CN110051726A - 一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用 - Google Patents

一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用。以青钱柳叶为原料，经乙醇水溶剂提取，有机溶剂萃取，通过色谱柱洗脱和大孔树脂洗脱，得到总黄酮，青钱柳叶药渣再经热水提取，沉淀，除蛋白，大孔树脂吸附杂质，得到总多糖。经研究表明，通过本发明方法制备的总三萜、总黄酮和总多糖以及其组合物能有效增加3T3‑L1脂肪细胞的葡萄糖摄取，显著降低遗传性糖尿病db/db小鼠的空腹血糖水平，具有抗糖尿病活性，可用于制备降血糖的抗糖尿病药物、保健食品和功能食品等产品。本发明开发了一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的综合制备方法及其抗糖尿病的用途，为推广利用和深加工中药材和新食品原料提供了依据和新的应用方向。

Description

一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用
技术领域
本发明属医药食品技术领域，具体涉及一种青钱柳叶中总三萜、总黄酮和总多糖的制备方法，以及利用该方法获得的总三萜、总黄酮和总多糖在制备抗糖尿病药物、保健食品和功能食品等产品中的应用。
背景技术
青钱柳叶为胡桃科青钱柳属植物青钱柳Cyclocarya paliurus(Batalin)Iljinsk.的干燥叶。青钱柳是我国特有的单种属植物，广泛分布于江西、浙江、安徽、湖南、广东等长江以南地区。民间将其叶作为茶饮，该茶味甜，具有生津止渴、清热解暑、降血糖、降血压和延年益寿的功效。2013年底，经国家卫计委批准青钱柳叶成为新食品原料。现代药理实验证实青钱柳叶具有治疗糖尿病、高脂血症、高血压及肥胖的作用，目前研究表明青钱柳叶中的三萜类、黄酮类、多糖类物质都能显著降低糖尿病小鼠血糖水平。
Zhu等人(Zhu KN,Jiang CH,Tian YS,et al.Two triterpeniods fromCyclocarya paliurus(Batal)Iljinsk(Juglandaceae)promote glucose uptake in 3T3-L1adipocytes:The relationship to AMPK activation.Phytomedicine,2015,22(9):837-846.)研究了青钱柳叶80％乙醇提取物的氯仿部位以及从中分离得到的两个三萜类主要成分cyclocaric acid B和cyclocarioside H的降糖作用，结果表明对于3T3-L1脂肪细胞，该部位和两个三萜类成分均能显著促进其葡萄糖消耗。Wu等人(Wu ZF,Meng FC,CaoLJ,et al.Triterpenoids from Cyclocarya paliurus and their inhibitory effecton the secretion of apoliprotein B48in Caco-2cells.Phytochemistry,2017,142,76-84.)从青钱柳叶80％乙醇提取物的氯仿部位分离得到了22个三萜类成分，发现三萜类成分能有效抑制Caco-2细胞apoB48的分泌，降低高脂饲料喂养的高血脂症大鼠血脂水平。Liu等人(Liu Y,Cao Y,Fang S,et al.Antidiabetic effect of Cyclocarya paliurusleaves depends on the contents of antihyperglycemic flavonoids andantihyperlipidemic triterpenoids.Molecules,2018,23(5):1042/1-1042/17.)利用链霉素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型研究青钱柳叶里不同化学成分与其抗糖尿病之间的联系，揭示了青钱柳总黄酮的潜在抗高血糖能力以及总三萜的抗高血脂作用。黄玲等人(黄玲,轩彤瑶,易黎明,等.青钱柳总黄酮对3T3-L1前脂肪细胞胰岛素抵抗作用研究.中南药学,2018,16(5):637-640.)发现青钱柳总黄酮能促进3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化，增加脂肪细胞葡萄糖摄取，改善脂肪细胞胰岛素抵抗。施利仙等人(施利仙,上官新晨,王文君,等.青钱柳多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用.营养学报,2009,31(3):263-266.)通过实验研究表明青钱柳多糖具有降低糖尿病小鼠血糖的作用。中国专利CN101792479A提供了一种青钱柳中常春藤皂苷H的提取工艺，主要特征为90％乙醇提取，石油醚、乙醚脱脂，取其正丁醇萃取液，HPD400型大孔树脂纯化获得。中国专利CN103242422A公开了一种从青钱柳叶中提取青钱柳酸A的方法，主要特征为50～90％甲醇溶液超声提取，大孔树脂纯化，高速逆流色谱再纯化获得。中国专利CN103232515A公开了一种制备青钱柳苷Ⅰ的方法，其特征为50～80％甲醇浸泡提取，大孔树脂40～70％乙醇溶液洗脱纯化，之后再用大孔树脂吸附并以乙酸乙酯、甲醇洗脱获得。中国专利CN107536866A公开了一种青钱柳总黄酮的制备方法，其特征为加入复合酶进行酶法提取，活性炭脱色，大孔树脂纯化，获得所述青钱柳总黄酮。中国专利CN109266702A公开了一种青钱柳提取多糖的方法，其特征为加入复合酶液进行初步酶解，纤维素酶液二次酶解，热水浸提，sevage法脱蛋白，双氧水脱色纯化。中国专利CN103694364A提供了一种青钱柳多糖和黄酮同步提取分离与纯化的方法，其特征为50％乙醇浸泡提取，稀氨水调节，AB-8大孔树脂及D301强酸型阳离子交换树脂串联吸附并以70％乙醇，0.5mol/L氨水依次洗脱，获得所述青钱柳总黄酮和总多糖。陈木森等人(陈木森,上官新晨,徐睿庸,等.大孔树脂纯化青钱柳多糖的研究.西北农业学报,2007,16(4):275-278.)筛选并采用D301R大孔树脂纯化青钱柳多糖，即在30℃，PH为7，浓度为4mg/mL，吸附流度为1.5mL/min的条件下，用0.4mol/L氯化钠洗脱，多糖洗脱率达到82.12％。柳旭光(柳旭光.青钱柳黄酮的提取分离、抗氧化活性及其应用研究[D].广西:广西大学,2012,1-85.)研究了青钱柳黄酮的纯化工艺，结果表明用聚酰胺材料反相洗脱体系更适合纯化青钱柳总黄酮。郝翻(郝翻.青钱柳黄酮和皂甙化合物同步提取及纯化技术研究[D].湖南:湖南农业大学,2009,1-58.)确定了同步提取总黄酮和总皂苷的优化条件，并筛选出了同步纯化青钱柳总黄酮和总皂苷的大孔吸附树脂X-5。未见有关本申请所公开的以聚酰胺材料正相洗脱串联大孔树脂材料反相洗脱体系为核心的综合同步分别制备总三萜、总黄酮和总多糖的制备工艺的研究或报道。
目前多数提取或纯化方法主要为水或者是有机溶剂(如乙醇)直接浸提或者回流提取，提取物纯度较低，并且仅仅集中于单一地提取一种成分，总三萜或者总多糖或者总黄酮，在提取这些成分的同时，舍弃了其它活性成分，难以实现青钱柳资源的高效利用与产业化。本发明专利公开的一种采用高浓度乙醇和水依次提取，经聚酰胺树脂和大孔树脂组合，以亲脂性有机溶剂和乙醇水溶液分步洗脱，同时提取纯化青钱柳叶中总三萜、总黄酮及总多糖三类有效成分的方法，有效地避免了单一提取所带来的资源浪费，并且采用组合树脂技术对三萜、黄酮与多糖进行了有效的纯化，可获得纯度较高的目标活性物质，提高了青钱柳叶的综合利用率，降低了青钱柳叶深加工的成本，同时制备方法更为简便，实用，易于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法，是在前期研究(申请号CN201811598696.7)的基础上，进一步提供的一种从青钱柳叶中综合提取制备总三萜，总黄酮和总多糖的方法，通过以下步骤实现：将青钱柳叶按药材/溶剂(重量/体积比)加入5-12倍量的乙醇水混合溶液，室温浸提或回流提取2-3次，合并乙醇提取液，过滤，滤液用于进一步分离总三萜和总黄酮，滤渣用于进一步提取总多糖。青钱柳乙醇水提取液减压浓缩至无醇味，先用石油醚脱色，然后用中极性有机溶剂等体积萃取，回收溶剂得到浸膏，所得浸膏直接与1至2倍(重量比)的聚酰胺材料吸附，再将3至10倍的聚酰胺装入柱色谱，先经有机溶剂洗脱、浓缩获得粗三萜浸膏，再用50％～95％乙醇水混合溶液(体积比)洗脱、浓缩获得粗黄酮浸膏。粗三萜浸膏按专利申请201811598696.7所述方法，用蒸馏水分散溶解后，上大孔树脂柱，先用20％～50％乙醇水混合溶液洗去杂质，收集50％～95％乙醇水洗脱液，干燥得到高纯度总三萜。粗黄酮浸膏用蒸馏水分散溶解后，吸附于大孔树脂柱上，先用水洗去杂质，然后用40％～70％乙醇水混合溶液洗脱。收集40％～70％乙醇水洗脱液，减压浓缩至干，干燥得到高纯度总黄酮。
上述乙醇水提取后的青钱柳叶滤渣，再用5-12倍量的水，回流提取2-3次，合并水提取液，减压浓缩至原提液体积的1/4，加入5倍体积的95％乙醇水溶液，静置过夜，离心收集沉淀，真空干燥获得青钱柳粗多糖。粗多糖经蒸馏水溶解，用sevage法除去蛋白质(将三氯甲烷按多糖水溶液的1/5体积加入，然后用1/5三氯甲烷体积的正丁醇混合，剧烈振摇30min，离心后除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质)，水层减压浓缩至干，得到初步纯化的多糖。再用蒸馏水溶解，加入1至2倍的大孔树脂(重量比)恒温水浴振荡吸附杂质，过滤，滤液减压浓缩至干，得到高纯度总多糖。
上述提取青钱柳叶所用的乙醇水混合溶液的用量优选原料的8-10倍，浓度优选50％～95％乙醇(体积比)，更优选60％～80％乙醇(体积比)；萃取所用的中极性有机溶剂包括三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇或其中的两种的混合物；洗脱聚酰胺色谱柱获得粗三萜所用的有机溶剂为石油醚、己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等之中的两种按20:1至1:1的比例混合而成；洗脱聚酰胺色谱柱获得粗黄酮所用的乙醇水溶液浓度优选70％～95％(体积比)；大孔树脂柱色谱分离总三萜过程中，去除总三萜杂质所用的乙醇水溶液浓度优选40％(体积比)，收集总三萜洗脱液所用的乙醇水溶液浓度优选70％～80％；大孔树脂柱色谱分离总黄酮过程中，洗脱液所用的乙醇水溶液浓度优选60％。
所述恒温水浴振荡的温度优选50～60℃，振荡时间优选2～3h。
所述的聚酰胺材料的目数为60～200目，优选100～200目；大孔树脂类型选自DM130、AB-8、D101型号树脂材料。
与已知的文献对比，Zhu等人报道了青钱柳叶80％乙醇提取物的氯仿部位和两个三萜类成分cyclocaric acid B和cyclocarioside H的降糖活性，但并未研究总三萜、总黄酮和总多糖的同步纯化工艺。Wu等人报道的青钱柳叶80％乙醇提取物氯仿部位的三萜类成分能抑制Caco-2细胞apoB48的分泌，降低高血脂症大鼠血脂水平，同样也并未提供高纯度总三萜、总黄酮和总多糖的综合制备方法及降糖活性研究。Liu等人报道的青钱柳总黄酮和总三萜能有效改善糖尿病小鼠的高血糖症和高血脂症，并未研究青钱柳总三萜、总黄酮的提取纯化方法。黄玲等人报道的青钱柳总黄酮能有效增加脂肪细胞的葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗，不仅未涉及总黄酮的提取纯化方法，而且与本发明所申请的研究对象有所不同。施利仙等人报道了青钱柳多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用，其中涉及青钱柳多糖的提取纯化过程，包括热水浸提，醇沉，sevage法除去蛋白质，与本发明公开的关于青钱柳多糖纯化工艺内容有所不同。中国专利CN101792479A提供的一种青钱柳中常春藤皂苷H的提取工艺，与本发明所公开的研究对象以及制备方法都截然不同。中国专利CN103242422A公开的一种从青钱柳叶中提取青钱柳酸A的方法，同样也与本发明所涉及的研究对象以及提取纯化工艺明显不同。中国专利CN103232515A公开的一种制备青钱柳苷Ⅰ的方法，与本发明所公开的以聚酰胺材料正相洗脱串联大孔树脂材料反相洗脱体系为核心的同步制备总三萜、总黄酮和总多糖的制备工艺及主要成分明显不同。中国专利CN107536866A公开的一种青钱柳总黄酮的制备方法，即采用复合酶温和水提的方法，而在本发明所公开的总黄酮制备方法中采用的是高浓度乙醇水混合溶剂提取，并且后续纯化工艺也完全不同。中国专利CN109266702A公开了一种青钱柳提取多糖的方法，其中酶法提取，双氧水脱色的过程，相比于本发明公开的关于青钱柳多糖提取纯化工艺，前者深加工成本增加，多糖结构恐被破坏，不易控制。中国专利CN103694364A提供了一种青钱柳多糖和黄酮同步提取分离与纯化的方法，包括用稀氨水调节上样PH，AB-8大孔树脂及D301强酸型阳离子交换树脂的组合高压串联树脂纯化，与本发明所公开的总三萜、总黄酮和总多糖的综合制备工艺截然不同，另外所述多糖的总提取率在1.3％左右，而本发明公开的青钱柳总多糖的提取率在4.5％左右。陈木森等人报道了D301R大孔树脂纯化青钱柳多糖的效果良好，洗脱剂为0.4mol/L氯化钠溶液，其纯化方法与本发明公开的总多糖制备工艺部分有所不同。柳旭光报道的实验结果表明用聚酰胺材料反相洗脱体系更适合纯化青钱柳总黄酮，而本发明所公开的青钱柳总黄酮的纯化工艺采用的是聚酰胺材料正相洗脱串联大孔树脂材料反相洗脱体系。郝翻报道了同步提取总黄酮和总皂苷的优化条件，并筛选出了同步纯化青钱柳总黄酮和总皂苷的大孔吸附树脂X-5，仅是对于黄酮和皂苷为指标的提取物纯化，并未将黄酮和皂苷分开制备，与本发明公开的以聚酰胺材料正相洗脱串联大孔树脂材料反相洗脱体系为核心的总三萜、总黄酮和总多糖的综合制备工艺明显不同。
本发明同步综合制备总三萜，总黄酮，和总多糖，效率高，且制备工艺步骤简单易行，实用性强；大孔树脂和聚酰胺价格便宜，可再生和反复利用，成本低；并且大大提高了总三萜，总黄酮，总多糖的纯度，使三萜类成分含量在80％以上，总三萜的总提取率在2％以上；黄酮类成分含量在70％以上，总黄酮的总提取率在1％以上；多糖类成分含量在60％以上，总多糖的总提取率在4.5％以上。
本发明的另一个目的是提供通过上述方法制备获得的总三萜，总黄酮，总多糖在制备抗糖尿病药物、保健食品和功能食品中的应用。所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂。所述食品的剂型为压片糖果、固体饮料、面条、米粉。
本发明选取了3T3-L1脂肪细胞模型对总三萜，总黄酮，总多糖及其组合物的抗糖尿病活性进行了体外研究，结果显示总三萜，总黄酮，总多糖及其组合物(按照药材中提取的各组分比例2:1:5混合)能有效增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取。其中总三萜(10μg/mL)，总黄酮(10μg/mL)，总多糖(10μg/mL)，组合物(10μg/mL)的葡萄糖摄取百分率分别为124.27％，137.02％，145.45％，177.36％，表明它们均有显著的抗糖尿病活性，组合物的药效最好，优于单组分与阳性药白藜芦醇。
本发明进一步对总三萜、总黄酮、总多糖及其组合物进行了动物实验，采用db/db遗传性糖尿病小鼠模型，结果表明，总三萜、总黄酮、总多糖均能在一定程度上发挥抗糖尿病的药效，其2:1:5的按照药材中提取比例的组合物的药效最强，优于阳性药，比原植物提取物活性高出8倍以上，表明三种有效成分具有协同增效的效果，能够发挥强效抗糖尿病的药效。
本发明开发了青钱柳叶中总三萜，总黄酮，总多糖及其组合物的制备方法和抗糖尿病的用途，为推广利用和深加工中药材提供依据，并提供了新的应用方向。
附图说明
图1人参皂苷Re的标准曲线。
图2葡萄糖的标准曲线。
图3芦丁的标准曲线。
图4综合制备工艺简图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。
实施例1
干燥的青钱柳叶5kg，打粉，用50L的60％乙醇溶液室温浸提两次，每次7天。合并醇提取液，过滤，滤液用于进一步分离总三萜和总黄酮，滤渣用于进一步提取总多糖。滤液经减压浓缩至干，得醇提浸膏780g。醇提浸膏用1L的水分散，先后分别用石油醚、三氯甲烷等体积萃取，得到三氯甲烷萃取部分300g。三氯甲烷萃取部分上60-80目聚酰胺色谱柱，依次经石油醚:丙酮＝1:1，丙酮，70％乙醇溶液洗脱，收集石油醚丙酮洗脱液，获得粗三萜浸膏。聚酰胺色谱柱再用70％乙醇水混合溶液洗脱，浓缩获得粗黄酮浸膏。粗三萜浸膏用水分散溶解后，吸附于AB-8大孔树脂柱上，先用30％乙醇洗去杂质，后用60％乙醇洗脱。收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到总三萜干燥粉末115g，总提取率为2.3％。测得总三萜含量为80.3％。粗黄酮浸膏用水分散溶解后，吸附于AB-8大孔树脂柱上，先用水洗去杂质，后用40％乙醇洗脱。收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到总黄酮干燥粉末55g，总提取率为1.1％。测得总黄酮含量为76.4％。乙醇水提取后所剩的青钱柳叶滤渣，再用50L的水回流提取两次，每次2h。合并水提取液，减压浓缩至25L，加入5倍体积的95％乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置过夜，离心(5000r/min，15min)收集沉淀，50℃真空干燥，得到青钱柳粗多糖。粗多糖经水溶解，用sevage法除去蛋白质(将三氯甲烷按多糖水溶液的1/5体积加入，然后用1/5三氯甲烷体积的正丁醇混合，剧烈振摇30min成乳化液，蛋白质变性成胶状，离心后除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质)，然后在水层中加入1倍量的AB-8大孔树脂(重量比)，50℃恒温水浴振荡2h后过滤，滤液减压浓缩至干，得到总多糖干燥粉末255g，总提取率为5.1％。测得总多糖含量为60.5％。
实施例2
干燥的青钱柳叶10kg，打粉，用80L的70％乙醇溶液回流提取两次，每次2h。合并醇提取液，过滤，滤液用于进一步分离总三萜和总黄酮，滤渣用于进一步提取总多糖。滤液经减压浓缩至干，得醇提浸膏1600g。醇提浸膏用2L的水分散，先后分别用石油醚、乙酸乙酯等体积萃取，得到乙酸乙酯萃取部分610g。乙酸乙酯萃取部分上100-200目聚酰胺色谱柱，依次经二氯甲烷:丙酮＝1:1，丙酮，95％乙醇溶液洗脱，收集二氯甲烷丙酮洗脱液，获得粗三萜浸膏。收集95％乙醇洗脱液，获得粗黄酮浸膏。粗三萜浸膏用水分散溶解后，吸附于D101大孔树脂柱上，先用40％乙醇洗去杂质，后用70％乙醇洗脱。收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到总三萜干燥粉末305g，总提取率为3.1％。测得总三萜含量为85.4％。粗黄酮浸膏用水分散溶解后，吸附于D101大孔树脂柱上，先用水洗去杂质，后用70％乙醇洗脱。收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到总黄酮干燥粉末140g，总提取率为1.4％。测得总黄酮含量为73.3％。乙醇水提取后青钱柳叶滤渣再用80L的水回流提取两次，每次2h。合并水提取液，减压浓缩至40L，加入5倍体积的95％乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置过夜，离心(5000r/min，15min)收集沉淀，50℃真空干燥，得到青钱柳粗多糖。粗多糖经水溶解，用sevage法除去蛋白质(将三氯甲烷按多糖水溶液的1/5体积加入，然后用1/5三氯甲烷体积的正丁醇混合，剧烈振摇30min成乳化液，蛋白质变性成胶状，离心后除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质)，然后在水层中加入2倍量的D101大孔树脂(重量比)，55℃恒温水浴振荡2.5h后过滤，滤液减压浓缩至干，得到总多糖干燥粉末480g，总提取率为4.8％。测得总多糖含量为62.5％。
实施例3
干燥的青钱柳叶1kg，打粉，用10L的80％乙醇溶液回流提取两次，每次100min。合并醇提取液，过滤，滤液用于进一步分离总三萜和总黄酮，滤渣用于进一步提取总多糖。滤液经减压浓缩至干，得醇提浸膏180g。醇提浸膏用500mL的水分散，先后分别用石油醚、乙酸乙酯：正丁醇(10:1)等体积萃取，得到乙酸乙酯正丁醇萃取部分75g。乙酸乙酯正丁醇萃取部分上100-200目聚酰胺色谱柱，依次经丙酮，95％乙醇溶液洗脱，收集丙酮洗脱液，获得粗三萜浸膏。收集95％乙醇洗脱液，获得粗黄酮浸膏。粗三萜用水分散溶解后，吸附于DM130大孔树脂柱上，先用50％乙醇洗去杂质，后用80％乙醇洗脱。收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到总三萜干燥粉末35g，总提取率为3.5％。测得总三萜含量为81.1％。粗黄酮用水分散溶解后，吸附于DM130大孔树脂柱上，先用水洗去杂质，后用60％乙醇洗脱。收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到总黄酮干燥粉末18g，总提取率为1.8％。测得总黄酮含量为75.8％。乙醇水提取后青钱柳叶滤渣再用10L的水回流提取两次，每次100min。合并水提取液，减压浓缩至5L，加入5倍体积的95％乙醇溶液，边加边搅拌，室温下静置过夜，离心(5000r/min，15min)收集沉淀，50℃真空干燥，得到青钱柳粗多糖。用sevage法除去蛋白质(将三氯甲烷按多糖水溶液的1/5体积加入，然后用1/5三氯甲烷体积的正丁醇混合，剧烈振摇30min成乳化液，蛋白质变性成胶状，离心后除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质)，然后在水层中加入1.5倍量的DM130大孔树脂(重量比)，60℃恒温水浴振荡3h后过滤，滤液减压浓缩至干，得到总多糖干燥粉末53g，总提取率为5.3％。测得总多糖含量为64.7％。
实施例4
本发明所述的总三萜含量，由紫外可见分光光度法以人参皂苷Re为对照品进行测定，方法如下：
(1)标准曲线的确定(附图1)
精密称定人参皂苷Re对照品5.47mg，加甲醇定容成25mL制成总皂苷标准溶液。精密量取标准溶液0，0.2，0.4，0.5，0.6，0.8mL(相当于标准品0，40，80，100，120，160μg)，分别加入50mL小烧杯中，50℃水浴蒸干。在已挥干的小烧杯中加入0.2mL的5％香草醛-冰醋酸溶液，转动小烧杯使残渣溶解，再加入0.8mL高氯酸，摇匀，保鲜膜封口，于60℃水浴加热15min，冷却后加入冰醋酸5.0mL，摇匀后在紫外-可见分光光度计560nm处测定吸光度。所得人参皂苷Re标准曲线如图1所示。
(2)总三萜的含量测定方法
取总三萜粉末适量，加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，60℃水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0mL，摇匀，以相应的溶液为空白。在560nm处用紫外分光光度仪测定吸光度，计算得到总三萜含量。
实施例5
本发明所述的总多糖含量，由紫外可见分光光度法以葡萄糖为对照品进行测定，方法如下：
(1)标准曲线的确定(附图2)
准确吸取葡萄糖标准使用液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL(相当于葡萄糖0，10，20，40，60，80，100，120μg)置于25mL比色管中，补加水至2.0mL，加入5％苯酚溶液1.0mL，在涡旋混合器上混匀，小心加入浓硫酸10mL，在涡旋混合器上小心混匀，置沸水浴中2min，冷却至室温，用紫外-可见分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度。所得葡萄糖标准曲线如图2所示。
(2)总多糖的含量测定方法
取总多糖粉末适量，加水至2.0mL，加入5％苯酚溶液1.0mL，混匀，加入浓硫酸10mL，小心混匀，置沸水浴中2min，冷却至室温，以相应的溶液为空白。在485nm处用紫外分光光度仪测定吸光度，计算得到总多糖含量。
实施例6
本发明所述的总黄酮含量，由紫外可见分光光度法以芦丁为对照品进行测定，方法如下：
(1)标准曲线的确定(附图3)
精确称取芦丁标准品15.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配成150μg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL(相当于芦丁0，75，150，300，450，600μg)，分别移入10mL刻度比色管中，加入60％乙醇溶液至5mL，各加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后放置60min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用60％乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1cm的比色皿，在510nm处用紫外分光光度仪测定吸光度。所得芦丁标准曲线如图3所示。
(2)总黄酮的含量测定方法
取总黄酮粉末适量于10mL刻度比色管中，加入60％乙醇溶液至5mL，各加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后放置60min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用60％乙醇定容至刻度，以相应的溶液为空白。在510nm处用紫外分光光度仪测定吸光度，计算得到总黄酮含量。
实施例7抗糖尿病活性的体外研究
总三萜、总黄酮、总多糖及其组合物对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取影响研究。
方法：3T3-L1前脂肪细胞用含10％胎牛血清和1％双抗的高糖型DMEM培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，2天后再转移至含10％胎牛血清和DMI(1μM地塞米松，0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和5μg/mL胰岛素)的DMEM培养基中诱导分化2天，隔天更换新鲜培养液，第8天采集分化好的脂肪细胞。
为评价3T3-L1脂肪细胞的受试物安全给药浓度，以每孔10000个细胞密度接种3T3-L1细胞到96孔板，37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去培养液，加入用培养基配制一定浓度受试物干预24h，弃去培养液，每孔加入1mg/mL MTT的DMEM溶液，37℃孵育4h，弃去上清液，每孔加入100μL的DMSO，震荡10min，在酶标仪570nm波长处测定其吸光值，计算细胞活力，确定无细胞毒性的受试物浓度作为3T3-L1细胞葡萄糖摄取实验的浓度。细胞活力＝(实验组吸光值/空白对照组吸光值)×100％
实验时，完全分化的3T3-L1脂肪细胞接种于96孔板，并设无细胞空白对照孔。待细胞生长至80-90％融合，弃去原培养基，用KRP缓冲液洗2遍，换上含0.2％BSA的KRP培养液，分组加药。为刺激葡萄糖消耗，用含0.1μM胰岛素的KRP缓冲液孵育30min。设DMSO对照组，RSV(白藜芦醇)对照组(终浓度为5μM)和不同受试组。作用24h后，更换培养液，用含100μM2-NBDG的KRP培养液培养30min，立即于荧光酶标仪475nm和550nm波长处测定细胞内2-NBDG的含量，每组设3个以上复孔。相同实验重复6次。
数据用均数±标准差表示，组间比较采用t-检验。
结果：阳性药RSV和受试物作用于3T3-L1脂肪细胞24h后，与溶剂对照组比较，5μMRSV的葡萄糖摄取百分率为152.82％(P<0.01)；10μg/mL总三萜，总黄酮，总多糖，组合物(按照药材中提取的各组分比例2:1:5混合)的葡萄糖摄取百分率分别为124.27％(P<0.05)，137.02％(P<0.05)，145.45％(P<0.05)，177.36％(P<0.05)，具体数据见表1。
表1.受试物对3T3-L1脂肪细胞24h葡萄糖摄取的影响(n＝6)
组别 受试物浓度 葡萄糖摄取百分率(％)
DMSO 0.5％v/v 100.28±8.62<sup>##</sup>
RSV 5μM 152.82±5.76**
总三萜 10μg/mL 124.27±9.13*
总黄酮 10μg/mL 137.02±5.22*
总多糖 10μg/mL 145.45±7.32*
组合物 10μg/mL 177.36±4.15*
实施例8抗糖尿病活性的体内研究
总三萜、总黄酮、总多糖及其组合物对遗传性糖尿病db/db小鼠的空腹血糖水平影响研究。
方法：选取空腹血糖值接近的9-11周龄db/db小鼠，根据空腹血糖值和体重分为7组，每组5只，组间血糖值和体重无显著性差异。阴性对照组给予0.5％CMC-Na，阳性对照组给予罗格列酮10mg/kg，总三萜组给予总三萜30mg/kg，总黄酮组给予总黄酮30mg/kg，总多糖组给予总多糖30mg/kg，水提浸膏组给予水提浸膏30mg/kg，组合物组给予组合物30mg/kg。各组均以20ml/kg灌胃给药，每天1次。每天记录进食量和进水量。给药后每周于末次给药后禁食5～6小时，尾静脉取血，3000rpm×10min，分离血清，测定血糖(Glucose)值。给药3周后眼眶取血，3000rpm×10min，分离血清，测定空腹血糖指标。血糖值测定采用葡萄糖氧化酶法。
结果：灌胃给药1周时，与阴性对照组比较，各给药组血糖值均有所降低，其中罗格列酮10mg/kg组、总三萜30mg/kg组、总黄酮30mg/kg组、总多糖30mg/kg组以及组合物30mg/kg组血糖值与阴性对照组比较分别下降了23.61％(P<0.05)、8.53％(P<0.05)、10.14％(P<0.05)、12.91％(P<0.05)和28.33％(P<0.05)。给药2周时罗格列酮、总三萜、总黄酮、总多糖以及组合物组血糖值与阴性对照组比较分别下降了40.13％(P<0.01)、18.64％(P<0.01)、21.12％(P<0.01)、26.34％(P<0.01)和49.03％(P<0.01)；3周时，罗格列酮、总三萜、总黄酮、总多糖以及组合物组血糖值与阴性对照组比较分别下降了70.11％(P<0.01)、40.51％(P<0.01)、46.53％(P<0.01)、50.32％(P<0.01)和82.13％(P<0.01)。具体数据见表2。
表2.受试物对遗传性糖尿病db/db小鼠的空腹血糖水平影响(n＝5)
以上结果表明，青钱柳各主要有效成分均能在一定程度上发挥抗糖尿病的药效，其2:1:5的按照药材中提取比例的组合物的药效最强，优于阳性药，比原植物提取物活性高出8倍以上，表明三种有效成分具有协同增效的效果，能够发挥强效抗糖尿病的药效。
实施例9片剂的制备
总三萜20.0g，总黄酮10.0g，总多糖50.0g，与淀粉500g混匀，加10％淀粉浆10g制成软材，加入硬脂酸镁0.1g，干淀粉8g混匀后压制成2000片，即得。每片含总三萜10mg，总黄酮5mg，总多糖25mg。
实施例10滴丸剂的制备
精密称取1.0g的总三萜，1.0g的总黄酮，1.0g的总多糖，加适量无水乙醇，微热溶解，加入到3.75g的PEG4000熔融液中，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽，静置于90℃水浴上保温30min。待气泡除尽，在保温的条件下，用1.6mm的注射器吸取熔融物，控制滴距在6～8cm范围内，冷却高度为15cm，滴入5℃冷凝液液体石蜡中待冷凝完全，倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去滴丸上的冷凝液，即得。每粒滴丸含总三萜10mg，总黄酮10mg，总多糖10mg。
实施例11固体饮料的制备
称取40.0g的总三萜，20.0g的总黄酮，100.0g的总多糖与麦芽糊精500g混匀，加入木糖醇140g，混匀，加适量水制粒，干燥，分装为8g每袋，共计100袋即得。每袋含总三萜400mg，总黄酮200mg，总多糖1000mg。

Claims (10)

1.一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)制备总黄酮：将青钱柳叶按重量/体积比的药材/溶剂加入5-12倍量的乙醇水混合溶液，室温浸提或回流提取2-3次，合并提取液，过滤，青钱柳乙醇水提取液减压浓缩至无醇味，先用石油醚脱色，再用中极性有机溶剂萃取，回收溶剂得到浸膏，所得浸膏直接用重量比1至2倍的聚酰胺材料吸附，再将3至10倍的聚酰胺材料装入柱色谱，先经有机溶剂洗脱、浓缩获得粗三萜浸膏，再用体积比50％～95％乙醇水混合溶液洗脱、浓缩获得粗黄酮浸膏，粗黄酮浸膏用水分散溶解后，上大孔树脂柱，先用水洗去杂质，然后用40％～70％乙醇水混合溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得到总黄酮；
(2)制备总多糖：乙醇水提取后青钱柳叶滤渣再用5-12倍量的水，回流提取2-3次，合并水提取液，减压浓缩至原提液体积的1/4及以下，加入5倍体积的95％乙醇水溶液，静置过夜，收集沉淀，干燥获得青钱柳粗多糖，粗多糖经水溶解，用sevage法除去蛋白质，得到初步纯化的多糖，再用水溶解，加入重量比1至2倍的大孔树脂恒温水浴振荡吸附杂质，过滤，滤液减压浓缩，干燥，得到总多糖。
2.根据权利要求1所述的一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)提取用的乙醇水混合溶液的浓度为50％～95％乙醇，更优选60％～80％乙醇；萃取所用的中极性有机溶剂包括三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇或其中的两种的混合物；洗脱聚酰胺色谱柱获得粗黄酮所用的乙醇水溶液浓度优选体积比70％～95％；大孔树脂柱色谱富集总黄酮过程中，洗脱液所用的乙醇水溶液浓度优选60％，上述大孔树脂柱选用DM130、AB-8、D101型号树脂材料。
3.根据权利要求1所述的一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的聚酰胺材料的目数为60～200目。
4.根据权利要求1所述的一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中粗三萜浸膏用蒸馏水分散溶解后，上大孔树脂柱，先用20％～50％乙醇水混合溶液洗去杂质，收集50％～95％乙醇水洗脱液，干燥得到高纯度总三萜。
5.根据权利要求1所述方法制备的总黄酮和总多糖在制备抗糖尿病及其并发症的药物中的应用。
6.根据权利要求4所述方法制备的总三萜在制备抗糖尿病及其并发症的药物中的应用。
7.根据权利要求1所述方法制备的总黄酮和总多糖在制备抗糖尿病及其并发症的保健食品和功能食品产品中的应用。
8.根据权利要求4所述方法制备的总三萜在制备抗糖尿病及其并发症的保健食品和功能食品产品中的应用。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述服药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述食品的剂型为压片糖果、固体饮料、面条、米粉。
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