CN111153972B - 蓝萼香茶菜糖蛋白xps10-1、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10‑1，其包含多糖和蛋白质，其中，所述多糖的单糖组成包括鼠李糖和葡萄糖，所述蛋白质的氨基酸组成包括谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。本发明还涉及了其制备方法及用途，所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10‑1可以用于制备色氨酸2,3双加氧酶抑制剂。

Description

蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及提取植物提取领域；具体涉及一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1、其制备方法及用途。
背景技术
蓝萼香茶菜为毛叶香茶菜的原变种(拉丁名Rabdosia japonica(Burm.f.)Hara)，为唇形科(Labiatae)香茶菜属(Isodon)植物。胃复春片是由上药集团旗下胡庆余堂研制的纯中药制剂，处方含有香茶菜、枳壳及红参，以香茶菜(质量占比86.8％)为主，蓝萼香茶菜为胃复春中香茶菜的主要药材来源之一。胃复春片能够健脾益气、活血解毒，主治胃癌的前期病变，对慢性萎缩性胃炎、肠腺化生、肠上皮不典型性增生有治疗作用，此外还有助于胃癌术后辅助治疗。胃复春片是国内唯一经药品监督部门批准的，治疗胃癌前期病变的国家中药保护品种。鉴于胃复春片良好的药效作用，但物质基础尚不明确。目前对蓝萼香茶菜的化学成分研究也主要集中在小分子上，如从蓝萼香茶菜中分离出二萜、三萜、黄酮、有机酸、甾醇等成分，但蓝萼香茶菜中大分子成分却鲜有报道。
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种免疫抑制酶，其通过犬尿氨酸途径催化L-色氨酸分解代谢的限速酶。在哺乳动物中，通过裂解色氨酸吲哚环的2,3-双键发生的反应由IDO1、IDO2和TDO独立催化，这些酶存在组织表达和底物特异性的差异。目前IDO介导的免疫耐受被广泛接受作为肿瘤进化得以逃逸免疫监视的重要机制之一，并且IDO抑制剂已被认为是癌症治疗的潜在突破方法。本文我们以IDO抑制活性为前提对蓝萼香茶菜进行活性跟踪分离，拟发现新的IDO抑制剂，并为阐明蓝萼香茶菜及胃复春片的化学物质基础提供依据。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其包含多糖部分和蛋白质部分，其中，所述多糖部分的单糖组成包括鼠李糖和葡萄糖，所述蛋白质部分的氨基酸组成包括谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
优选地，所述多糖部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS5-1的质量分数为10～40％，所述蛋白质部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS5-1的质量分数为60～90％；更优选地，所述多糖部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为24～34％，所述蛋白质部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为66～76％；进一步优选地，所述多糖部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为24.7～34.2％，所述蛋白质部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为69.8～75.3％。
优选地，单糖组成中鼠李糖和葡萄糖的摩尔比为10:(1.5～3)；进一步优选为10:(2.0～2.5)；
优选地，所述氨基酸组成中谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸的摩尔比为(7～9):(2～5):10.0；更优选为(8～9):(3～4):10.0；进一步优选为(8.03～8.14):(3.35～3.86):10.0。
进一步优选地，所述单糖组成中还包含半乳糖、甘露糖和木糖中的一种或多种。
优选地，所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的相对平均分子量为6000～12000Da，优选为6125～10259Da。
本发明还提供了一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的制备方法，其包括如下步骤：
(1)取蓝萼香茶菜，加水煎煮，收集滤液，加入乙醇醇沉，静置后取乙醇沉淀物，干燥得到粗多糖XPS；
(2)粗多糖XPS过阴离子交换树脂，用0.8～1.0M NaCl洗脱，得到洗脱组分XPS10；
(3)将洗脱组分XPS10以0.1～0.3M NaCl为流动相，经分子筛凝胶柱层析，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
优选地，步骤(2)中在用0.8～1.0M NaCl洗脱之前，还包括用0.1～0.5M NaCl洗脱。
优选地，步骤(2)所述0.8～1.0M NaCl为1.0M NaCl。
优选地，本发明还提供了一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的制备方法，其包括如下步骤：
(1)取蓝萼香茶菜，加水煎煮，收集滤液，加入乙醇醇沉，静置后取乙醇沉淀物，干燥得到粗多糖XPS；
(2)粗多糖XPS过阴离子交换树脂，用水、0.1M NaCl、0.2M NaCl、0.5M NaCl和1.0MNaCl依次洗脱，收集1.0M NaCl的洗脱组分XPS10；
(3)将洗脱组分XPS10以0.2M NaCl为流动相，经分子筛凝胶柱层析，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
其中，
步骤(1)所述乙醇的体积分数优选为80～100％，更优选为95％；加入乙醇后，乙醇与滤液的体积比优选为2:1～5:1，更优选为4:1；
步骤(1)所述的干燥优选为真空干燥，干燥温度优选为65～70℃；
步骤(1)所述蓝萼香茶菜与水的质量比优选为1:5～1:20；煎煮时间优选为1～4小时；静置时间优选为24～72小时；
步骤(2)所述阴离子交换树脂为DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂；
步骤(3)所述分子筛凝胶柱层析为Superdex 75分子筛凝胶柱层析。
本发明还提供了上述制备方法得到的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS5-1；其多糖及蛋白质组成如前所述。
本发明还提供了所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1在制备吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO酶)抑制剂中的用途，尤其是在制备IDO1酶抑制剂中的用途。
L-色氨酸在IDO酶的催化作用下生成L-甲酰犬尿氨酸，L-甲酰犬尿氨酸经三氯乙酸催化后生成犬尿氨酸。犬尿氨酸经二甲氨基苯甲醛显色后在OD480nm处有明显吸收峰。所以可以根据这一特点确定犬尿氨酸的含量，进而反映IDO酶催化反应产物L-甲酰犬尿氨酸的含量。Hela细胞经IFNr诱导后表达IDO酶，而Hela细胞在正常培养条件下，IDO表达量较少，所以可以通过IFNr诱导Hela细胞表达IDO，筛选有效抑制IDO活性的化合物。本发明采用OD480吸光度检测方法，检测化合物对IFNr诱导下Hela细胞表达IDO酶活性的影响。在本发明中，我们在Hela细胞株上对XPS，XPS10和XPS10-1进行了IDO酶抑制活性测试，以评价其对IDO酶活性的抑制活性。结构表明在细胞水平上XPS对IDO酶没有抑制作用，XPS10和XPS10-1对IDO酶具有一定的抑制活性，XPS10-1的抑制活性更强。
由于IDO酶抑制肿瘤局部免疫功能，因此，本发明还提供了所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤包括胃癌、宫颈癌等。
吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)是一种单体血红素酶，其通过犬尿氨酸途径催化L-色氨酸(L-Trp)分解代谢的限速步骤。通过裂解色氨酸吲哚环的2,3-双键发生的反应由IDO1，色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)和吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)独立催化。IDO1和IDO2酶在全身组织中均有表达，研究表明IDO至少可以通过以下三种途径抑制肿瘤局部免疫功能：(1)色氨酸耗竭机制：色氨酸是T细胞增殖所必须的氨基酸，IDO过度表达后必然导致色氨酸缺乏，T细胞发生凋亡；(2)色氨酸代谢物毒性机制：IDO催化色氨酸降解产生的代谢物可抑制活化T细胞功能，甚至诱导T细胞凋亡；(3)IDO还可以通过诱导Treg细胞的增殖来抑制活化T细胞的免疫功能。基于上述IDO功能和实验研究发现抑制IDO能够一定程度上抑制肿瘤的生长，并且增强化疗和抗体药物的抗肿瘤作用，通过抑制IDO可增强T细胞的功能，从而成为一种治疗肿瘤的有效方法。胃复春片是国内唯一经药品监督部门批准的治疗胃癌前期病变的国家中药保护品种，临床研究也发现胃复春可以有效治疗胃癌前期病变，并有助于胃癌术后辅助治疗。本发明采用活性跟踪方法，成功从蓝萼香茶菜中得到一种具有IDO1抑制作用的均一糖蛋白成分XPS10-1，表现出较强的IDO抑制活性，对Hela细胞中IDO酶也有抑制作用。本发明为蓝萼香茶菜的化学物质基础提供依据，鉴于香茶菜为胃复春片中的主要药材，本发明也为胃复春片治疗胃癌前期病变和胃癌术后辅助治疗的适应症提供依据。
附图说明
图1为制备实施例1中洗脱组分XPS经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分离图谱；
图2为制备实施例1得到的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的HPGCP图谱(A)和UV图谱(B)。
具体实施方式
制备实施例1
材料：蓝萼香茶菜(批次号：SPHTCMXCC01)5.0kg来源于安徽凤阳(收集于2015年11月20日)，DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂和Superdex系列分子筛凝胶柱购自通用电气GE Healthcare；普鲁兰多糖P-82标准品套装：P-5,P-10,P-20,P-50,P-100,P-200,P-400,P-800，Shodex；水为超纯水(实验室自制)；抗坏血酸、色氨酸、亚甲蓝、Catalase、二甲氨基苯甲醛、三氯乙酸、单糖标准品(D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖)和三氟乙酸购自SIGMA公司；IDO酶购自BPS公司，384孔化合物板购自Nunc公司；Hela细胞为南京大学李尔广教授处提供，其购自ATCC(货号CCL-2)；DMEM、丙酮酸钠、L-Glutamine、非必需氨基酸、青链霉素购自Life technologies；FBS购自GIBCO；IFNr购自P&D；96孔细胞培养板和96孔显色板购自Corning Costar；乙醇和氯化钠均购自国药集团上海试剂有限公司；95％乙醇是指体积分数95％的乙醇；其它的试剂均为分析纯。
仪器：安捷伦1260系列高效液相色谱仪(包括自动进样器、输液泵、脱气机、DAD检测器、IR检测器及安捷伦Cirrus GPC软件)；安捷伦7890B型气相色谱仪配备7693型三重四级杆质谱仪，
Figure BDA0001857455320000041
-1ms毛细管柱(0.25mm×30m,0.25μm)购自Restek公司；利穗科技多糖分离系统配置Shodex示差折光检测器；电子天平(赛托利斯-SECURA225D)；离心机(SIGMA-3K15)；旋转蒸发仪(BUCHI-Rotavapor R-300)；冷冻干燥机(LABCONCO-4.5L)；纯水仪(密理博REFRENCE)。
蓝萼香茶菜多糖的提取及分离纯化：
(1)蓝萼香茶菜5.0kg，加水50L，煎煮三小时，滤过，将滤渣加水50L，重复煎煮三小时，滤过，合并两次滤液，滤液浓缩至适当体积，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇醇沉，过夜。上清液减压浓缩，65℃-70℃真空干燥，得醇沉上清液干燥粉；乙醇沉淀物冷冻干燥得粗多糖记做XPS(315g，得率6.3％)。
(2)粗多糖XPS经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂通过水、0.2M NaCl、0.5MNaCl和1.0M NaCl流动相洗脱，流速：8.0mL/min，分别对应得到洗脱组分XPSW、XPS2、XPS5和XPS10洗脱部位(图1)；
(3)活性最强洗脱组分XPS10以0.2M NaCl为流动相，经Superdex 75分子筛凝胶柱进行分离，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
制备实施例2
取不同批次的蓝萼香茶菜(批次号：SPHTCMXCC02)，重复制备实施例1的提取及分离纯化方法，得到制备实施例2的蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
制备实施例3
取不同批次的蓝萼香茶菜(批次号：SPHTCMXCC03)，重复制备实施例1的提取及分离纯化方法，得到制备实施例3的蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
测试实施例1XPS10-1纯度和相对分子量测定
采用HPGPC法测定制备实施例1～3得到的蓝萼香茶菜多糖XPS10-1的纯度及相对分子量。称取样品配置成浓度为2mg/mL的溶液，标准品为不同系列普鲁兰多糖，配制成浓度为2mg/mL的混合标准品溶液。色谱柱：UltrahydrogelTM 1000(7.8×300mm)串联UltrahydrogelTM250(7.8×300mm),Waters；流动相：0.2M NaCl；流速：0.8mL/min；柱温：40℃。分别精密吸取标准品与样品溶液各10μL，注入HPGPC进行检测，图谱通过安捷伦CirrusGPC软件数据处理。结果显示XPS10-1的HPGPC谱图呈单一峰(图2)，表明XPS10-1为均一糖蛋白。以不同分子量的普鲁兰多糖为标准品，经Cirrus GPC软件分析测得XPS10-1相对平均分子量如下表1所示：
表1相对分子量测定结果
Figure BDA0001857455320000051
Figure BDA0001857455320000061
测试实施例2单糖组成分析
还原水解法进行糖组成分析，取样品约1～2mg，置15×150mm试管中，加200μL3mol/L三氟乙酸溶液和50μL 4-甲基吗啉硼烷溶液，80℃油浴水解5min，取出加入50μL 4-甲基吗啉硼烷溶液，120℃油浴水解1h，取出。再加入100μL 4-甲基吗啉硼烷溶液，转入25mL梨形烧瓶，60℃水浴减压蒸干，再加2～3mL乙腈蒸干三次，然后加200μL三氟乙酸和200μL乙酸酐，50℃水浴乙酰化10min，加3mL水终止反应，室温放置30min，用5mL氯仿萃取全乙酰化衍生物，氯仿层用水洗三次，无水硫酸钠干燥，然后用氯仿稀释至50mL溶液。
GC-MS程序升温条件：140-198℃(2℃/min)，保持4min，继续升温到217℃(1℃/min)，保持4min，最后升温到250℃(3℃/min)，保持5min，进样口温度为250℃；载气为氦气(体积流量1mL/min)。
GC-MS结果表明XPS10-1主要含鼠李糖和葡萄糖，两种主要单糖的摩尔比如下表2所示：
表2单糖摩尔比测定结果
制备实施例 批次号 单糖摩尔比(鼠李糖：葡萄糖)
制备实施例1 SPHTCMXCC01 10.0:2.2
制备实施例2 SPHTCMXCC02 10.0:2.5
制备实施例3 SPHTCMXCC03 10.0:2.0
测试实施例3蛋白含量测定及氨基酸的组成分析
使用苯酚硫酸法检测，制备实施例1～3得到的蓝萼香茶菜多糖XPS10-1显色明显，表明XPS10-1含糖类成分，BCA法检测XPS10-1显色明显，表明含蛋白或肽段，含量测定得蛋白含量分别如下表3所示，表明XPS10-1为糖蛋白成分。
表3蛋白含量测定结果
制备实施例 批次号 蛋白含量
制备实施例1 SPHTCMXCC01 73.2％
制备实施例2 SPHTCMXCC02 69.8％
制备实施例3 SPHTCMXCC03 75.3％
多肽蛋白的水解：取一定量的XPS10-1样品，转移至水解管中，加入1mL 6N的盐酸，充入N2约10min，密封后放置于Block Heater干式加热器模中，110℃水解反应24h。反应完毕后，将游离氨基酸溶液转移至1.5mL EP管中，抽真空浓缩至干。
氨基酸的衍生化：混合氨基酸标准品的衍生化处理：取25μL混合氨基酸标准品溶液，加入12.5μL 1moL/L三乙胺溶液，混匀，加入12.5μL 0.1M PITC，混匀，室温静置1h，加入100μL正己烷剧烈震荡混合后静置10min，取下层溶液20μL，加入180μL流动相A，混合后用0.22μm滤膜过滤，即得。
样品溶液的衍生化处理：取一定量的游离氨基酸冻干样品，加入适量流动相(0.05M乙酸钠水溶液)，复溶。取25μL样品氨基酸溶液，加入12.5μL 1M三乙胺，后续操作同混合氨基酸标准品的衍生化处理。
样品的检测：将氨基酸衍生物通过岛津高效液相色谱仪进行分离、检测，相关参数如下：流动相A：0.05M乙酸钠水溶液，流动相B：甲醇/乙腈/水(体积比20:60:20)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。仪器系统平衡后，取待测样品注入高效液相色谱仪，按下表中规定的条件进行梯度洗脱。
高效液相色谱数据处理：将氨基酸衍生物通过HPLC进行分离、检测，相关参数如下：色谱柱：DiamonsilAAA氨基酸分析柱(Dikma，250mm×4.6mm,5μM)；流动相A：0.05M乙酸钠水溶液，流动相B：甲醇/乙腈/水(20:60:20)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃，紫外检测波长：254nm。仪器系统平衡后，取待测样品注入高效液相色谱仪，梯度洗脱：0～39min，流动相B占5％～48％；39～40min，流动相B占39％～40％；40～45min，流动相B占100％；45～46min，流动相B占100％～5％；46～60min，流动相B占5％。
XPS10-1样品水解后游离的氨基酸经PITC衍生化处理后，经过高效液相色谱LC-20AT设备的分析，得到的原始数据经过Labsolution(SHIMADZU)经外标法自动积分标峰，计算得制备实施例1～3得到的蓝萼香茶菜多糖XPS5-1中蛋白部分的氨基酸主要由谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸组成，三种氨基酸的摩尔比如下表4所示：
表4氨基酸摩尔比测定结果
制备实施例 批次号 氨基酸摩尔比(谷氨酸：丝氨酸：甘氨酸)
制备实施例1 SPHTCMXCC01 8.14:3.69:10.0
制备实施例2 SPHTCMXCC02 8.03:3.86:10.0
制备实施例3 SPHTCMXCC03 8.09:3.35:10.0
测试实施例4IDO1酶和IDO2酶的体外抑制作用检测
(1)化合物的配制与转移
1)将INCB024360化合物用DMSO配制为10mM的储存液，用MES Buffer稀释储存液，形成化合物初始浓度5倍的使用浓度，使用时稀释5倍，此时DMSO浓度为5×0.5％，酶反应时DMSO终浓度为0.5％；
2)XPSW、XPS2、XPS5、XPS10、XPS10-1(均由制备实施例1制备得到)用灭菌水配制成溶液，浓度为5.0mg/mL，取部分储存液稀释到1.0mg/mL为初始浓度，用灭菌水将之再进行多次3倍梯度稀释进行活性IC50测试：
(2)酶反应阶段
1)配制底物混合液
取0.4M Tris Ph8.0配80mM抗坏血酸维C(a)；用MES Buffer配抗氧化酶保护液(b)，各成分如下：800μM L-色氨酸，9000μnits/mL过氧化氢酶，40μM亚甲蓝；等体积混合a和b配制成底物混合液(c)，各成分浓度如下：40mM抗坏血酸维生素C，400μM L-色氨酸，4500μnits/mL过氧化氢酶，20μM亚甲蓝；
2)用MES将IDO1或IDO2酶稀释为13.33ng/μL；
3)384孔板中加入12.5μL底物混合液c；
4)加入5μL 5倍浓度的各浓度化合物，并设置DMSO和灭菌水对照组；
5)加入7.5μL IDO1或IDO2酶；
6)37℃反应60min；
7)向384孔板中加入5μL三氯乙酸，50℃作用30min，将产物N-甲酰犬尿氨酸转化为犬尿氨酸。
(3)反应终止阶段
每孔加入30μL 2％p-dimethylaminobenzaldehyde(对二甲氨基苯甲醛)(M/V)。
(4)检测与数据处理
将384孔板放于MD Flexstation 3上，进行OD480读数；采用Graphpad Prism 5.0对数据进行Log(inhibitor)vs.response-Variable slope(fourparameters)曲线拟合，计算相应的IC50。
(5)XPS10-1在细胞水平上对IDO酶的抑制作用
(5.1)细胞培养与接种：实验第一天，取对数生长期的第16代Hela细胞，800rpm离心5min；移去培养基，加入完全培养基重悬细胞，计数，每孔铺7000个细胞，100μL体积，培养过夜；
(5.2)第二天，加入终浓度为50ng/mL IFNr诱导，同时加入不同浓度化合物，DMSO的终浓度为0.5％。加IFNr及化合物过程如下：
a)弃细胞上清，加入100μL浓度为100ng/mL IFNr，并设置不含IFNr的blank对照；
b)将10mM化合物用DMSO稀释成200μM；
c)将200μM化合物3倍浓度倍比稀释9个浓度梯度；
d)用完全培养基将不同浓度化合物100倍稀释，此时DMSO浓度为1％，初始化合物浓度为2μM；
e)将10mg/mL的XPS，XPS10和XPS10-1(均由制备实施例1制备得到)分别用灭菌水3倍浓度倍比稀释9个浓度梯度；
f)用完全培养基将不同浓度XPS，XPS10和XPS10-1进行25倍稀释，初始浓度均为400ug/mL；
g)每孔中加入100μL不同浓度待测物，并设置只加入DMSO和灭菌水的对照组；不含IFNr的blank组中，加入1％DMSO和灭菌水；
(5.3)细胞加完化合物后放置于37℃，5％的CO2的条件下培养48小时；
(5.4)第四天，转移140μL细胞培养上清至新的96孔显色板中，每孔加入10μL三氯乙酸，50℃反应30min，2500rpm离心10min，之后取100μL上清至另一96孔显色板中；
(5.5)显色：每孔中加入100μL 2％(M/V)二甲氨基苯甲醛显色，两分钟后于MDFlexstation 3上测OD480读值。
(5.6)按下列公式对化合物的体外抑制活性进行计算：
细胞IDO酶抑制率：抑制率(％)＝(1-(信号值－blank)/(信号值对照-blank))×100％。并根据各浓度的抑制率，采用LOGIT法计算50％抑制浓度(50％inhibitoryconcentration，IC50)。采用Graphpad Prism 5.0对各浓度下的OD480信号值进行Log(inhibitor)vs.response-Variable slope(four parameters)曲线拟合，计算相应的IC50(halfmaximal inhibitory concentration)。
试验结果见表1。
表1蓝萼香茶菜中样品及阳性对照物对IDO1和IDO2酶活性的抑制作用
Figure BDA0001857455320000091
Figure BDA0001857455320000101
表中“-”表示没有检测抑制活性。
实验结果显示香茶菜水提醇沉沉淀部分-粗多糖XPS对IDO1酶的抑制活性较好，IC50为114.1μg/mL，XPS对IDO2酶的抑制活性较差，醇沉上清液干燥粉对IDO1和IDO2酶的抑制活性均较差，因此本发明以IDO1抑制活性为前提，对粗多糖XPS进行进一步的活性跟踪研究，对XPSW、XPS2、XPS5和XPS10进行IDO1酶抑制活性测试，实验结果显示XPS5和XPS10表现出较强的IDO1抑制活性，其中XPS10的活性最强，IDO1酶抑制IC50为165.9μg/mL(表1)，XPS10经Superdex75凝胶纯化后的均一糖蛋白XPS10-1经IDO1酶抑制活性检测后，计算得IC50为46.6μg/mL。
在本发明中，我们在Hela细胞株上对XPS，XPS10和XPS10-1进行了IDO酶抑制活性测试，以评价其对IDO酶活性的抑制活性。结果表明在细胞水平上XPS对IDO酶没有抑制作用，XPS10和XPS10-1对IDO酶的抑制IC50分别为183.2±13.1μg/mL和139.0±8.7μg/mL。

Claims (19)

1.一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的制备方法包括如下步骤：
（1）取蓝萼香茶菜，加水煎煮，收集滤液，加入乙醇醇沉，静置后取乙醇沉淀物，干燥得到粗多糖XPS；
（2）粗多糖XPS过阴离子交换树脂，用1.0MNaCl洗脱，得到洗脱组分XPS10；
（3）将洗脱组分XPS10以0.1~0.3M NaCl为流动相，经分子筛凝胶柱层析，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
2.根据权利要求1所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，步骤（2）中在用1.0MNaCl洗脱之前，还包括用0.1~0.5MNaCl洗脱。
3.根据权利要求2所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的制备方法包括如下步骤：
（1）取蓝萼香茶菜，加水煎煮，收集滤液，加入乙醇醇沉，静置后取乙醇沉淀物，干燥得到粗多糖XPS；
（2）粗多糖XPS过阴离子交换树脂，用水、0.1MNaCl、0.2MNaCl、0.5MNaCl和1.0MNaCl依次洗脱，收集1.0MNaCl的洗脱组分XPS10；
（3）将洗脱组分XPS10以0.2M NaCl为流动相，经分子筛凝胶柱层析，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
4.根据权利要求1所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1包含多糖部分和蛋白质部分，其中，所述多糖部分的单糖组成包括鼠李糖和葡萄糖，所述蛋白质部分的氨基酸组成包括谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
5.根据权利要求4所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，所述多糖部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为10~40%，所述蛋白质部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为60~90%。
6.根据权利要求5所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，所述多糖部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为24~34%，所述蛋白质部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为66~76%。
7.根据权利要求6所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于，所述多糖部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为24.7~34.2%，所述蛋白质部分占蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的质量分数为69.8~75.3%。
8.根据权利要求4所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：单糖组成中鼠李糖和葡萄糖的摩尔比为10:（1.5~3）。
9.根据权利要求8所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：单糖组成中鼠李糖和葡萄糖的摩尔比为10:（2.0~2.5）。
10.根据权利要求4所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：所述氨基酸组成中谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸的摩尔比为（7~9）:（2~5）:10.0。
11.根据权利要求10所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：所述氨基酸组成中谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸的摩尔比为（8~9）:（3~4）:10.0。
12.根据权利要求4所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：所述单糖组成中还包含半乳糖、甘露糖和木糖中的一种或多种。
13.根据权利要求4中所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的相对平均分子量为6000~12000Da。
14.根据权利要求13中所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1，其特征在于：所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的相对平均分子量为6125~10259Da。
15.一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取蓝萼香茶菜，加水煎煮，收集滤液，加入乙醇醇沉，静置后取乙醇沉淀物，干燥得到粗多糖XPS；
（2）粗多糖XPS过阴离子交换树脂，用1.0MNaCl洗脱，得到洗脱组分XPS10；
（3）将洗脱组分XPS10以0.1~0.3M NaCl为流动相，经分子筛凝胶柱层析，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
16.根据权利要求15所述的蓝萼香茶菜糖蛋白XPS5-1的制备方法，其特征在于：步骤（2）中在用1.0MNaCl洗脱之前，还包括用0.1~0.5MNaCl洗脱。
17.一种蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取蓝萼香茶菜，加水煎煮，收集滤液，加入乙醇醇沉，静置后取乙醇沉淀物，干燥得到粗多糖XPS；
（2）粗多糖XPS过阴离子交换树脂，用水、0.1MNaCl、0.2MNaCl、0.5MNaCl和1.0MNaCl依次洗脱，收集1.0MNaCl的洗脱组分XPS10；
（3）将洗脱组分XPS10以0.2M NaCl为流动相，经分子筛凝胶柱层析，得蓝萼香茶菜多糖XPS10-1。
18.权利要求1~14中任一项所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1在制备IDO1酶抑制剂中的用途。
19.权利要求1~14中任一项所述蓝萼香茶菜糖蛋白XPS10-1在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为胃癌或宫颈癌。
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