CN114933663B - 民族药双参低分子量水溶性提取物、均一多糖、寡糖、总多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

民族药双参低分子量水溶性提取物、均一多糖、寡糖、总多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了民族药双参低分子量水溶性提取物、多糖、寡糖和总多糖及其制备方法和应用、药物组合物，涉及药物化学技术领域。本发明制备的民族药双参低分子量水溶性提取物、民族药双参低分子量均一多糖、民族药双参低分子量寡糖和民族药双参低分子量总多糖均对大鼠肾小球系膜细胞模型具有保护作用，可以使大鼠肾小球系膜细胞内的SOD含量增加，MDA含量降低，且效果显著；对糖尿病肾病具有显著疗效，可以用于制备防治糖尿病肾病药物或保健品；毒性试验证实，民族药双参低分子量均一多糖类成分安全性高，可以保证糖尿病肾病等糖尿病并发症患者长期用药的安全性，可应用于预防、改善或者治疗糖尿病及糖尿病肾病，具有良好的开发和应用前景。

Description

民族药双参低分子量水溶性提取物、均一多糖、寡糖、总多糖 及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及民族药双参低分子量水溶性提取物、均一多糖、寡糖和总多糖及其制备方法和应用、药物组合物。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是因胰岛素分泌或利用不足而引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的综合症。近年来，DM在全球范围发病率迅速增加，且发病年龄呈年轻化的趋势。DM不仅影响人们的健康，而且给社会带来沉重的负担。糖尿病肾病(DiabeticNephropathy，DN)是DM患者常见的并发症之一，是导致终末期肾病和DM患者死亡的主要原因，约30～40％的DM 患者会发展为DN，且发生率随着病程延长而增加。DN早期临床表现为肾小球滤过率增高，尿中微量白蛋白增多，血浆尿素氮和肌酐升高，最后进展为慢性肾功能不全。DN早期的主要病理特征是肾小球肥大，肾小球和肾小管基底膜增厚及系膜区细胞外基质的进行性积聚；后期为肾小球、肾小管间质的纤维化，并最终导致蛋白尿和肾功能衰竭。
目前对DM的治疗主要以降糖为主，对DN的治疗以采用联合用药为主，综合降血糖、降血压以及降血脂等方面的药物进行治疗，主要是延缓DN的发展，不能起到根治的效果。当前，临床上用激素及细胞毒类药物治疗DN，尽管取得一定疗效，但存在易复发、易产生激素依赖等不良反应。血管紧张素转换酶抑制剂(如卡托普利、依那普利等)对DN有治疗作用。然而，血管紧张素转换酶抑制剂副作用大，会引起低血压、高血钾、肾功能不全、咳嗽等症状。到目前为止，尚没有理想的治疗方法。因此，针对DM和DN，寻找一种高效、低毒的防治药物是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供民族药双参低分子量水溶性提取物、均一多糖、寡糖和总多糖及其制备方法和应用、药物组合物。采用本发明方法制备的民族药双参低分子量水溶性提取物、低分子量多糖、低分子量寡糖和低分子量总多糖可以预防或者治疗糖尿病及糖尿病肾病，且安全性高，具有良好的开发和应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种民族药双参低分子量水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用低级醇水溶液对民族药双参进行醇提，得到醇提取液；所述低级醇水溶液中低级醇体积分数为30～70％；
(2)将所述乙醇提取液与正丁醇混合进行萃取，将所得水相进行浓缩，得到水溶性组分；
(3)将所述水溶性组分进行脱蛋白处理，得到脱蛋白水溶性组分；
(4)将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，利用低级醇体积分数分别为0％、30％和60％的低级醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集3 个洗脱液后浓缩，分别得到水洗脱组分、30％醇洗脱组分和60％醇洗脱组分；
(5)在所述水洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分A和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分B；
(6)在30％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分C和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分D；
(7)在60％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分E和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90～92％进行醇沉，得到多糖类组分Z；
(8)将所述多糖类组分A、多糖类组分B、多糖类组分C、多糖类组分D、多糖类组分E和多糖类组分Z合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
优选的，将步骤(5)～(8)替换为：
在所述水洗脱组分、30％醇洗脱组分和60％醇洗脱组分中分别加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉多糖组分、30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分；将所述水洗醇沉多糖组分、 30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
优选的，将步骤(4)～(8)替换为：
将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，分别利用水和甲醇体积分数为60％的甲醇水溶液进行洗脱，分别收集2个洗脱液后浓缩，得到水洗脱组分和60％醇洗脱组分；
分别在所述水洗脱组分和60％醇洗脱组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分；
将所述水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量水溶性提取物，所述民族药双参低分子量水溶性提取物的相对分子量为 504～33000。
本发明提供了一种民族药双参低分子量均一多糖，包括具有式I所示结构的低分子量多糖LTGP-B1、具有式II所示结构的低分子量多糖LTGP-C3、具有式III所示结构的低分子量多糖LTGP-D2和具有式a-b-c-d所示连接结构的低分子量多糖LTGP-E1中的一种或几种；
Figure SMS_1
Figure SMS_2
本发明提供了上述技术方案所述民族药双参低分子量均一多糖的制备方法，
(1)所述低分子量多糖LTGP-B1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分B进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LBT1组分、LBT2组分、LBT3组分和LBT4组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LBT2组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LBT21组分、LBT22 组分、LBT23组分和LBT24组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；
将所述LBT22组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-B1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为4:1；
(2)所述低分子量多糖LTGP-C3的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LCT3组分进行大孔树脂柱除色，得到低分子量多糖LTGP-C3；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；
(3)所述低分子量多糖LTGP-D2的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-D2；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
(4)所述低分子量多糖LTGP-E1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分E进行反向ODS柱层析分离，依次得到LET1组分和LET2组分；所述反向ODS柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LET-1进行大孔树脂柱除色，依次得到LET11组分、LET12组分和LET13组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；
将所LET11组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-E1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为6:1。
本发明提供了一种民族药双参低分子量寡糖，利用α-糖苷酶对民族药双参低分子量均一多糖进行水解得到，所述民族药双参低分子量均一多糖为上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖或上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖；
所述民族药双参低分子量寡糖的相对分子量为504～1620。
本发明提供了一种民族药双参低分子量总多糖，包括上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、低分子量多糖LTGP-A1、低分子量多糖LTGP-C1、低分子量多糖LTGP-C2低分子量多糖和低分子量多糖LTGP-D1；所述民族药双参低分子量总多糖的相对分子量为504～33000；
所述低分子量多糖LTGP-A1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分A进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LAT1组分、LAT2组分和LAT3组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LAT2组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-A1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为6:1；
所述低分子量多糖LTGP-C1和低分子量多糖LTGP-C2的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LCT2组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LCT21组分和LCT22 组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；
将所述LCT22组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-C1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为5:1；
将所述LCT3组分进行大孔树脂柱除色，得到低分子量多糖LTGP-C2；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；
所述低分子量多糖LTGP-D1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-D1；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水。
本发明提供了上述技术方案所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述的民族药双参低分子量寡糖或上述技术方案所述的民族药双参低分子量总多糖在保健品或制备防治糖尿病或糖尿病肾病的药物中的应用。
本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分和药用辅料；所述活性组分包括上述技术方案所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述的民族药双参低分子量寡糖和上述技术方案所述的民族药双参低分子量总多糖中的一种或几种。
本发明提供了一种民族药双参低分子量水溶性提取物的制备方法，首先将民族药双参进行低级醇提，得到醇提取液利用正丁醇进行萃取，将所得水相进行浓缩、脱蛋白处理，在梯度洗脱条件进行大孔吸附树脂柱层析分离，将得到的不同洗脱组分进行醇沉后所得组分合并，即得到民族药双参低分子量水溶性提取物。本发明制备的民族药双参低分子量水溶性提取物对STZ 诱导糖尿病小鼠模型有一定的肾脏保护作用，双参活性组分可提高STZ糖尿病小鼠肾脏和肝脏抗氧化能力、调整糖脂代谢紊乱以及改善肾功能。同时对人肾小球系膜细胞和STZ诱导建立的糖尿病小鼠模型具有无毒性的特点。表明，本发明制备的民族药双参低分子量水溶性提取物可应用于预防、改善或者治疗糖尿病及糖尿病肾病，具有良好的开发和应用前景。
本发明提供了一种民族药双参低分子量均一多糖，包括具有式I所示结构的低分子量多糖LTGP-B1、具有式II所示结构的低分子量多糖LTGP-C3、具有式III所示结构的低分子量多糖LTGP-D2和具有式a-b-c-d所示结构的低分子量多糖LTGP-E1中的一种或几种。本发明提供的民族药双参低分子量均一多糖对大鼠肾小球系膜细胞模型的具有保护作用，可以使大鼠肾小球系膜细胞内的SOD含量增加，MDA含量降低，且效果显著，对糖尿病肾病具有显著疗效，可以用于制备防治糖尿病肾病药物或保健品；毒性试验证实，民族药双参低分子量均一多糖类成分安全性高，可以保证糖尿病肾病等糖尿病并发症患者长期用药的安全性。
本发明提供了一种民族药双参低分子量寡糖，利用α-糖苷酶对民族药双参低分子量均一多糖进行水解得到，所述民族药双参低分子量均一多糖为上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖或上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖；所述民族药双参低分子量寡糖的相对分子量为504～1620。本发明提供的民族药双参低分子量寡糖不仅具有抑制高糖诱导细胞增殖的作用，而且使细胞内SOD活性增加，MDA含量降低。对糖尿病肾病具有显著疗效，可以用于制备防治糖尿病肾病药物或保健品；毒性试验证实，民族药双参低分子量均一多糖类成分安全性高，可以保证糖尿病肾病等糖尿病并发症患者长期用药的安全性。
本发明提供了一种民族药双参低分子量总多糖，包括上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、低分子量多糖LTGP-A1、低分子量多糖LTGP-C1、低分子量多糖LTGP-C2低分子量多糖和低分子量多糖LTGP-D1；所述民族药双参低分子量总多糖的相对分子量为504～33000。本发明提供的民族药双参低分子量总多糖对大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)模型的具有保护作用，可以使大鼠肾小球系膜细胞内的SOD含量增加，MDA含量降低，且效果显著；对糖尿病肾病具有显著疗效，可以用于制备防治糖尿病肾病药物或保健品；毒性试验证实，民族药双参低分子量均一多糖类成分安全性高，可以保证糖尿病肾病等糖尿病并发症患者长期用药的安全性。
本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分和药用辅料；所述活性组分包括上述技术方案所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述的民族药双参低分子量寡糖和上述技术方案所述的民族药双参低分子量总多糖中的一种或几种。本发明提供的药物组合物中，民族药双参低分子量水溶性提取物、民族药双参低分子量均一多糖、民族药双参低分子量寡糖和民族药双参低分子量总多糖均对大鼠肾小球系膜细胞模型的具有保护作用，可以使大鼠肾小球系膜细胞内的SOD含量增加，MDA含量降低，且效果显著；对糖尿病肾病具有显著疗效，可以用于制备防治糖尿病肾病药物或保健品；毒性试验证实，民族药双参低分子量均一多糖类成分安全性高，可以保证糖尿病肾病等糖尿病并发症患者长期用药的安全性，可应用于预防、改善或者治疗糖尿病及糖尿病肾病，具有良好的开发和应用前景。
附图说明
图1为低分子量多糖LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D、LTGP-E1、LTGP-A1、 LTGP-C1、LTGP-C2和LTGP-D1的高效液相谱图；
图2为低分子量总多糖(TGP)对HRMC细胞活力影响图；
图3为低分子量总多糖(TGP)对高糖刺激的HRMC细胞增殖抑制作用图；
图4为低分子量多糖和低分子量寡糖对高糖刺激的HBZY-1细胞内 MDA含量影响图；
图5为低分子量多糖对高糖刺激的HBZY-1细胞内SOD含量影响；
图6为低分子量多糖对高糖刺激的HBZY-1细胞内MDA含量影响。
具体实施方式
本发明提供了一种民族药双参低分子量水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用低级醇水溶液对民族药双参进行醇提，得到醇提取液；所述低级醇水溶液中低级醇体积分数为30～70％；
(2)将所述乙醇提取液与正丁醇混合进行萃取，将所得水相进行浓缩，得到水溶性组分；
(3)将所述水溶性组分进行脱蛋白处理，得到脱蛋白水溶性组分；
(4)将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，利用甲醇体积分数分别为0％、30％和60％的低级醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集3个洗脱液后浓缩，分别得到水洗脱组分、30％醇洗脱组分和60％醇洗脱组分；
(5)在所述水洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分A和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分B；
(6)在30％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分C和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分D；
(7)在60％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分E和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90～92％进行醇沉，得到多糖类组分Z；
(8)将所述多糖类组分A、多糖类组分B、多糖类组分C、多糖类组分D、多糖类组分E和多糖类组分Z合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物；
所述步骤(5)、步骤(6)和步骤(7)没有时间先后顺序。
本发明利用低级醇水溶液对民族药双参进行醇提，得到醇提取液。在本发明中，所述民族药双参优选包括双参或大花双参；所述双参优选为川续断科(Dipsacaceae)双参属(Triplostegia)植物双参(Triplostegia glandulifera Wall)的根茎部分；所述大花双参优选为川续断科(Dipsacaceae)双参属(Triplostegia)植物大花双参(Triplostegiagrandiflora Gagnep)的根茎部分。在本发明中，所述民族药双参在使用前优选先进行水洗、干燥和粉碎，得到双参粉末；所述干燥优选为晾干或烘干，所述晾干的温度优选为室温，所述烘干的温度优选为40～60℃，更优选为50℃；本发明对于所述干燥的时间没有特殊限定，干燥至恒重即可。本发明对于所述粉碎没有特殊限定，所得双参粉末的粒径≤80目即可。在本发明中，所述低级醇优选包括甲醇和/或乙醇，更优选为甲醇；所述所述低级醇水溶液中低级醇体积分数为30～70％，优选为40～60％，更优选为50％。在本发明中，所述醇提的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述醇提的次数优选为3～5次，更优选为3～4次；每次醇提时民族药双参的质量与乙醇水溶液的体积之比优选为1kg：3～5L，更优选为1kg：3～4L；每次醇提的时间独立优选为20～30h，更优选为24h。本发明具体是在每次醇提后滤出药渣进行下一次醇提，将每次醇提结束滤出药渣后所得溶液合并后浓缩至无乙醇，得到乙醇提取液。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压浓缩；所述减压浓缩的温度优选为45～55℃，更优选为50℃。
得到乙醇提取液后，本发明将所述乙醇提取液与正丁醇混合进行萃取，将所得水相进行浓缩，得到水溶性组分(记为A1)。在本发明中，所述萃取的次数优选为3～4次，更优选为3次；每次萃取时乙醇提取液与正丁醇的体积比优选为1：1～2，更优选为1：1.5～2。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式浓缩至水相体积的15～20％即可，具体如减压浓缩；所述减压浓缩的温度优选为55～70℃，更优选为60～65℃。
得到水溶性组分后，本发明将所述水溶性组分进行脱蛋白处理，得到脱蛋白水溶性组分(记为A2)。在本发明中，所述脱蛋白处理优选为将所述水溶性组分与脱蛋白试剂混合进行脱蛋白处理，固液分离，将所得液体组分浓缩，得到脱蛋白水溶性组分。在本发明中，所述脱蛋白试剂优选包括氯仿-正丁醇混合溶剂，所述氯仿-正丁醇混合溶剂中氯仿与正丁醇的体积比优选为4～5：1，更优选为4～4.5：1。在本发明中，所述水溶性组分与脱蛋白试剂的体积比优选为4～5：1，更优选为4.5～5：1。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～4000rpm，更优选为3500rpm，所述离心分离的时间优选为5～15min，更优选为10～12min。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式浓缩至水相体积的 15～20％即可，具体如减压浓缩；所述减压浓缩的温度优选为55～70℃，更优选为60～65℃。
得到脱蛋白水溶性组分后，本发明将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，利用甲醇体积分数分别为0％、30％和60％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集3个洗脱液后浓缩，分别得到水洗脱组分(记为A2-1)、 30％醇洗脱组分(记为A2-2)和60％醇洗脱组分(记为A2-3)。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式浓缩至水相体积的15～20％即可，具体如减压浓缩；所述减压浓缩的温度优选为55～70℃，更优选为60～65℃。
完成所述浓缩后，本发明优选还包括将所得浓缩物分别进行脱色处理，分别得到水洗脱组分(记为A2-1)、30％醇洗脱组分(记为A2-2)和60％醇洗脱组分(记为A2-3)。在本发明中，所述除色素处理优选包括大孔吸附树脂柱层析脱色、活性炭脱色或双氧水脱色。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱层析脱色采用的洗脱剂优选为水。在本发明中，所述活性炭脱色优选包括以下步骤：分别将所得浓缩物与活性炭混合进行活性炭脱色；所述活性炭的质量优选为浓缩物质量的1～5％，更优选为4％；所述活性炭脱色的温度优选为50～60℃，更优选为55℃，所述活性炭脱色的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h；所述活性炭脱色优选在50～60℃的热水浴中进行。在本发明中，所述双氧水脱色优选包括以下步骤：分别将所得浓缩物与双氧水混合进行双氧水脱色；所述双氧水的浓度优选为20～30wt％，更优选为25～30wt％；所述双氧水的体积优选为浓缩物体积的5～8％，更优选为6～7％；所述双氧水脱色的温度优选为50～60℃，更优选为55℃，所述双氧水脱色的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h；所述活性炭脱色优选在50～60℃的热水浴中进行。
得到水洗脱组分后，本发明在所述水洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分A和液体组分。在本发明中，所述低级醇优选包括甲醇和/或乙醇；所述醇沉的温度优选为2～8℃，更优选为4℃，所述醇沉的时间优选为12～24h，更优选为15～20h；所述醇沉优选在冰箱中进行。完成所述醇沉后，本发明优选还包括将所述醇沉体系进行固液分离，所得固体组分为多糖类组分A。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如离心分离；所述离心分离的速度优选为3000～4000rpm，更优选为3500rpm，所述离心分离的时间优选为5～10min，更优选为10min。
得到液体组分后，本发明在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分B。在本发明中，所述低级醇的种类、醇沉的条件以及醇沉后的固液分离均与前述多糖类组分A的制备相同，在此不再赘述。
得到30％醇洗脱组分后，本发明在30％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分C和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分D。在本发明中，所述多糖类组分C和多糖类组分D制备过程中的低级醇的种类、醇沉的条件以及醇沉后的固液分离均与前述多糖类组分A的制备相同，在此不再赘述。
得到60％醇洗脱组分后，本发明在60％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分E和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90～92％进行醇沉，得到多糖类组分Z。在本发明中，所述多糖类组分E和多糖类组分Z制备过程中的低级醇的种类、醇沉的条件以及醇沉后的固液分离均与前述多糖类组分A的制备相同，在此不再赘述。
得到多糖类组分A、多糖类组分B、多糖类组分C、多糖类组分D、多糖类组分E和多糖类组分Z后，本发明将所述多糖类组分A、多糖类组分B、多糖类组分C、多糖类组分D、多糖类组分E和多糖类组分Z合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
本发明提供了一种民族药双参低分子量水溶性提取物的制备方法，将前述民族药双参低分子量水溶性提取物制备方法中的步骤(5)～(8)替换为：
在所述水洗脱组分、30％醇洗脱组分和60％醇洗脱组分中分别加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉多糖组分、30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分；将所述水洗醇沉多糖组分、 30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。在本发明中，所述低级醇的种类、醇沉的条件以及醇沉后的固液分离均与前述多糖类组分A的制备相同，在此不再赘述。
本发明提供了一种民族药双参低分子量水溶性提取物的制备方法，将前述民族药双参低分子量水溶性提取物制备方法中的步骤(4)～(8)替换为：
将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，分别利用水和甲醇体积分数为60％的甲醇水溶液进行洗脱，分别收集2个洗脱液后浓缩，得到水洗脱组分和60％醇洗脱组分；
分别在所述水洗脱组分和60％醇洗脱组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分；
将所述水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
本发明将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，分别利用水和甲醇体积分数为60％的甲醇水溶液进行洗脱，分别收集2个洗脱液后浓缩，得到水洗脱组分和60％醇洗脱组分。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式浓缩至水相体积的 15～20％即可，具体如减压浓缩；所述减压浓缩的温度优选为55～70℃，更优选为60～65℃。
得到水洗脱组分和60％醇洗脱组分后，本发明分别在所述水洗脱组分和 60％醇洗脱组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分；将所述水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。在本发明中，所述水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分制备过程中的低级醇的种类、醇沉的条件以及醇沉后的固液分离均与前述多糖类组分A的制备相同，在此不再赘述。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量水溶性提取物，所述民族药双参低分子量水溶性提取物的相对分子量为 504～33000。
本发明提供了一种民族药双参低分子量均一多糖，包括具有式I所示结构的低分子量多糖LTGP-B1、具有式II所示结构的低分子量多糖LTGP-C3、具有式III所示结构的低分子量多糖LTGP-D2和具有式a-b-c-d所示结构的低分子量多糖LTGP-E1中的一种或几种；
Figure SMS_3
(即
Figure SMS_4
)式I。
Figure SMS_5
II(即
Figure SMS_6
)，
Figure SMS_7
式III(即
Figure SMS_8
)，
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-E1的结构式为a-b-c-d，即
Figure SMS_9
其中，
Figure SMS_10
Figure SMS_11
在本发明中，所述民族药双参低分子量均一多糖中单糖优选以α-1→2、α-1→4、α-1→3、β-1→4键型相链接。
本发明提供了上述技术方案所述民族药双参低分子量均一多糖的制备方法。在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-B1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分B进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LBT1组分、LBT2组分、LBT3组分和LBT4组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LBT2组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LBT21组分、LBT22 组分、LBT23组分和LBT24组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所述LBT22组分进行硅胶柱层析分离，依次得到低分子量多糖LTGP-B1和低分子量多糖LTGP-B2；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿- 甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为4:1。
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-C3的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶 SephadexLH-20柱层析分离，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LCT3组分进行大孔树脂柱除色，依次得到低分子量多糖 LTGP-C2和低分子量多糖LTGP-C3；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱。
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-D2的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶 SephadexLH-20柱层析分离，依次得到得到低分子量多糖LTGP-D1和低分子量多糖LTGP-D2；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水。
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-E1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分E进行反向ODS柱层析分离，依次得到LET1组分和LET2组分；所述反向ODS柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LET-1进行大孔树脂柱除色，依次得到LET11组分、LET12组分和LET13组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所LET11组分进行硅胶柱层析分离，依次得到低分子量多糖LTGP-E1、低分子量多糖LTGP-E2和低分子量多糖LTGP-E3；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为6:1。
本发明提供了一种民族药双参低分子量寡糖，利用α-糖苷酶对民族药双参低分子量均一多糖进行水解得到，所述民族药双参低分子量均一多糖为上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖或上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖；所述民族药双参低分子量寡糖的相对分子量为504～1620。在本发明中，所述民族药双参低分子量寡糖中单糖优选以α-1→2、α-1→4、α-1→3、β-1→4键型相链接。在本发明中，所述民族药双参低分子量均一多糖与α-糖苷酶的用量比优选为1mg：100U，所述α- 糖苷酶的浓度优选为100～1000U/mL。在本发明中，所述水解的温度优选为 37～45℃，更优选为25～40℃；所述水解的时间优选为1～3h，更优选为2～2.5h。
本发明提供了一种民族药双参低分子量总多糖，包括上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖或上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、低分子量多糖LTGP-A1、低分子量多糖LTGP-C1、低分子量多糖LTGP-C2低分子量多糖和低分子量多糖LTGP-D1，优选包括低分子量多糖LTGP-B1、低分子量多糖LTGP-C3、低分子量多糖LTGP-D、低分子量多糖LTGP-E1、低分子量多糖LTGP-A1、低分子量多糖LTGP-C1、低分子量多糖LTGP-C2低分子量多糖和低分子量多糖LTGP-D1。在本发明中，所述民族药双参低分子量总多糖的相对分子量为504～33000。
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-A1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分A进行葡聚糖凝胶 SephadexLH-20柱层析分离，依次得到LAT1组分、LAT2组分和LAT3组分；所述葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LAT2组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-A1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为6:1。
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-C1和低分子量多糖LTGP-C2的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶 SephadexLH-20柱层析分离，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LCT2组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LCT21组分和LCT22 组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所述LCT22组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-C1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为5:1；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所述LCT3组分进行大孔树脂柱除色，依次得到得到低分子量多糖 LTGP-C2低分子量多糖和LTGP-C3；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱。
在本发明中，所述低分子量多糖LTGP-D1的制备方法包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶 SephadexLH-20柱层析分离，依次得到低分子量多糖LTGP-D1和低分子量多糖LTGP-D2；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水。
本发明提供了上述技术方案所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述的民族药双参低分子量寡糖或上述技术方案所述的民族药双参低分子量总多糖在保健品或制备防治糖尿病或糖尿病肾病的药物中的应用。在本发明中，所述糖尿病优选为II型糖尿病；所述肾病包括糖尿病肾病、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、肾病综合征和肾小球肾炎中的至少一种。
在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂或口服制剂。
本发明提供了一种药物组合物，包括活性成分和药用辅料；所述活性成分包括上述技术方案所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、上述技术方案所述的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、上述技术方案所述的民族药双参低分子量寡糖和上述技术方案所述的民族药双参低分子量总多糖中的一种或几种。
在本发明中，所述药用辅料优选包括稀释剂、赋形剂、填充剂、勃合剂、湿润剂、崩解剂、钠吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂和甜味剂中的一种或几种；所述稀释剂优选包括水；所述赋形剂优选包括水、甘露醇、硬脂酸镁、淀粉和环糊精中的一种或几种；所述填充剂优选包括淀粉和/或蔗糖；所述勃合剂优选包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种；所述湿润剂优选包括甘油；所述崩解剂优选包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的一种或几种；所述钠吸收促进剂优选包括季铵化合物；所述表面活性剂优选包括十六烷醇和/或羧甲基纤维素钠；所述吸附载体优选包括高岭土和/或皂勃土；所述润滑剂优选包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的一种或几种；本发明对于所述香味剂和甜味剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的香味剂和甜味剂即可。
本发明对于所述药物组合物的剂型没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的剂型即可，具体如片剂、颗粒、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂；本发明对于所述片剂、颗粒、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂和粉针剂的制备没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的制备方法即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明以下实验所用石油醚、氯仿、正丁醇、乙醇、甲醇为工业级试剂，并且重蒸后使用。分离材料包括：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(Amersham Biosciences，Sweden)，反相材料ODS，硅胶(300～400目)，薄层色谱硅胶板GF254(青岛海洋化工厂)。
实施例1
(1)将双参根茎部分洗净，在50℃条件下干燥至恒重，粉碎，得到双参粉末。在3kg双参粉末中加入6L乙醇体积分数为50％的乙醇水溶液，在50℃条件下醇提24h，过滤，得到滤液和滤渣；将所得滤渣重复上述步骤2 次，合并3次过滤所得滤液，在50℃条件下减压浓缩回收乙醇至无乙醇味，得到乙醇提取液。其中，民族药双参为川续断科(Dipsacaceae)双参属 (Triplostegia)植物双参(Triplostegia glandulifera Wall)的地下部分，标本(编号：20190626)存放于大理大学药学院王福生教授研究组。
(2)利用正丁醇对所述乙醇提取液进行萃取，萃取次数为6次(单次萃取用正丁醇体积为6L)，去除正丁醇萃取相，将所得水相在65℃条件下减压浓缩至1～1.5L，得到水溶性组分A1。
(3)利用氯仿-正丁醇混合溶剂(4:1，V/V)对所述水溶性组分A1进行脱蛋白，离心去除蛋白，将所得上清液在65℃条件下减压浓缩至1L，得到脱蛋白水溶性组分A2。
(4)将所述水溶性除蛋白组分A2进行101大孔吸附树脂柱层析分离，采用湿法上样方式，依次利用甲醇体积分数分别为0％、30％和60％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集3个洗脱液并分别浓缩至500mL，得到水洗脱组分A2-1、30％醇洗脱组分A2-2和60％醇洗脱组分A2-3。
(5)在所述水洗脱组分A2-1中加入乙醇至乙醇体积分数为60％，置于 4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，得到多糖类组分A 和液体组分。在所述液体组分中加入乙醇至乙醇体积分数为60％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，所得固体组分为多糖类组分B。
(6)在所述30％醇洗脱组分A2-2中加入乙醇至乙醇体积分数为60％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，得到多糖类组分C和液体组分。在所述液体组分中加入乙醇至乙醇体积分数为60％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，所得固体组分为多糖类组分D。
(7)在所述60％醇洗脱组分A2-3中加入乙醇至乙醇体积分数为60％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，得到多糖类组分E和液体组分。在所述液体组分中加入乙醇至乙醇体积分数为60％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，所得固体组分为多糖类组分Z。
(8)将所述多糖类组分A、多糖类组分B、多糖类组分C、多糖类组分D、多糖类组分E和多糖类组分Z合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
实施例2
按照实施例1的方法制备民族药双参低分子量水溶性提取物，与实施例 1的区别在于：将步骤(5)～(8)替换为：
将所述脱蛋白水溶性组分A2进行101大孔吸附树脂柱层析，采用湿法上样方式，依次利用蒸馏水和甲醇体积分数为60％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集水洗脱液和60％甲醇洗脱液；将水洗脱液浓缩至500mL，加入乙醇至乙醇体积分数为90％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，得到水洗醇沉多糖组分；将60％甲醇洗脱液浓缩至500mL，加入乙醇至乙醇体积分数为90％，置于4℃冰箱中醇沉24h，在3500rpm条件下离心分离10min，得到60％甲醇洗醇沉多糖组分；将水洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
实施例3
按照实施例1的方法制备民族药双参低分子量水溶性提取物，与实施例 1的区别在于：将步骤(5)～(8)替换为：
在所述水洗脱组分A2-1、30％醇洗脱组分A2-2和60％醇洗脱组分A2-3 中分别加入低级醇至低级醇体积分数为90％，分别置于4℃冰箱中醇沉 12～24h，在3500rpm条件下分别离心分离10min，所得固体分别为水洗醇沉多糖组分、30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分；将所述水洗醇沉多糖组分、30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
实施例4
(1)将实施例1制备的多糖类组分A进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱层析分离(洗脱剂为水)，依次得到LAT1组分、组分LAT2和LAT3组分；将所述LAT2组分进行硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：甲醇＝6：1， V/V)依次得到低分子量多糖LTGP2-A2和LTGP2-A1；将所述LAT3组分进行硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：甲醇＝5：1，V/V)得到低分子量多糖LTGP-A3。
(2)将实施例1制备的多糖类组分B进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱层析分离(洗脱剂为水)，依次得到LBT1组分、LBT2组分、LBT3组分和LBT4组分；将所述LBT2组分进行AB-8大孔树脂柱除色(洗脱剂为水)，依次得到LBT21组分、LBT22组分、LBT23组分和LBT24组分；所述大孔树脂优选包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；将所述LBT22 组分进行硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：甲醇＝4：1，V/V)，依次得到低分子量多糖LTGP-B1和低分子量多糖LTGP-B2。
(3)将实施例1制备的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱层析分离(洗脱剂为水)，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；将所述LCT2组分进行AB-8大孔树脂柱除色(洗脱剂为水)，依次得到LCT21组分和LCT22组分；将所述LCT22组分进行硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：甲醇＝5：1，V/V)，依次得到低分子量多糖LTGP-C1 和低分子量多糖LTGP-C4；将所述LCT3组分进行AB-8大孔树脂柱除色(洗脱剂为水)，依次得到得到低分子量多糖LTGP-C2低分子量多糖和LTGP-C3。
(4)将实施例1制备的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱层析分离(洗脱剂为水)，依次得到低分子量多糖LTGP-D1和低分子量多糖LTGP-D2。
(5)将实施例1制备的多糖类组分E进行反向ODS柱层析分离(洗脱剂为水)，依次得到LET1组分和LET2组分；将所述LET-1进行AB-8大孔树脂柱除色(洗脱剂为水)，依次得到LET11组分、LET12组分和LET13 组分；将所LET11组分进行硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：甲醇＝6：1， V/V)，依次得到低分子量多糖LTGP-E1、低分子量多糖LTGP-E2和低分子量多糖LTGP-E3。
(6)将低分子量多糖LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D、LTGP-E1、LTGP-A1、LTGP-C1、LTGP-C2和LTGP-D1合并，得到低分子量总多糖(TGP)。
测试例1
分别将低分子量多糖LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D、LTGP-E1、LTGP-A1、 LTGP-C1、LTGP-C2和LTGP-D1进行PMP-HPLC柱前衍生化法分析，然后进行HPGPC检测，检测结果如表1和图1所示，其中图1为低分子量多糖 LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D、LTGP-E1、LTGP-A1、LTGP-C1、LTGP-C2 和LTGP-D1的高效液相谱图；其相对分子量范围1800～33000。其中，HPGPC 测定条件：色谱柱为Shodex OHpak SB-804(300mm×7.5mm)，流动相为超纯水，样品浓度为1mg/mL，进样量为20μL，四元泵流速为0.4mL/min，柱温箱温度35℃，检测器为蒸发光检测器，氮气流速为1.3mL/min，蒸发温度为55℃，雾化温度为45℃。
表1双参低分子量多糖的分子量
Figure SMS_12
利用一维核磁谱图(1H-NMR、13C-NMR)和二维核磁谱图(HSQC、 HMBC、TOCSY)并对双参低分子量多糖的糖残基进行化学位移归属，糖残基的相对构型α-或β-通过耦合常数确定，再利用HMBC二维核磁谱确定低分子量多糖各个糖残基之间的连接顺序，推断出低分子量多糖的结构， LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D2和LTGP-E1中各糖残基的1H-NMR(800MHZ， D2O)和13C-NMR(200MHZ，D2O)数据如表2～5所示：
表2 LTGP-B1中各糖残基的化学位移
Figure SMS_13
由表2可知，LTGP-B1具有式I所示的结构。
表3 LTGP-C3中各糖残基的化学位移
Figure SMS_14
Figure SMS_15
由表3可知，LTGP-C3具有式II所示的结构。
表4 LTGP-D2中各糖残基的化学位移
Figure SMS_16
由表4可知，LTGP-D2具有式III所示的结构。
表5 LTGP-E1中各糖残基的化学位移
Figure SMS_17
表2～表5中，“-”表示没有H信号。
由表5可知，LTGP-E1具有式a-b-c-d所示的结构。
实施例5
在0.1g实施例2制备的低分子量多糖LTGP-B1中加入10mL 1000U/mL 的α-糖苷酶混合均匀，在45℃条件下水解2.5h，得到低分子量寡糖LTGP-B1-1、 LTGP-B1-2和LTGP-B1-3。
实施例6
按照实施例1的方法制备低分子量总多糖和实施例4的方法制备低分子量多糖和低分子量总多糖，按照实施例5的方法制备低分子量寡糖，与实施例1、实施例4和实施例5的区别在于，采用的民族药为民族药大花双参为川续断科(Dipsacaceae)双参属(Triplostegia)植物大花双参(Triplostegia grandiflora Gagnep)的地下部分，标本(编号：201701017)存放于大理大学药学院王福生教授研究组。
测试例2
实施例4制备的低分子量总多糖(TGP)的活性测试
实验步骤：实验分组：空白对照组(正常糖完全培养基)、不同浓度药物组(0、50、100、200、400和800μg/mL)、高糖对照组。
细胞传代后，取生长状态良好处于对数生长期的细胞进行实验。选取96 孔板实验，细胞密度为5×104个/mL,每孔细胞悬液100μL。种板24小时待细胞贴壁后，弃去旧培养基，按照相应的分组加入培养液，再培养48小时后，加入20μLMTT溶液，培养箱孵育4小时，弃去上清液，加入150μLDMSO 溶液，于490nm处测定吸光度。
(1)对HRMC细胞活力影响
为确定低分子量总多糖对高糖刺激人肾小球系膜细胞的增殖抑制实验剂量范围，采用MTT法检测不同浓度(0、50、100、200、400和800μg/mL) 的低分子量总多糖的对人肾小球系膜细胞(HRMC)48h存活率，测试结果如图2所示。由图2可知，低分子量总多糖TGP在50～800μg/mL范围内无细胞毒性，采用此浓度范围的多糖进一步验证糖刺激的人肾小球系膜细胞 (HRMC)增值抑制作用。
(2)对高糖刺激的HRMC细胞增殖抑制作用
不同浓度(0、50、100、200、400和800μg/mL)的低分子量总多糖TGP 对高糖刺激的HRMC细胞增殖抑制作用如图3所示，其中，NG代表正常糖组，HG代表高糖组。由图3可知，TGP在100～800μg/mL呈浓度抑制作用， TGP抑制HRMC细胞增殖呈明显浓度依赖性，100～800μg/mL细胞抑制明显下降(P<0.01)。
(3)对高糖培养人肾小球系膜细胞的保护作用
采用SOD(超氧化物歧化酶)和MDA(丙二醛)试剂盒检测低分子量总多糖类对高糖诱导的人肾小球系膜细胞内SOD和MDA含量的测定，其中，采用的BCA试剂盒购买于南京建成公司。
(3.1)实验分组
RPMI1640正常糖对照组：正常糖(5.5mmol/L)完全培养基。
RPMI1640高糖对照组：高糖(30mmol/L葡萄糖)完全培养基。
药物组：不同浓度低分子量总多糖(50、100、200、400μg/mL)，高糖完全培养基配制。
阳性对照组：阳性药为Tempol(100μmmol/L)。
(3.2)实验方法：SOD和MDA含量计算使用BCA法，细胞培养基为含葡萄糖30mmol/L的RPMI1640完全培养基。
细胞样本处理：取对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化2.5min，加 10％FBS胎牛血清培养基(Gibco公司)终止消化，置于离心机中在1000r/min 条件下离心5min。调整细胞至2×104个/孔，置于24孔板培养24h，待细胞贴壁后，换无血清培养基培养24h使细胞处于G0期，根据实验分组每孔各加入100μL培养液，每组3个复孔。培养48h后，弃去上清液，用0.25％胰酶消化2.5min，待细胞消化完全，加入10％FBS培养基终止消化，移入EP 管，置于离心机中在1000r/min条件下离心5min，弃去上清，加入1.0mLPBS (磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4)，移液枪轻轻吹均匀，置于离心机中在1000r/min 条件下离心5min。弃去上清，重复三次上述操作，留细胞沉淀待用。向EP 管中的细胞沉淀加入0.5mLPBS于超声仪中，在300W、冰水浴条件下超声，每次超声10s，共超声4次，相邻两次超声间隔时间为30s。
蛋白测定：将处理好的样本，按照BCA试剂盒(购买于南京建成公司) 说明书，测定其蛋白浓度。
MDA含量测定：按照BCA试剂盒说明书操作配制标准品，各实验分组加入的试剂如表6所示：
表6各实验分组加入的试剂
Figure SMS_18
根据MDA试剂盒说明书操作：在95℃条件下水浴加热40min，待反应完成取出流水冷却，然后在3500～4000r/min条件下离心10min，取上清液，蒸馏水调零，在532nm处测吸光度值。MDA含量计算式如下：
Figure SMS_19
SOD含量测定：按照SOD试剂盒(购买于南京建成公司)说明书操作配制标准品，各实验分组加入的试剂如表7所示：
表7各实验分组加入的试剂
试剂 对照孔 对照空白孔 测定孔 测定空白孔
待测样本 - - 20μL 20μL
蒸馏水 20μL 20μL - -
酶工作液 20μL - 20μL -
酶稀释液 - 20μL - 20μL
底物应用液 200μL 200μL 200μL 200μL
测定前将酶工作液、酶稀释液37℃水浴5min以上。测定孔和测定空白孔中加入20μL处理好的细胞样本，然后在对照孔、对照空白孔中加入20μL 蒸馏水，对照孔和测定孔加入20μL酶工作液，然后在对照空白孔和测定空白孔加入20μL酶稀释液，再给每孔加入200μL底物应用液。加入完毕后充分混匀，37℃水浴30min后，560nm波长处测定吸光度值。
SOD抑制率计算式如下：
Figure SMS_20
SOD活力计算式如下：
SOD活力＝SOD抑制率÷50%×反应体系(0.24mL)÷待测样本蛋白浓度。
(3.3)实验结果
实验结果如表8所示：
表8TGP对高糖培养HRMC细胞内SOD和MDA含量的影响
Figure SMS_21
Figure SMS_22
Figure SMS_23
备注：与HG对照组相比，*P﹤0.05，**P﹤0.01，与NG对照组相比，#P ﹤0.05，##P﹤0.01。
由表8可知，高糖(HG)刺激HRMC细胞与正常组比较，细胞内的SOD 活性显著降低(P<0.01)。阳性药(Tempol)与高糖组比较，活性显著增强，细胞内的SOD活性显著增加(P<0.05)。考虑到800μg/mL低分子量总多糖浓度太大，药理实验意义不大，故选用浓度在50～400μg/mL间测定低分子量总多糖对HRMC细胞中SOD和MDA含量。与高糖模型组对比，TGP浓度为50～100μg/mLSOD含量增加(P<0.05)，浓度为200～400μg/mL时SOD 活性明显增强(P<0.01)。50μg/mLTGP的MDA含量降低(P<0.05)，当 TGP浓度为100～400μg/mL时MDA含量明显降低，活性增强(P<0.01)。说明，低分子量总多糖(TGP)可以使人肾小球系膜细胞内的SOD含量增加，使MDA含量降低，且效果显著。
测试例3
动物实验：低分子量多糖(LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D和LTGP-E1) 和低分子量寡糖(LTGP-B1-2和LTGP-B1-3)对大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1) 模型的保护作用
(1)实验方法：采用CCK-8法检测LTGP-B1、LTGP-C3、LTGP-D、LTGP-E1、LTGP-B1-2和LTGP-B1-3对HBZY-1细胞是否具有毒性；采用 CCK-8法检测双参低分子量多糖对高糖诱导的HBZY-1细胞增殖影响；采用 ELISA法检测有抑制活性的双参低分子量多糖类成分对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)内SOD和MDA含量。测试浓度范围为 0.025～1.6mg/mL。
(2)测试结果：如图4所示，由图4可知，(1)在药物浓度0.025～1.6 mg/mL范围内，多数药物(LTGP-A1、LTGP-B2、LTGP-C1、LTGP-C2、LTGP-C3、 LTGP-D1、LTGP-D2和LTGP-E1)对HRMC细胞无毒性。(2)5个低分子量多糖具有抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖作用，其中3个多糖LTGP-B1 (0.025～1.6mg/mL)、LTGP-E1(0.025～1.6mg/mL)、LTGP-D2(0.025～0.8 mg/mL)具有浓度依赖性，LTGP-C3在0.025～0.8mg/mL浓度范围内有抑制作用，其最佳抑制浓度为0.1mg/mL。酶解得到的两个多糖组分LTGP-B1-2 (0.025～1.6mg/mL)、LTGP-B1-3(0.025～1.6mg/mL)也呈现浓度依赖性的抑制作用。说明，它们对高糖诱导的HBZY-1细胞具有保护作用。
(3)采用ELISA法测定双参低分子量多糖对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)内SOD和MDA含量。根据(2)实验结果，LTGP-B1、 LTGP-E1、LTGP-B1-2和LTGP-B1-3测定SOD和MDA含量时选择的浓度范围为0.025～1.6mg/mL，LTGP-C3、LTGP-D2选用的浓度范围为0.025～0.8 mg/mL。SOD和MDA含量按照蛋白浓度计算。
实验分组：高糖对照组(不含药物)；阳性对照组(Tempol)；药物组 (0.025、0.1、0.4、0.8和1.6mg/mL)。
实验方法：SOD和MDA含量计算使用BCA法，细胞培养基为含葡萄糖30mmol/L的DMEM完全培养基。
细胞样本处理：选用24孔板接种细胞，每孔细胞数为6×104个，每孔培养基500μL，细胞接种完成后培养24h，待细胞贴壁后换无血清培养基培养 24h，再换含药培养基培养48h，弃去上清液，用胰酶消化并收集细胞， 1500r/min，离心5min，弃去上清，在细胞沉淀中加入500μLPBS，超声破碎细胞，超声条件为功率30W，每次超声10s，共超声30次，超声完成后15000r/min，离心5min，取上清待用。
BCA试剂盒测定：按照试剂盒说明书绘制蛋白含量标准曲线选用96孔板实验，每组三个复孔，每孔加入20μL细胞样本，各孔加入200μLBCA工作液，在37℃条件下孵育30min，用酶标仪测定562nm处吸光度。按照试剂盒说明书绘制蛋白含量标准曲线，将样本吸光度代入标准曲线中计算处蛋白浓度。
SOD试剂盒测定：每组实验三个复孔，各实验组的加入试剂如表9所示，加料顺序为样本(低分子量多糖或低分子量寡糖)、试剂一、试剂二、试剂三、双蒸水和试剂五。充分混匀后，37℃水浴30min后，560nm处测定各组吸光度值。
表9 SOD试剂盒测定各实验组加入试剂
试剂名称(μL) 测定管 对照管 空白管1 空白管2
样本 18 18 - -
试剂一 45 45 45 45
试剂二 2 - 2 -
试剂三 35 35 35 35
双蒸水 90 92 108 110
试剂五 10 10 10 10
计算ΔA测定＝A测定-A对照，ΔA空白＝A1空白-A2空白。(空白管1和空白管2各只需做3管；每个样本有一个对照管)。
测定完成后按下列式进行计算：
SOD抑制百分率＝(ΔA空白-ΔA测定)/ΔA空白×100％
SOD活性＝11.11×抑制百分率/(1-抑制百分率)/Cpr×F
Cpr表示蛋白样本浓度，mg/mL；F表示样本稀释倍数。
MDA试剂盒测定：每组实验3个复孔，各实验组加入的试剂如表10所示：
表10 MDA试剂盒测定试剂加入量及顺序
试剂名称(μL) 测定组 空白组
MDA检测工作液 300 300
蒸馏水 - 100
样本 100 -
试剂三 100 100
混合液在100℃水浴中保温60min后，置于冰浴中冷却，1500rpm、常温(25℃)条件下离心10min。吸取200μL上清液于96孔板中，测定各样本在450nm、532nm和600nm处的吸光度，分别计算吸光度差值：ΔA450＝A450测定-A450空白，ΔA532＝A532测定-A532空白，ΔA600＝A600 测定-A600空白。，其中，空白管1和空白管2各只需做3管；每个样本有一个对照管，测定完成后按下列式计算：
MDA含量＝5×(12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450)/Cpr
其中，Cpr表示蛋白样本浓度，mg/mL。
(4)实验结果
实验结果如表11和图5～6所示，图5为低分子量多糖对高糖刺激的 HBZY-1细胞内SOD含量影响，图6为低分子量多糖对高糖刺激的HBZY-1 细胞内MDA含量影响。
表11活性组分对高糖培养HBZY-1细胞内SOD含量影响
Figure SMS_24
Figure SMS_25
Figure SMS_26
备注：与HG对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。
为了比较分子量大小对活性的影响，使用HBZY-1细胞模型，对酶解 LTGP-B1得到的三个多糖组分进行活性测定，结果如表12所示。
表12 LTGP-B1-2、LTGP-B1-3对高糖培养HBZY-1细胞内SOD和MDA含量影响
Figure SMS_27
Figure SMS_28
由表11～12和图5～6可知，(1)实验证明双参4个低分子量多糖(LTGP-B1、 LTGP-C3、LTGP-D2和LTGP-E1)可以使大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1) 内的SOD含量增加，使MDA含量降低，且效果显著，LTGP-C2活性弱。 LTGP-B1-2、LTGP-B1-3不仅具有抑制高糖诱导细胞增殖的作用，而且使细胞内SOD活性增加，MDA含量降低，其中两个组分使细胞内SOD含量远大于LTGP-B1中的含量，相反MDA的含量都高于LTGP-B1，提示多糖分子量的大小与活性相关。结果发现：双参低分子量均一多糖对大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)模型的保护作用；双参低分子量均一多糖升高了高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)内SOD含量，且降低了MDA的含量；说明低分子量多糖组分尤其均一多糖对高糖诱导肾小球系膜细胞具有保护作用，其机制可能与其能提高肾小球系膜细胞应激能力有关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种民族药双参低分子量水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用乙醇体积分数为50％的乙醇水溶液对民族药双参进行醇提，得到醇提取液；
(2)将所述醇提取液与正丁醇混合进行萃取，将所得水相进行浓缩，得到水溶性组分；
(3)将所述水溶性组分进行脱蛋白处理，得到脱蛋白水溶性组分；
(4)将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，利用甲醇体积分数分别为0％、30％和60％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集3个洗脱液后浓缩，分别得到水洗脱组分、30％醇洗脱组分和60％醇洗脱组分；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
(5)在所述水洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分A和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分B；所述低级醇包括甲醇和/或乙醇；
(6)在30％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分C和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％进行醇沉，得到多糖类组分D；所述低级醇包括甲醇和/或乙醇；
(7)在60％醇洗脱组分中加入低级醇至体积分数为60％进行醇沉，得到多糖类组分E和液体组分；在所述液体组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90～92％进行醇沉，得到多糖类组分Z；所述低级醇包括甲醇和/或乙醇；
(8)将所述多糖类组分A、多糖类组分B、多糖类组分C、多糖类组分D、多糖类组分E和多糖类组分Z合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物；
所述步骤(5)、步骤(6)和步骤(7)没有时间先后顺序。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤(5)～(8)替换为：
在所述水洗脱组分、30％醇洗脱组分和60％醇洗脱组分中分别加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉多糖组分、30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分；将所述水洗醇沉多糖组分、30％甲醇洗醇沉多糖组分和60％甲醇洗醇沉多糖组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物；所述低级醇包括甲醇和/或乙醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤(4)～(8)替换为：
将所述脱蛋白水溶性组分置于大孔吸附树脂柱中，分别利用水和甲醇体积分数为60％的甲醇水溶液进行洗脱，分别收集2个洗脱液后浓缩，得到水洗脱组分和60％醇洗脱组分；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
分别在所述水洗脱组分和60％醇洗脱组分中加入低级醇至低级醇体积分数为90％，进行醇沉，分别得到水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分；所述低级醇包括甲醇和/或乙醇；
将所述水洗醇沉组分和60％醇洗醇沉组分合并，得到民族药双参低分子量水溶性提取物。
4.权利要求1～3任一项所述制备方法得到的民族药双参低分子量水溶性提取物，所述民族药双参低分子量水溶性提取物的相对分子量为504～33000。
5.一种民族药双参低分子量均一多糖，包括具有式I所示结构的低分子量多糖LTGP-B1、具有式II所示结构的低分子量多糖LTGP-C3、具有式III所示结构的低分子量多糖LTGP-D2和具有式a-b-c-d所示连接结构的低分子量多糖LTGP-E1中的一种或几种；
Figure FDA0004054377130000021
式I，所述式I具体为：
Figure FDA0004054377130000022
Figure FDA0004054377130000023
式II，所述式II具体为：
Figure FDA0004054377130000024
Figure FDA0004054377130000025
式III，所述式IIII具体为：
Figure FDA0004054377130000026
Figure FDA0004054377130000031
所述式a-b-c-d具体为：
Figure FDA0004054377130000032
6.权利要求5所述民族药双参低分子量均一多糖的制备方法，
(1)所述低分子量多糖LTGP-B1的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分B进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LBT1组分、LBT2组分、LBT3组分和LBT4组分；所述葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LBT2组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LBT21组分、LBT22组分、LBT23组分和LBT24组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所述LBT22组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-B1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为4:1；
(2)所述低分子量多糖LTGP-C3的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；所述葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LCT3组分进行大孔树脂柱除色，得到低分子量多糖LTGP-C3；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
(3)所述低分子量多糖LTGP-D2的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-D2；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
(4)所述低分子量多糖LTGP-E1的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分E进行反向ODS柱层析分离，依次得到LET1组分和LET2组分；所述反向ODS柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LET1组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LET11组分、LET12组分和LET13组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所LET11组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-E1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为6:1。
7.一种民族药双参低分子量寡糖，利用α-糖苷酶对民族药双参低分子量均一多糖进行水解得到，所述民族药双参低分子量均一多糖包括权利要求5所述的民族药双参低分子量均一多糖中的低分子量多糖LTGP-B1或权利要求6所述制备方法得到的低分子量多糖LTGP-B1；
所述民族药双参低分子量寡糖的相对分子量为504～1620。
8.一种民族药双参低分子量总多糖，其特征在于，包括权利要求5所述的民族药双参低分子量均一多糖、权利要求6所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、低分子量多糖LTGP-A1、低分子量多糖LTGP-C1、低分子量多糖LTGP-C2低分子量多糖和低分子量多糖LTGP-D1；所述民族药双参低分子量总多糖的相对分子量为504～33000；
所述低分子量多糖LTGP-A1的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分A进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LAT1组分、LAT2组分和LAT3组分；所述葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LAT2组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-A1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为6:1；
所述低分子量多糖LTGP-C1和低分子量多糖LTGP-C2的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分C进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，依次得到LCT1组分、LCT2组分、LCT3组分和LCT4组分；所述葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离的洗脱剂为水；
将所述LCT2组分进行大孔树脂柱除色，依次得到LCT21组分和LCT22组分；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
将所述LCT22组分进行硅胶柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-C1；所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，所述氯仿-甲醇混合溶剂中氯仿和甲醇的体积比为5:1；
将所述LCT3组分进行大孔树脂柱除色，得到低分子量多糖LTGP-C2；所述大孔树脂柱除色的洗脱剂为水；所述大孔吸附树脂柱包括AB-8大孔吸附树脂柱或101大孔吸附树脂柱；
所述低分子量多糖LTGP-D1的制备方法包括以下步骤：
将权利要求1所述制备方法得到的多糖类组分D进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，得到低分子量多糖LTGP-D1；所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离的洗脱剂为水。
9.权利要求4所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、权利要求5所述的民族药双参低分子量均一多糖、权利要求6所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、权利要求7所述的民族药双参低分子量寡糖或权利要求8所述的民族药双参低分子量总多糖在制备防治糖尿病或糖尿病肾病的药物中的应用。
10.一种药物组合物，包括活性组分和药用辅料；所述活性组分包括权利要求4所述的民族药双参低分子量水溶性提取物、权利要求5所述的民族药双参低分子量均一多糖、权利要求6所述制备方法得到的民族药双参低分子量均一多糖、权利要求7所述的民族药双参低分子量寡糖和权利要求8所述的民族药双参低分子量总多糖中的一种或几种。
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