CN101830880B - 一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过树脂富集、硅胶柱层析，对落叶松加工剩余物粗提物中的紫杉叶素进行分离纯化的方法。以落叶松加工后剩余物的粗提物为原料，利用AB-8树脂对其中的活性成分紫杉叶素进行特异性富集，再将富集后的粗产品通过正相硅胶柱层析进行纯化，最后获得了纯度为94.35％的紫杉叶素，收率为72.46％。本发明对落叶松中重要活性成分紫杉叶素进行高效分离纯化，对森林剩余物高附加值加工利用提供了一种新方法，而且该方法操作简单易行，适于工业应用，对产业化生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过利用树脂富集，硅胶柱层析分离纯化落叶松加工剩余物粗提物中紫杉叶素的方法。
背景技术
紫杉叶素(Taxifolin)，又名花旗松素、黄杉素、二氢槲皮素、双氢槲皮素和蚊母树素。它是一种二氢黄酮醇类化合物，学名为5，7，3’，4’-四羟基二氢黄酮醇。其分子式为C15H12O7，分子量为304.25。紫杉叶素是一种无色针状结晶(50％乙醇)，白色或淡黄色粉末，易溶于乙醇、乙酸、沸水，微溶于冷水，不溶于苯。其熔点为240～242℃，旋光度+42°(c＝1.0，丙酮)。它的主要来源除了松科植物松[Pseudotsuga taxifolia Britt.(Douglas fir)]之外，还有金缕梅科植物蚊母树(Distylium racemosum Sieb.et Zucc.)、刺玫蔷薇及水红花子等。紫杉叶素已在俄罗斯通过相关部门的验证和鉴定并投入使用，是俄罗斯宇航员长期服用的保健品。
在植物中紫杉叶素以苷元或苷两种形式存在，如从Genista corsica中分离出的紫杉叶素苷元，从Ochnabeddomei中分离出tanxifolin-3-O-rhamnoside苷。在一些植物中，紫杉叶素母核羟基被甲基化，如：5-methoxytaxifolin。紫杉叶素最早由日本学者Fukui从针叶植物Chamaecyparisobtusa(Sieb.et Zucc.)Endl.叶中提取出来，为一种葡萄糖苷的苷元。随后他又研究了它的3-O-葡萄糖苷在针叶植物中的分布以及细菌存在下苷键的水解。以后又有人从多种植物中分离出花旗松素及其衍生物。
紫杉叶素能从人体中有效地消除过量的自由基，促进毛细血管的渗透性，改善免疫功能，减少癌症的形成，能防止心血管疾病，它有恢复毛细血管的弹性，阻止发炎和肿块的形成。同时它还是高效的天然食品抗氧化剂，紫杉叶素的抗氧化剂作用超过其它诸如槲皮素、芸香苷和合成抗氧化剂等。除此之外，它还具有保护肝脏，視力功能，以及抗糖尿病等一系列的功效。在长期口服用紫杉叶素的情况下，有利于保持身体免疫力系统的机能及抗毒素的作用。在俄罗斯2003年药典中介绍了紫杉叶素在人的循环系统治疗，受到照射，放射性核素后的治疗，延缓人体老化，糖尿病以及在预防和治疗肿瘤都有比较好的疗效作用。
在制药业，其可用于生产药剂，能够治疗缺血性心脏病、缺血性动脉粥样硬化、肝活动障碍、糖尿病等；在食品制造业方面，把紫杉叶素加入到植物油、动物脂肪、干奶粉、含脂肪的糖果点心食品中，可以延长其有效期2～3倍，并且在此情况下，可以使食品明显的表现出改善的性能；在工业方面，它可用于火箭原料和碳氢化合物原料的稳定剂、发电机油和工业油的稳定剂。
我国拥有丰富的兴安落叶松资源，因其木材在家具制造、建筑业和铁路建设等方面具有广泛的用途，所以每年都会产生大量木材加工后废弃的木屑，其中绝大部分都被视为垃圾扔掉。兴安落叶松中含有紫杉叶素、阿拉伯半乳聚糖及原花青素等成分，它们都具有良好的生物活性，其中紫杉叶素具有极好的自由基清除能力，将其加入到糖果点心食品中，可以延长有效期2～3倍，因此是一种纯天然的食品防腐剂。利用兴安落叶松加工后废弃的木屑提取分离紫杉叶素并将其开发成食品添加剂，不但可以充分合理地利用木材资源，还可以将其附加值充分的开发出来，使东北的资源优势转化为经济优势，从而带动地方经济的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用落叶松加工剩余物的粗提物为原料，通过树脂吸附对其中的紫杉叶素进行富集，再通过硅胶柱层析的方法对紫杉叶素进行纯化的工艺方法。本方法不仅可以获得高纯度的紫杉叶素产品，还可提高林业资源的利用率。
一种从落叶松加工剩余物的粗提物中提取纯化生物活性成分紫杉叶素的方法，其主要特征在于：将落叶松加工剩余物的粗提物加入到乙醇中，搅拌充分溶解，加入AB-8大孔树脂。将此溶液放置在40℃水浴锅上至乙醇挥发至干，吸附样品后的树脂，加入到填装好的AB-8树脂柱上，用不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，收集含有目标产物的馏分。后经过正相硅胶柱层析进一步纯化，得到纯度为94.35％以上的紫杉叶素。
本发明选取的落叶松加工剩余物的粗提物来源如下：主要来源包括在中国分布较广的兴安落叶松、华北落叶松、西伯利亚落叶松、红杉和大果红杉等植物加工利用后木屑的水或醇提取物浸膏。
本发明树脂富集落叶松加工利用剩余物的粗提物中紫杉叶素的方法按如下步骤进行：将落叶松加工剩余物的粗提物1g加入到3mL乙醇中，搅拌充分溶解，加入3g AB-8大孔树脂。将此溶液放置在40℃水浴锅上至乙醇挥发至干，吸附样品后的树脂，加入到填装好的AB-8树脂柱上，依次用5BV10％乙醇溶液、25BV 20％乙醇溶液进行洗脱，收集含有目标产物的馏分。经过大孔树脂柱层析富集后，紫杉叶素纯度由1.54％提高到43.31％，收率为90.02％。
本发明硅胶柱层析纯化树脂富集后的紫杉叶素的方法按如下步骤进行：将经过大孔树脂富集得到的乙醇洗脱部分作为正相柱层析样品。取1g样品，用少量甲醇溶解，加适量硅胶，在加热状态下将其拌成干粉状，然后缓慢的加入层析柱中，使拌好的样品粉末在硅胶柱表面形成均匀的薄层。上样后的硅胶柱使用三氯甲烷溶剂平衡，平衡后开始洗脱。洗脱步骤为：氯仿100％；氯仿∶甲醇30∶1；氯仿∶甲醇25∶1；氯仿∶甲醇20∶1。静置3～4天后，氯仿∶甲醇＝20∶1洗脱部分中紫杉叶素析出晶体。过滤得到晶体，自然风干。晶体中紫杉叶素的纯度为94.35％，收率为72.46％。
本发明的优点：
1.本发明以落叶松加工剩余物的粗提物为原料，获得活性成分紫杉叶素，在森林资源高附加值加工方面具有较高的应用价值。
2.本发明所采用的AB-8树脂富集方法，对粗提取物中的紫杉叶素具有特异性吸附，可以高效地提高富集后馏分中该物质的含量，同时，醇-水体系取代了传统有机溶剂，环保性突出。
3.本发明所采用的正相硅胶柱层析方法，可以得到高纯度的紫杉叶素产品。
4.该方法简单易行，可实现大规模的产业化生产。
具体实施方案
本试验选用的原料是落叶松加工利用后废弃木屑的粗提物浸膏，试验时间为4月，具体实施例如下：
实施例
称取10g AB-8型大孔吸附树脂(含水率为70％)装柱备用，柱体积为14mL。准确称取1g兴安落叶松加工剩余物提取样品，加入3mL无水乙醇溶解。将称好的3g AB-8树脂加入到样品溶液中进行吸附，待溶剂挥干后上样。洗脱步骤为：水洗至无色，10％乙醇溶液5BV，20％乙醇溶液25BV。洗脱完毕后，收集含有紫杉叶素的馏分，浓缩后进行硅胶柱层析。
将经过大孔树脂富集得到的乙醇洗脱部分作为正相柱层析样品。取1g样品，用少量甲醇溶解，加适量硅胶，在加热状态下将其拌成干粉状，然后缓慢的加入层析柱中，使拌好的样品粉末在硅胶柱表面形成均匀的薄层。上样后的硅胶柱使用三氯甲烷溶剂平衡，平衡后开始洗脱。洗脱步骤为：氯仿100％；氯仿∶甲醇30∶1；氯仿∶甲醇25∶1；氯仿∶甲醇20∶1。静置3～4天后，氯仿∶甲醇＝20∶1洗脱部分中紫杉叶素析出晶体。过滤得到晶体，自然风干，通过HPLC检测纯度。
在实施例中，粗提物浸膏中紫杉叶素的纯度为1.54％，经过大孔树脂柱层析富集纯化后，紫杉叶素纯度提高到43.31％，经过硅胶柱层析后，紫杉叶素纯度为94.35％。
本试验中所用到的标准品购自上海融禾生物技术有限公司。
结果定量检测分析采用下表条件：
| 仪器 | Jasco PU-980高效液相色谱仪 |
| 色谱柱 | ODS C(18)色谱柱5μ(250mm×4.6mm I.D.) |
| 柱温 | 30℃ |
| 流动相 | 流动相：甲醇/1‰醋酸(44/56，v/v) |
| 流速 | 1mL/min |
| 进样体积 | 10μL |
| 检测器 | UV-975紫外吸收检测器 |
| 检测波长 | 290nm |
附图说明
图1为紫杉叶素的结构式
图2为经过富集纯化后的产品的液相色谱图
Claims (7)
1.一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，该方法通过以下步骤实现：
(1)将落叶松加工剩余物的粗提物加入到乙醇中，搅拌充分溶解后，加入AB-8树脂，加热至乙醇挥干；
(2)AB-8树脂柱层析的制备：将AB-8树脂填充至玻璃柱中，用2BV体积分数95％乙醇，数次洗脱，以2BV/h流速通过树脂层，其中BV为树脂床体积，洗至流出液加水不呈白色混浊为止，然后用蒸馏水以同样的流速冲洗，至流出液不含乙醇，树脂备用；
(3)将步骤(1)中吸附样品的树脂，加入到树脂柱中，加入乙醇溶液进行梯度洗脱，收集含有紫杉叶素的馏分，浓缩至干；
(4)硅胶柱层析：将树脂富集后的样品，加入到正相硅胶柱层析中，柱层析用上样溶剂平衡后，用洗脱剂洗脱，将洗脱液静置3～4天后，紫杉叶素析出晶体，过滤得到晶体，自然风干。
2.按照权利要求1所述的一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，其特征在于步骤(1)所述的落叶松加工剩余物，来源包括在中国分布较广的兴安落叶松、华北落叶松、西伯利亚落叶松、红杉和大果红杉。
3.按照权利要求1所述的一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，其特征在于步骤(1)中所述的加入AB-8树脂，目的是将乙醇溶液中的样品吸附到树脂上。
4.按照权利要求1所述的一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，其特征在于步骤(2)中所述的AB-8树脂柱层析的制备，是将AB-8树脂填充到玻璃柱中，使之形成以树脂为填料的层析柱。
5.按照权利要求1所述的一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，其特征在于步骤(3)所述的乙醇溶液梯度洗脱，具体包括用5BV体积分数为10％的乙醇溶液和25BV体积分数为20％的乙醇溶液依次进行洗脱。
6.按照权利要求1所述的一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，其特征在于步骤(4)所述的洗脱剂洗脱步骤为：三氯甲烷；体积比为30/1的三氯甲烷/甲醇；体积比为25/1的三氯甲烷∶甲醇；体积比为20/1的三氯甲烷/甲醇。
7.按照权利要求6所述的一种从落叶松加工剩余物粗提物中分离纯化紫杉叶素的方法，其特征在于步骤(4)所述的洗脱液静置，为体积比为20/1的三氯甲烷/甲醇洗脱部分。
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