运用HPLC法测定了芦丁的含量，分离得到6个化合物，乙醇提取氯仿可溶部分分离得到了β-谷甾醇、胡萝卜苷、豆甾醇、豆甾醇-3-β-D-葡萄糖苷甾体类化合物；乙醇提取正丁醇可溶部分分离得到了芦丁和槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷黄酮类化合物；并对其基源进行了生药学的初步鉴定，认为新疆罗勒含有腺毛，花冠颜色为紫色，无草酸钙结晶，毛茸类型与其他罗勒有区别；并通过药理学实验发现罗勒的水及乙醇提取物具有抗血栓、调血脂、降血压、保护心脏等防治心血管疾病的作用。

本发明方法的重要精制步骤为：

将以水或乙醇作为溶剂进行提取的罗勒提取物分别用石油醚，氯仿，乙酸乙酯进行萃取，旋转蒸发，回收乙酸乙酯，进行冷冻干燥后，即得到精制的罗勒乙酸乙酯提取物。

将回收的乙酸乙酯残液以1∶1体积比继续用正丁醇进行萃取，旋转蒸发，回收正丁醇，进行冷冻干燥，即得到精制的罗勒正丁醇提取物。

将回收的氯仿残渣，加入8-10倍量乙酸乙酯，加热、煎煮、合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩回收乙酸乙酯，冷冻干燥，即得精制的罗勒乙酸乙酯提取物。

本发明方法是罗勒精制提取物在抗炎及抗血栓作用上明显优于直接用水或乙醇进行提取的粗提取物，在提高药效、减少用药剂量方面显效，在防治心血管疾病方面具有良好的应用前景，彰显技术进步。

具体实施方式

本发明对照实施例作进一步说明。

实施例1

将罗勒干草切段约1cm，用8倍量蒸馏水浸泡1h后，连续超声振荡提取2次，频率为25Hz，温度＜60℃，每次30min，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为60℃；将浓缩液用正丁醇进行萃取，正丁醇与水体积比为1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出正丁醇层，连续萃取3次，合并正丁醇层，置于旋转蒸发仪中减压回收正丁醇，温度为90℃；将浓缩液进行冷冻干燥，其温度为-56℃，时间为24h，即得罗勒正丁醇提取物。

实施例2

将罗勒干草切段约1cm，用10倍量的75％的乙醇溶液浸泡1h后，连续超声振荡提取3次，频率为25Hz，温度＜50℃，每次30min，过滤，合并滤液，减压浓缩温度为56℃，回收乙醇后得流浸膏；用1倍量蒸馏水分散浸膏后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，有机溶剂与的水体积比为1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出有机层，连续萃取，直至有机层最终为无色；最后合并乙酸乙酯层，置于旋转蒸发仪中减压回收乙酸乙酯，温度为40℃；将浓缩液进行冷冻干燥，其温度为-56℃，时间为24h，即得罗勒乙酸乙酯提取物。

实施例3

将实施例2中的罗勒用乙酸乙酯萃取后，将残液继续用正丁醇进行萃取，正丁醇与水的体积比为1∶1，用力振摇后，静止2小时，分出正丁醇层，连续萃取3次，合并正丁醇层，置于旋转蒸发仪中减压回收正丁醇，温度为85℃，将浓缩液进行冷冻干燥，其温度为-56℃，时间为24h，即得罗勒正丁醇提取物。

实施例4

将罗勒干草切碎约1cm，置于连续加热回流提取器中，并加入9倍量石油醚，加热80℃，煎煮3次，每次2h，弃滤液，将末次残渣的石油醚挥发完全后，加入8倍量氯仿加热到65℃，煎煮3次，每次2h，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩回收氯仿，温度为45℃；将浓缩液进行冷冻干燥，其温度为-56℃，时间为24h，即得罗勒氯仿提取物。

实施例5

将实施例4中罗勒残渣的氯仿挥发完全后，加入10倍量乙酸乙酯加热85℃，煎煮2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩回收乙酸乙酯，温度为45℃；浓缩液进行冷冻干燥，其温度为-56℃，时间为24h，即得罗勒乙酸乙酯提取物。

实验动物一组：

用实施例1、2的方法获取罗勒精制提取物；

实验材料：

SD大鼠90只，体重200～250g，雌雄兼半，随机分为9组，即生理盐水组，阿司匹林组(5mg·kg^-1)，复方丹参组(300mg·kg^-1)，OBL-乙醇高、低剂量组，OBL-正丁醇高、低剂量组，OBL-乙酸乙酯高、低剂量组(300、100mg·kg^-1)，每组10只。

实验步骤：

大鼠灌胃给药，给药容量为10ml·kg^-1，每天给药1次，连续给药15d，末次给药1h后摘取眼球取血，用3.8％枸橼酸钠按照取血量与抗凝剂9∶1抗凝处理，1000r/min离心5min，吸出上层富含血小板血浆(PRP)，余下的血液3000r/min离心10min，制备贫血小板血浆(PRP)，使血小板数至(350～450)×10⁹/L，取0.2ml PRP至比浊管中，37℃温育5min，随后在PRP中加入一定量的ADP或凝血酶，采用LBY-NJ血液凝聚仪测定对照管和测试管5min内的最大聚集率，计算出药物对血小板聚集的抑制率，其聚集的抑制百分率＝(生理盐水组聚集百分率-各给药组聚集百分率)/生理盐水组聚集百分率×100％。

数据用SPSS统计软件处理，所有结果用表示，采用单因素方差分析和SNK两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

本发明提取物对ADP、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集的影响，见表1。

表1

注：与生理盐水组比较：^▲P＜0.01

上表数据表明：与生理盐水组相比，罗勒各给药组对ADP和凝血酶诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用(P＜0.01)，其中正丁醇及乙酸乙酯提取部位的作用强度明显高于阿司匹林和复方丹参组，对ADP、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集的抑制率分别为51.99％、61.56％，56.68％、63.60％，均高于乙醇组，表明维药罗勒正丁醇及乙酸乙酯提取部位对大鼠ADP和凝血酶诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用，可明显降低血小板聚集率，抑制血小板依赖性血栓的形成。

实验动物二组：

用实施例1、2的方法获取罗勒精制提取物；

实验材料：

SD大鼠90只，体重250～300g，雌雄兼半，随机分为9组，即生理盐水组，阿司匹林组(5mg·kg^-1)，复方丹参组(300mg·kg^-1)，OBL-乙醇高、低剂量组，OBL-正丁醇高、低剂量组，OBL-乙酸乙酯高、低剂量组(300、100mg·kg^-1)，每组10只。

实验步骤：

大鼠灌胃给药，给药容量为10ml·kg^-1，每天给药1次，连续给药12d，实验前禁食12h，给药后1h进行实验。给鼠腹腔注射1.5％戊巴比妥钠35mg/kg麻醉，仰卧位固定于手术板上，颈部正中切口，分离气管，并分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉，取一根由三段聚乙烯管组成的套管，中段放入一根长7cm已称重的4号手术丝线，将肝素生理盐水溶液(50U·ml^-1)充满聚乙烯管，结扎左颈外静脉远心端，以眼科剪小心于颈外静脉远心端剪开一小口，小心将聚乙烯管插入，1号手术丝线结扎固定；结扎右颈总动脉远心端，以动脉夹夹闭近心端，以眼科剪于右颈总动脉远心端剪开一小口，小心将聚乙烯管插入，以1号手术丝线结扎固定。打开动脉夹，(将聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，另一端塑料管注入肝素(50U·ml^-1)0.2ml抗凝，然后再将此端插入右侧颈总动脉)让血液从右侧颈总动脉流入聚乙烯管内，返回左侧颈外静脉，血小板遇丝线聚集形成血栓。动-静脉血流旁路开放15min后，中断血流，迅速取出丝线称重(湿重)，60℃干燥1h，冷却后立即称重，总重量减去丝线重量，即为血栓干重，并计算血栓抑制率，其抑制率＝(生理盐水组血栓干重-给药组血栓干重)/生理盐水组血栓干重×100％。

数据用SPSS统计软件处理，所有结果用表示，采用单因素方差分析和SNK两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

本发明提取物对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响见表2

表2

注：与生理盐水组比较：*P＜0.01；与阿司匹林组比较：*P＜0.05；与复方丹参组比较：^▲P＜0.05  ^▲▲P＜0.01

上表数据表明：各给药组均可使大鼠血栓重量显著减轻，与生理盐水组相比有显著性差异(P＜0.01)；其中OBL-乙酸乙酯高组与两种阳性药物组比较均有显著性差异(P＜0.05)，其血栓干重抑制率为57.9％；OBL-正丁醇高组与复方丹参组比较有显著性差异(P＜0.05)，罗勒正丁醇提取部位高低剂量均对血栓的抑制作用有较好的效果，其血栓干重的抑制率分别为48.3％、41.1％。表明维药罗勒的正丁醇及乙酸乙酯提取部位较其乙醇粗提取物具有更好的防治血栓形成的作用。

实验动物三组：

用实施例2、3的方法获取罗勒精制提取物；

实验材料：

取昆明种小鼠132只，体重为18-22g，雌雄各半，每组12只，随机分为11组，即空白对照组，阿司匹林组(50mg·kg^-1)，罗勒水提取物高、中、低剂量组，OBL-乙酸乙酯高、中、低剂量组(400、200、100mg·kg^-1)，OBL-正丁醇高、中、低剂量组(400、200、100mg·kg^-1)。

实验步骤：

小鼠灌胃给药，每天给药1次，连续给药7d，末次给药时，分别将每只小鼠右耳外侧均匀涂抹二甲苯0.2ml，左耳不涂，1h后脱颈处死，于左右耳同一部位用直径9mm的虹膜环冲下耳片，称取耳片重量，两耳片之差为其肿胀度，计算出各药对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率，其抑制率＝(空白对照组两耳重量差-给药组两耳重量差)/空白对照组两耳重量差×100％。

数据用SPSS16.0统计软件处理，所有结果用

表示，采用单因素方差分析和SNK两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

本发明提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

见表3

表3

与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

上表数据表明，与空白对照组比较，阿司匹林组，罗勒水提物高剂量组，OBL-乙酸乙酯高、中、低剂量组，OBL-正丁醇高剂量组均有显著性差异(P＜0.05)，OBL-乙酸乙酯高、中、低剂量的抑制率分别为63.24％，58.97％，56.40％，OBL-乙酸乙酯高剂量组与阿司匹林组比较，其抑制作用较强。表明维药罗勒提取物可抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀，产生抗炎的作用，其中乙酸乙酯萃取部位具有更好的抑制效果。

实验动物四组：

用实施例2的方法获取罗勒提取物；

实验材料：

取昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机分为4组，每组12只，即空白组，地塞米松组，OBL-乙酸乙酯高、低剂量组。

实验步骤：

小鼠灌胃给药，每天给药1次，连续给药7d。于末次给药1h后，每只小鼠右后肢用游标卡尺测右足跖厚度，然后皮下注射1％角叉菜胶混悬液致炎，并分别在致炎后1，2，4，6h用游标卡尺测右足跖厚度。

数据用SPSS16.0统计软件处理，所有结果用

表示，采用单因素方差分析和SNK两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

本发明提取物对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响

见表4

表4

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与地塞米松组比较：^▲P＜0.05

上表数据表明：与空白组比较，OBL-乙酸乙酯高、低剂量组在致炎后1，2，4，6h均有显著的抑制足跖肿胀的作用(P＜0.01)，与地塞米松组比较，在4h时有明显差异(P＜0.05)。OBL-乙酸乙酯高、低剂量组抑制足跖肿胀的效果一致。表明维药罗勒乙酸乙酯萃取部位可明显地抑制角叉菜胶所致的小鼠足肿胀，产生抗炎作用。

实验动物五组：

用实施例2的方法获取罗勒精制提取物；

实验材料：

取昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机分为4组，每组12只，即空白对照组，地塞米松组，OBL-乙酸乙酯高，低剂量组。各组动物戊巴比妥钠麻醉，无菌操作方式下在小鼠腋下植入棉球(每个棉球重量为30mg，高压灭菌后60℃烤箱烘干)。

实验步骤

小鼠灌胃给药，连续10d，末次给药后将小鼠1％戊巴比妥钠0.03ml/10g麻醉，取出棉球，剥离肉芽组织，置60℃烤箱烤至恒重。计算棉球肉芽干重及抑制率；棉球肉芽干重＝植入棉球肉芽肿重量-植入棉球重量；抑制率＝(空白对照组棉球肉芽干重-给药组棉球肉芽干重)/空白对照组棉球肉芽干重×100％。

数据用SPSS16.0统计软件处理，所有结果用

表示，采用单因素方差分析和SNK两两比较，P＜0.05为有统计学意义。

本发明提取物对小鼠棉球肉芽肿形成的影响

见表5

表5

与空白对照组比较：*P＜0.01；

上表数据表明：与空白对照组比较，地塞米松组，OBL-乙酸乙酯高、低剂量组均能显著性地抑制肉芽肿的形成(P＜0.01)；与地塞米松组比较，无明显差异(P＞0.05)，表明罗勒乙酸乙酯提取部位与地塞米松发挥了同样的抗炎效果，且其低剂量也具有明显的抗炎效果。

综上所述：研究结果表明罗勒提取物对胃粘膜刺激较小，并具有一定的胃粘膜保护作用，具有重要的临床意义。

Claims (4)

1.一种罗勒提取物的精制方法，其特征在于：包括以下步骤；

其1将罗勒干草切段1-2cm，用8-10倍量的蒸馏水浸泡1-2h，经超声振荡提取，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为55-70℃；将浓缩液与正丁醇以1∶1体积比实施萃取，用力振摇，静止2-4h后，分离正丁醇层，连续萃取3-4次，合并正丁醇层溶液，置于旋转蒸发仪中减压回收正丁醇，温度为85-100℃；将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒正丁醇提取物；

其2将罗勒干草切段1-2cm，用8-10倍量的75％或95％的乙醇溶液浸泡1h后，经超声振荡提取，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，温度为50-60℃，回收乙醇得流浸膏；用1倍量的蒸馏水溶解浸膏，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，其体积比为1∶1；用力振摇静止2-4h后，分离有机层，继续萃取2-3次，直至无色，合并乙酸乙酯层，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收乙酸乙酯，温度为35-50℃；再将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒乙酸乙酯提取物；其次将回收的乙酸乙酯残液以1∶1体积比继续用正丁醇进行萃取，用力振摇后，静止2-4h，分出正丁醇层，连续萃取3-4次，合并正丁醇层，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收正丁醇，温度为85-100℃；将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒正丁醇提取物；

其3将罗勒干草切段1-2cm，置于连续加热的回流提取器中，并加入8-10倍量石油醚，加热到60-90℃，煎煮2-3次，每次1-3h，弃滤液，将末次残渣的石油醚完全挥发后，加入8-10倍量氯仿，加热到60-70℃，煎煮2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收氯仿，温度为35-50℃；再将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒氯仿提取物；其次将回收的氯仿残渣，加入8-10倍量乙酸乙酯，加热75-90℃，煎煮2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩回收乙酸乙酯，温度为35-50℃；将浓缩液进行冷冻干燥，即得罗勒乙酸乙酯提取物。

2.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于：采用超声振荡提取为2-3次，每次30min；使用频率为25Hz，控制温度为＜60℃。

3.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于：精制后的提取物比直接用水或乙醇进行提取的粗提取物具有更好的抗炎、抗血栓等防治心血管疾病的作用。

4.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于：选用的试剂均为市售产品。