CN101336987B - 一种枳椇总黄酮的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枳椇总黄酮的制备方法。该方法是采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、液-液逆流分配色谱法、超临界流体萃取法或柱色谱法中任意一种方法，或这些方法的任意组合，从枳椇果柄、果实、种子、种壳、根、茎、叶、花、枝、皮、皮和果渣等任一部位或其组合制备枳椇总黄酮；制备的总黄酮为多种黄酮类活性成分的组合，其中最主要的活性成分槲皮素、山萘酚、(+)-二氢杨梅素、杨梅素、北枳椇醇、(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III及其衍生物等；各黄酮类成分百分含量的总和以重量计为5～100％，可用于医药工业、食品工业、化妆品工业和保健品工业。

Description

一种枳椇总黄酮的制备方法

技术领域

本发明涉及一种枳椇总黄酮的制备方法、质量控制方法及其在医药、食品、化妆品和保健品领域的应用，属于天然产物领域。

背景技术

枳椇(Hovenia acerba Lindl)为鼠李科拐枣属植物，别名南枳椇、拐枣、木蜜、拐枣、鸡爪子、万字果、金果等，为一种非常珍贵的药食兼用果树，主要分布陕西、江西、安徽、浙江、广东、福建、湖北、湖南、广西、四川、贵州、云南等省，资源极为丰富。以带有肉质果柄的果实或种子入药，称为“枳椇子”，具有止渴除烦、解酒毒、利二便、醒酒安神、祛风通络止痉，补充营养和降血压等作用，主治醉酒，烦热，口渴，呕吐，二便不利；同时，枳椇的果柄、果实、叶、花、根皮等民间也用入药，有治疗风湿等作用；属于养阴、生津、润燥、止渴、凉血类药物。

黄酮为枳椇的有效活性成分，主要结构为黄酮醇(苷)、黄烷醇和二氢黄酮醇类黄酮化合物，具有保肝、解酒毒、抗菌、抗氧化等作用。

目前没有枳椇总黄酮制备方法的文献报道，严重的限制了枳椇黄酮的利用和药效作用的发挥。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枳椇果柄、果实、种子、种壳、叶、花、根、茎、枝、皮和果渣等总黄酮的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种枳椇总黄酮作为药物制剂、药品辅料或功能因子在药品、食品、化妆品和保健品领域的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种枳椇总黄酮可单独作为制剂或与某些保肝、解酒和抗氧化药合用制成剂型，应用于药品、食品、化妆品和保健品领域。

本发明提出的枳椇总黄酮，是从枳椇子、果柄、果实、种子、种壳、叶、花、根、茎、枝、皮和果渣等部位提取出来的黄酮类活性成分的组合，其中主要化合物结构如下：

本发明所述材料，来源于鼠李科枳椇属植物枳椇(Hovenia acerba Lindl)。作为提取枳椇总黄酮的原材料，可以是市售枳椇子，也可以是枳椇果柄、果实、种子、种壳、叶、花、根、茎、枝、皮和果渣等任一部位或全部植株，其中优选的药材部位为枳椇果柄、果实、种子和果渣。上述所述的枳椇包括未经任何炮制处理的原药材及饮片，还包括各种炮制品。

本发明所述的枳椇总黄酮，是指从上述植物的任何部位提取得到的，含有多种黄酮类活性成分的组合物。这些总黄酮类成分主要包括槲皮素、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖基-(1-6)-β-D-半乳糖苷、异槲皮素、芦丁、(+)-二氢杨梅素、4’，5’，7-三羟基-3’，5’-二甲氧基黄酮、杨梅素、洋芹素、花旗松素、北枳椇醇、山萘酚、山萘酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、(+)-焦儿茶素、山萘酚-3，7-O-α-L-二鼠李糖苷、山萘酚-3-O-α-L-鼠李糖-(1→6)-O-β-D-半乳糖苷、3，4’，5，5’，7-五羟基-3’-甲氧基黄酮、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III等。

本发明所述的枳椇各种黄酮活性成分之中，其最主要的是槲皮素、山萘酚、(+)-二氢杨梅素、杨梅素、北枳椇醇、(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III及其衍生物等。

作为枳椇总黄酮提取物，其中各黄酮类成分百分含量的总和为5～100％(W/W)，其中优选的为50～100％(W/W)。

本发明所述的制备枳椇总黄酮，除了可用于医药工业，还可用于食品工业、化妆品工业和保健品工业。

本发明所述的制备枳椇总黄酮可单独制成制剂或与其他抗氧化、解酒毒、保肝养肝等药物合用，用于酒精中毒、肝病和因自由基所致的各种疾病等的治疗；这些制剂具有与枳椇总黄酮全部相同或相近的药理活性和用途。

本发明还提出了枳椇总黄酮提取物的制备方法，枳椇子或果柄、果实、种子、种壳、根、茎、叶、花、枝、皮和果渣等任一部位或其组合，它可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1)溶剂提取法；(2)溶剂萃取法；(3)大孔吸附树脂法；(4)超临界流体萃取法；(5)柱色谱法；(6)液-液逆流分配色谱法。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1)提取：所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类或酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂。提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、索氏提取、冷浸、渗漏、微波提取、高压提取等。

优选的加热回流提取工艺为：用0～95％乙醇溶液(V/V)，溶剂用量为5～20倍量(mL/g)，50～100℃回流提取2～3h，回流提取2～5次。

优选的索氏提取工艺为：用0～95％乙醇溶液(V/V)，以料液比为1∶10～50(g/mL)，60～100℃连续加热回流提取5～12h。

优选的超声提取工艺为：将枳椇提取材料装入超声提取器内，按料液比为1∶6～15(g/mL)加入70％乙醇溶液(V/V)，采用温度为30～50℃，频率为40kHz、功率为0.3～0.5W/cm²的超声波提取15～30分钟，提取2～3次，合并提取液。

优选的微波提取工艺为：以固液比1∶20～40(g/mL)加入0～95％乙醇溶液(V/V)浸泡20～60分钟，控制微波功率为900W，照射30～50秒，取出后迅速冷却至室温，再照射20～40秒，同法操作重复3～5次，过滤，合并提取液。

(2)过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合：醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。

优选的过滤方法是使用硅藻土助滤剂：用300号硅藻土和90℃热水对硅藻土过滤机进行预涂和杀菌，再用20号硅藻土和90℃热水对硅藻土过滤机进行预涂和杀菌，将提取液用硅藻土过滤机过滤得滤液。

(3)浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。

(4)干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

当采用萃取法进行制备时，一般先将提取物混悬于水中，然后用烷烃类(如石油醚、己烷、汽油等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适的极性溶剂，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总黄酮成分，得到总黄酮。

当采用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型，如D101、D4020、D3500、D941、D21、HP-20、HP-20、XDA-1、AB-8、HPD400、S-8、HZ-806、H-50、H-30、LX-38、LX-28、LS-300B、LS-306、LSD-958、PA等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如LX-28、D101、PA等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为50～95％的乙醇溶液(V/V)。

当采用超临界流体萃取法进行制备时，可以对枳椇原料直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物：水、醇类、酮类、酯类及醚溶剂。

当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex-20系列)、C-8、C-18、活性碳、纤维素等，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。优选的是聚酰胺柱色谱法。

优选的聚酰胺柱色谱法制备工艺为：选用聚酰胺，枳椇黄酮粗提取物上样液浓度1∶4～1∶16(以生药量(g)：分散毫升数)，吸附流速2～9BV/h，树脂柱径高比1∶3～1∶15，上样量为100～500mg/mL(以生药量计)，0～20％乙醇溶液(V/V)洗脱1～5倍树脂体积进行除杂，除杂流速为2～7BV/h，用50～95％乙醇溶液(V/V)洗脱3～7倍树脂体积，洗脱流速为2～9BV/h，收集洗脱液，减压回收溶剂，残留物减压干燥，得枳椇总黄酮。

当采用液-液逆流萃取法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。一般是将提取物混悬于水中，然后用低极性的烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、己烷、汽油等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总黄酮成分，得枳椇总黄酮。

该提取物可以单独或与其它任何中西药、食物、其他辅料按任意比例配伍，用于制备药物、食品、保健品和化妆品，所得的药物、食品、保健品和化妆品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。

本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或两种：

1.总黄酮

精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品250mg，用无水甲醇溶解，转移入250mL容量瓶中，用无水甲醇定容，摇匀。精确移取5.00mL置于50mL容量瓶中，用无水甲醇定容，摇匀。此芦丁对照品溶液浓度为0.1mg/mL。准确吸取0.1mg/mL芦丁对照品溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL，分别置于25mL容量瓶中，各加50％乙醇溶液(V/V)至6mL，分别加5％亚硝酸钠溶液(W/V)1.00mL，摇匀，放置6min后分别加10％硝酸铝溶液(W/V)1.00mL，摇匀，放置6min，再分别加1％氢氧化钠溶液(W/V)10.00mL，再用50％乙醇溶液(V/V)定容，摇匀，放置15min后，以空白溶液为参比，在波长510nm处测吸光度，得回归方程。

分别准确吸取枳椇黄酮提取物样品各3份，每份20mg，置50mL容量瓶中，加50％乙醇溶液(V/V)超声溶解并稀释至刻度，摇匀。按所述显色并在510nm波长处测定其吸光度A，由回归方程计算样品中总黄酮含量。

2.槲皮素、山萘酚和北枳椇醇的含量

色谱条件：色谱柱：反相C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：30～85％甲醇溶液(V/V)(用磷酸调pH至3.0)洗脱(0～20min)；流速：1.0mL/Min；检测波长：360nm；柱温：室温。

标准曲线绘制：分别精密吸取称取槲皮素、山萘酚和北枳椇醇对照品，用甲醇溶解分别配制成浓度为100、288、190μg/mL对照品溶液，0、2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批总黄酮提取物样品各3份，每份约20mg，置于50mL量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为槲皮素、山萘酚和北枳椇醇含量测定的供试样品溶液，精密吸取上述供试样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

3.(+)-二氢杨梅素

色谱条件：色谱柱：反相C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：25～40％甲醇溶液(V/V)(用磷酸调pH至3.0)洗脱(0～50min)；流速：1.0mL/Min；检测波长：294nm；柱温：室温。

标准曲线绘制：分别精密吸取(+)-二氢杨梅素对照品溶液(2.0μg/μL)0、2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批总黄酮提取物样品各3份，每份约20mg，置于50mL量瓶中，加20％乙腈溶液(V/V)超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为(+)-二氢杨梅黄素含量测定的供试样品溶液，精密吸取上述供试样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

4.杨梅素

色谱条件：色谱柱：反相C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：40～60％甲醇溶液(V/V)(用磷酸调pH至3.0)洗脱(0～50min)；流速：1.0mL/Min；检测波长：370nm；柱温：室温。

标准曲线绘制：精密称取杨梅素对照品9.80mg、置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，配成9.8、19.6、29.4、39.2、49.0μg/mL系列浓度的杨梅素溶液注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批总黄酮提取物样品各3份，每份约20mg，置于50mL量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为杨梅素含量测定的供试样品溶液，精密吸取上述供试样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

4.(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III

色谱条件：色谱柱：反相C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：15～40％甲醇溶液(V/V)洗脱(0～40min)；流速：1.0mL/Min；检测波长：280nm。

标准曲线绘制：分别精密吸取(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III对照品溶液(0.027μg/μL)0、2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照进样量(μg)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批总黄酮提取物样品各3份，每份约20mg，置于50mL量瓶中，用50％甲醇溶液(V/V)溶液超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III含量测定的供试样品溶液，精密吸取上述供试样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

具体实施方式

实施例1：枳椇总黄酮的制备方法

成熟干燥枳椇子1Kg粉碎至60目，以固液比1∶7(g/mL)加入60％乙醇溶液(V/V)浸泡60分钟，控制微波功率为900W，照射30秒，取出后迅速冷却至室温，再照射40秒，同法操作重复3次，过滤，合并提取液。提取液减压浓缩至20％(V/V)，将其悬浮于水，然后依次用正己烷、乙酸乙酯萃取；取乙酸乙酯萃取物用硅藻土过滤机过滤：先用300号硅藻土和90℃热水对硅藻土过滤机进行预涂和杀菌，再用20号硅藻土和90℃热水对硅藻土过滤机进行预涂和杀菌，然后将提取液用硅藻土过滤机过滤得滤液；真空浓缩干燥得枳椇总黄酮。测定总黄酮的含量为75％，其中槲皮素、山萘酚、(+)-二氢杨梅素、杨梅素、北枳椇醇、(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III及其衍生物等含量和为63％。

实施例2：枳椇总黄酮的制备方法

取成熟干燥枳椇种子1Kg粉碎，过100目筛，加入7倍量(mL/g)70％乙醇溶液(V/V)，回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩除去乙醇，将其悬浮于水，石油醚萃取除去色素等杂质，水相提取液上LX-38型大孔树脂柱，缓慢上样，先用水洗脱4个柱留体积，改用10％乙醇溶液(V/V)洗脱5倍柱留体积，最后用95％乙醇溶液(V/V)洗脱，当10％AlCl₃溶液(W/V)检测成阴性时，停止收集，合并95％乙醇溶液(V/V)洗脱溶剂，真空浓缩干燥得枳椇总黄酮。测定总黄酮的含量为75％，其中槲皮素、山萘酚、(+)-二氢杨梅素、杨梅素、北枳椇醇、(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III及其衍生物等的含量和为67％。

实施例3：枳椇总黄酮的制备方法

取枳椇果柄去汁后的干燥果渣1Kg，粉碎，过100目筛，滤除纤维素等杂质，粉末干燥，8倍量(mL/g)的70％乙醇溶液(V/V)80℃热回流提取3次，每次2小时，合并滤液，真空浓缩除去乙醇，蒸馏水溶解，上AB-8型大孔树脂柱，缓慢上样，先用水洗脱流出近无色，再用3倍树脂床体积20％乙醇溶液(V/V)冲洗除杂，冲洗液弃去，用7倍树脂床体积的60％乙醇溶液(V/V)洗脱，收集洗脱液，浓缩至稠膏干燥得枳椇总黄酮。测定总黄酮的含量为73％，其中槲皮素、山萘酚、(+)-二氢杨梅素、杨梅素、北枳椇醇、(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III及其衍生物等的含量和为55％。

实施例4：枳椇总黄酮的制备方法

取枳椇叶1Kg粉碎至50目，按照1∶10(g/mL)料液比加入75％乙醇溶液(V/V)，70℃加热回流提取2h，提取3次，合并提取液，回收溶剂除去乙醇，加水分散溶解，使水溶液浓度为1∶5倍(生药量(g)：分散毫升数)，通过5L聚酰胺，吸附流速2.5BV/h，柱床茎高比为1∶8，上样量为200mg/mL(以生药量计)，用4倍柱床体积的水和3倍树脂床体积10％乙醇溶液(V/V)冲洗除杂，冲洗液弃去，用6倍树脂床体积的80％乙醇溶液(V/V)洗脱，收集洗脱液，浓缩至稠膏干燥得枳椇总黄酮。测定枳椇总黄酮含量为54％，其中槲皮素、山萘酚、(+)-二氢杨梅素、杨梅素、北枳椇醇、(+)-焦儿茶素、枳椇素I、枳椇素II和枳椇素III及其衍生物等的含量和为45％。

实施例5：枳椇总黄酮片的制备

枳椇总黄酮    10g

淀粉          10g

上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成100片。

实施例6：枳椇总黄酮复方制剂的制备

枳椇总黄酮    20g

升麻提取物    10g

葛根提取物    10g

川连提取物    15g

上述组分混合均匀，装入硬明胶胶囊中，共200粒胶囊。

Claims (1)

1.一种枳椇总黄酮的制备方法，其特征在于，取枳棋叶粉碎至50目，按照(1∶10)g/ml的料液比加入75％乙醇溶液，70℃加热回流提取2h，提取3次，合并提取液，回收溶剂除去乙醇，加水分散溶解，使分散后的水溶液体积以g/ml记为生药量的5倍，通过5L聚酰胺，吸附流速2.5BV/h，柱床茎高比为1∶8，以生药量计的上样量为200mg/mL，用4倍柱床体积的水和3倍树脂床体积10％乙醇溶液冲洗除杂，冲洗液弃去，用6倍树脂床体积的80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至稠膏干燥得枳棋总黄酮，上述乙醇溶液均为V/V浓度。