CN113388047A - 一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法。本发明全程采用低温操作，运用醇提及水提联合提取的方式进行提取。在以往实验研究的基础上，采用大孔吸附树脂柱层析来分离和纯化阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素。并利用醇析法来沉淀多糖，而后利用柱层析与紫外可见分光光度计联机的方法来对纯化后的物质进行杂质含量检测，再用苯酚‑硫酸比色法对纯化后的多糖进行纯度测定，确定其有效成分的含量。充分利用现代化分析仪器来检测、定量分析阿拉伯半乳聚糖，进而得到了高纯度的阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法。本发明属于天然产物分离与纯化技术领域。
背景技术
落叶松属于我国的主要造林树种之一，针对现如今的林木采伐与加工后对剩余物中含有的多种生物活性成分的提取及利用的现状，我们可进行落叶松木材的废弃物回收再利用。优化提取工艺，开发木材中活性物质有效利用的相应技术，是利用落叶松植物资源、改进林区产业结构、达到废弃木屑再度利用、降低生产成本等目的的重要措施。
落叶松的木质部内大量存在着阿拉伯半乳聚糖，其含量可达5～30％，它是一种由阿拉伯糖与半乳糖组成的中性多糖(Grabner-M，2005)。在食品行业中常作甜味剂、乳化剂、稳定剂、増稠剂等食品添加剂，原中华人民共和国卫生与计划委员会2014年20号公告阿拉伯半乳聚糖为新食品原料。具有增强免疫、抑制肿瘤、定向运送、改善肠道菌群等生理功能，是一种极其重要的废弃落叶松木屑利用资源，国际上也相继出现了以阿拉伯半乳聚糖为主要成分制成的药物，然而国内对阿拉伯半乳聚糖药用功能的相关研究较少。本项目针对加工后剩余落叶松木屑中还含有未被有效利用的成分，以及蓄积量大等问题，再加上食品行业的发展对生物产品的需求不断増加的现状，以落叶松木屑为原料，进行落叶松中阿拉伯半乳聚糖的提取工艺的研究。
落叶松中二氢槲皮素的含量约在0.3～5.7％左右。二氢槲皮素是自然界中存在的一种重要的二氢黄酮醇类化合物，亦称维生素P，具有多种重要的生物学活性的林源活性物质。二氢槲皮素最早由日本学者Fukui从针叶植物Chamaecyparis obtusa(Sieb.et-Zucc.)Endl.叶中提取出来，纯品为淡黄色粉末，具有超强的抗氧化能力，在维持人体循环系统功能方面起着特殊的作用，它因具有抑制癌细胞、降低血脂、保护心脑血管，肝脏，视力功能，以及抗氧化、延缓衰老、消除炎症和抗糖尿病等一系列的功效而备受关注。既可作为食品抗氧化剂和饲料添加剂，又可作为营养品，在制药工业往往用槲皮素代替二氢槲皮素，其效果有明显差别，所以二氢槲皮素的国际和国内的市场需求量逐年增长。
阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的提取以往是采用传统水浴浸提法，传统的水浴浸提法是针对不同的时间、水浴温度、料液比、原料目数等条件，进而确定出较适合的提取条件。但是，传统水浴浸提法存在着提取时间长，消耗能量多的缺点。在植物药的现代研究中，快速提取并提高有效成分的提取率是我国植物药研究的重要前言课题。
随着对植物药研究的不断深入，科研工作者对植物药的提取手段也在不断研究改进，不断寻求提取新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：
(1)将落叶松根或根木粉碎至10-20目；
(2)向粉碎后的落叶松根或根木粉中加入乙醇，进行回流提取1次，过滤，将提取得到的醇提液浓缩至原体积1/10-1/15，得醇提液浓缩液；剩下的落叶松根或根木粉渣用水煎煮1次，过滤，得到水提液；将醇提液浓缩液、水提取液混合，得到总提取液；
(3)将步骤(2)得到的总提取液上样大孔树脂柱吸附，用纯净水冲洗，收集流过液，流过液经过浓缩、醇沉、离心后得到沉淀物，沉淀物经真空干燥得到阿拉伯半乳聚糖粉；
(4)对步骤(3)上样后的大孔树脂柱用30％w/w乙醇清洗除杂，然后使用1-2倍柱体积的70％w/w乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；
(5)将步骤(4)收集的醇洗脱液真空减压浓缩10-15倍后，离心，上清液于0-5℃放置过夜，有结晶析出，离心得到沉淀，即为二氢槲皮素结晶物；
(6)将步骤(5)得到的二氢槲皮素结晶物与纯净水混合搅拌，溶解后，离心，上清液在0-5℃条件下静置进行重结晶，离心得到沉淀，真空干燥后即为二氢槲皮素提取物，纯度95％以上。
其中，优选的，步骤(2)中向粉碎后的落叶松根或根木粉中加入其重量8-12倍的20-40％w/w乙醇，进行回流提取1次，过滤，将提取得到的醇提液浓缩至原体积1/10-1/15，得醇提液浓缩液；剩下的落叶松根或根木粉渣用其重量5-8倍的水煎煮1次，过滤，得到水提液，将醇提液浓缩液、水提液混合，得到总提取液。
其中，优选的，步骤(2)中乙醇回流提取的时间为1-2h，提取温度为30-50℃，提取液旋转蒸发至提取液体积是原提取液体积的1/10-1/15；水提取的时间为1-2h，温度为30-50℃。
其中，优选的，步骤(3)中大孔树脂柱中的填充材料选自AB-8、D-101或HPD100型大孔树脂中的一种。
其中，优选的，步骤(3)中将4L的大孔树脂填充入柱子中，控制上样液含有二氢槲皮素的浓度范围为0.5-0.7mg/mL，上样的流速范围20-40ml/min，上样时间1-2h。
其中，优选的，步骤(4)中洗脱步骤中流速为25-50mL/min，分别用4-6L的纯净水、30％w/w乙醇洗脱后，再用1-2倍柱体积的70％w/w的乙醇洗脱，得到含有二氢槲皮素的洗脱液。
其中，优选的，步骤(6)中结晶物与纯净水重量比为1:3-5。
其中，优选的，步骤(6)中的二氢槲皮素提取物经过二次重结晶后二氢槲皮素的纯度达到95％以上。
本发明全程采用低温操作，运用水提及醇提相结合的方式进行提取。多糖的分离纯化过程是制备药用级阿拉伯半乳聚糖的关键技术。本发明本着寻求实用、简便、可再生的纯化手段，在以往实验研究的基础上，采用大孔吸附树脂柱层析来分离和纯化阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素。并利用醇析法来沉淀多糖，而后利用柱层析与紫外可见分光光度计联机的方法来对纯化后的物质进行杂质含量检测，再用苯酚-硫酸比色法对纯化后的多糖进行纯度测定，确定其有效成分的含量。充分利用现代化分析仪器来检测、定性分析阿拉伯半乳聚糖，进而得到高纯度的阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素产品。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、与同类产品的竞争优势
随着经济的发展，人类对环境和健康的意识逐渐增强，疾病谱和医疗模式均发生了很大的变化。为解决合成药物毒副作用大这一难题，研究和开发副作用小、药效显著的天然植物药和中药已国内外医药领域研究的焦点。长期以来国内外医药领域的研究学者和商家一直非常重视天然植物药物的开发和应用。美国、德国、中国和日本利用植物提取药剂来治疗疾病己有较长的历史了，美国、德国和日本的植物药产品在国际市场上的覆盖率已达到80％以上，对于拥有大量植物药资源和约4000种中药制剂的我国，植物药产品在国际市场上的覆盖率仅为3～5％。由此可见，大力发展我国的植物药产业是十分必要的。对于二十一世纪来说，世界许多发达国家都已进入老龄化时代，作用缓和、副作用小、适应多样性的植物药和中药将是对慢性病、疑难病、特别是多脏器疾病的老年患者最理想的药物。
2、国外近几年研究报道，阿拉伯半乳聚糖及二氢槲皮素具有提高机体免疫力，增强免疫抗原中单核细胞、巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞的免疫反应活性，产生非特异性的细胞杀伤作用，并能诱导体内产生内源性干扰素、LAK和肿瘤坏死因子等。阿拉伯半乳聚糖既是保健食品功能因子又是一类非常重要的药用原料，因此，药食兼用的天然植物资源-阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的市场需求量将是非常大的。目前，此类植物药的数量和种类已商业化的很少，有待于开发和利用，有着极为广阔的发展和应用前景。
3、就可利用资源来说，落叶松是我国东北林区的主要造林树种，木材蓄积量丰富。落叶松木材加工剩余物作为森林资源的一部分，在林区加工厂的残留量很大，一直没有得到合理利用，残留锯屑不仅污染了环境，而且浪费林业资源。若对其开发研制的好，必然能够缓解对优质材的消耗，提高森林资源利用率，降低森林采伐的程度，增加国民生产总值，改善人民的生活水平，减少环境污染，从而实现资源的可持续利用。随着世界对环保问题的重视，人们对绿色、少毒、副作用小的天然植物药越来越青睐，如果我们能够从木材废弃物中提取出植物药原料，并使它得到充分的利用，制造出一系列药品、保健品、食品添加剂等，不仅会给生产者带来很高的经济效益，而且也会带来一定的社会效益。同时，也可以创造出高性能产品的替代产品，发挥木材加工剩余物的作用。
4、近年来人们的环保意识和经济意识不断增强，落叶松木材加工剩余物的合理利用也被逐步提到日程上来，成为反应强烈和急于解决的问题，具有广泛的应用前景。基于国内外研究学者开发研究的基础上，一方面充分利用废弃资源创造高价值产品来满足国内外市场的需求；另一方面倡导开发天然植物药物的发展趋势，紧跟国际科学研究潮流，从落叶松木材加工剩余物的锯屑中利用快速、便捷的微波装置和超声波装置，采用无污染、无毒害、可回收溶剂来提取阿拉伯半乳聚糖和二氢槲皮素，并运用先进生物分离技术对阿拉伯半乳聚糖分离和二氢槲皮素进行纯化，从而得到药物级、食品级、化妆品原料，创造高产值利润。这样不仅高效合理地利用了废弃的林业资源，减少环境污染，又缓解了林区经济危机，带动了林区乃至整个国民经济的发展，而且还能将我国林产品推向世界，并在国际市场中占有一席之地。
附图说明
图1为本发明方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：
(1)将落叶松根粉碎至10目；
(2)取400g落叶松根粉，加入30％w/w乙醇4000g，38℃回流提取1次，时间为1.5h，过滤，得醇提液3200g，50℃真空浓缩，得320g醇提液浓缩液；剩下的落叶松根粉渣加入2400g生活饮用水，38℃回流提取1次，时间为1.5h，过滤，得2380g水提液；将醇提浓缩液、水提浓缩液混合，得2700g总提取液；
(3)AB-8大孔树脂4L填充入层析脂柱中，用6L纯净水漂洗层析柱；将步骤(2)得到的2700g总提取液上柱吸附，上样液含二氢槲皮素的浓度范围为0.5-0.7mg/mL，上样的流速范围30mL/min，总提取液上完柱后，用4L纯净水冲洗，收集5800g流过液，50℃真空浓缩，得150g流过液浓缩液；室温不断搅拌下加入95％w/w乙醇420g至乙醇终浓度为70％w/w，室温过夜醇沉，4000rpm离心30min，沉淀物60℃真空干燥得阿拉伯半乳聚糖粉52g，经检测阿拉伯半乳聚糖含量86.2％；
(4)纯净水冲洗后的大孔树脂柱再用6L30％w/w乙醇冲洗除杂，然后再用6L 70％w/w乙醇洗脱树脂柱，收集70％w/w乙醇洗脱液2800g，洗脱步骤中流速为40mL/min；
(5)2800g 70％w/w乙醇洗脱液50℃真空浓缩，得100g浓缩液，降至室温，4000rpm离心20min除去松脂，上清液5℃度冰箱放置过夜，4000rpm离心30min，沉淀物50℃真空干燥得二氢槲皮素结晶物粉1.5g，经检测二氢槲皮素结晶物粉含量86.5％；
(6)将步骤(5)得到的1.5g粗结晶物粉加入6g纯净水加热至50℃溶解，降至室温，4000rpm离心20min除去松脂，上清液5℃度冰箱放置过夜，4000rpm离心30min，沉淀物50℃真空干燥得二氢槲皮素结晶物粉1.2g，经检测二氢槲皮素结晶物粉含量96％。
实施例2
一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：
(1)将落叶松根粉碎至10目；
(2)取400g落叶松根粉，加入30％w/w乙醇4000g，38℃回流提取1次，时间为1.5h，过滤，得醇提液3180g，50℃真空浓缩，得315g醇提液浓缩液；剩下的落叶松根粉渣加入2400g生活饮用水，38℃回流提取1次，时间为1.5h，过滤，得2375g水提液；将醇提浓缩液、水提浓缩液混合，得2690g总提取液；
(3)D-101型大孔树脂4L填充入层析脂柱中，用6L纯净水漂洗层析柱；将步骤(2)得到的2690g总提取液上柱吸附，上样液含二氢槲皮素的浓度范围为0.5-0.7mg/mL，上样的流速范围30mL/min，总提取液上完柱后，用4L纯净水冲洗，收集5600g流过液，50℃真空浓缩，得145g流过液浓缩液；室温，不断搅拌下加入95％w/w乙醇406g至乙醇终浓度为70％，室温过夜醇沉，4000rpm离心30min，沉淀物60℃真空干燥得阿拉伯半乳聚糖粉55g，经检测阿拉伯半乳聚糖含量85.5％；
(4)纯净水冲洗后的大孔树脂柱再用6L 30％w/w乙醇冲洗除杂，然后再用6L 70％w/w乙醇洗脱树脂柱，收集70％w/w乙醇洗脱液2720g，洗脱步骤中流速为40mL/min；
(5)2720g 70％w/w乙醇洗脱液50℃真空浓缩，得95g浓缩液，降至室温，4000rpm离心20min除去松脂，上清液5℃度冰箱放置过夜，4000rpm离心30min，沉淀物50℃真空干燥得二氢槲皮素结晶物粉1.65g，经检测二氢槲皮素结晶物粉含量85.8％；
(6)将步骤(5)得到的1.65g粗结晶物粉加入6.4g纯净水加热至50℃溶解，降至室温，4000rpm离心20min除去松脂，上清液5℃度冰箱放置过夜，4000rpm离心30min，沉淀物50℃真空干燥得二氢槲皮素结晶物粉1.25g，经检测二氢槲皮素结晶物粉含量95.2％。
实施例3
一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：
(1)将落叶松根粉碎至10目；
(2)取400g落叶松根粉，加入30％w/w乙醇4000g，38℃回流提取1次，时间为1.5h，过滤，得醇提液3220g，50℃真空浓缩，得305g醇提液浓缩液；剩下的落叶松根粉渣加入2400g生活饮用水，38℃回流提取1次，时间为1.5h，过滤，得2365g水提液；将醇提浓缩液、水提浓缩液混合，得2670g总提取液；
(3)HPD100型大孔树脂4L填充入层析脂柱中，用6L纯净水漂洗层析柱；将步骤(2)得到的2670g总提取液上柱吸附，上样液含二氢槲皮素的浓度范围为0.5-0.7mg/mL，上样的流速范围30mL/min，总提取液上完柱后，用4L纯净水冲洗，收集5650g流过液，50℃真空浓缩，得152g流过液浓缩液；室温，不断搅拌下加入95％w/w乙醇425g至乙醇终浓度为70％w/w，室温过夜醇沉，4000rpm离心30min，沉淀物60℃真空干燥得阿拉伯半乳聚糖粉58g，经检测阿拉伯半乳聚糖含量85.0％；
(4)纯净水冲洗后的大孔树脂柱再用6L 30％w/w乙醇冲洗除杂，然后再用6L 70％w/w乙醇洗脱树脂柱，收集70％w/w乙醇洗脱液2780g，洗脱步骤中流速为40mL/min；
(5)2780g 70％w/w乙醇洗脱液50℃真空浓缩，得90g浓缩液，降至室温，4000rpm离心20min除去松脂，上清液5℃度冰箱放置过夜，4000rpm离心30min，沉淀物50℃真空干燥得二氢槲皮素结晶物粉1.55g，经检测二氢槲皮素结晶物粉含量85.2％；
(6)将步骤(5)得到的1.55g粗结晶物粉加入6.2g纯净水加热至50℃溶解，降至室温，4000rpm离心20min除去松脂，上清液5℃度冰箱放置过夜，4000rpm离心30min，沉淀物50℃真空干燥得二氢槲皮素结晶物粉1.23g，经检测二氢槲皮素结晶物粉含量95.4％。
Claims (8)
1.一种从落叶松中同时提取阿拉伯半乳聚糖以及二氢槲皮素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将落叶松根或根木粉碎至10-20目；
(2)向粉碎后的落叶松根或根木粉中加入乙醇，进行回流提取1次，过滤，将提取得到的醇提液浓缩至原体积1/10-1/15，得醇提液浓缩液；剩下的落叶松根或根木粉渣用水煎煮1次，过滤，得到水提液；将醇提液浓缩液、水提取液混合，得到总提取液；
(3)将步骤(2)得到的总提取液上样大孔树脂柱吸附，用纯净水冲洗，收集流过液，流过液经过浓缩、醇沉、离心后得到沉淀物，沉淀物经真空干燥得到阿拉伯半乳聚糖粉；
(4)对步骤(3)上样后的大孔树脂柱用30％w/w乙醇清洗除杂，然后使用1-2倍柱体积的70％w/w乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；
(5)将步骤(4)收集的醇洗脱液真空减压浓缩10-15倍后，离心，上清液于0-5℃放置过夜，有结晶析出，离心得到沉淀，即为二氢槲皮素结晶物；
(6)将步骤(5)得到的二氢槲皮素结晶物与纯净水混合搅拌，溶解后，离心，上清液在0-5℃条件下静置进行重结晶，离心得到沉淀，真空干燥后即为二氢槲皮素提取物，纯度95％以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中向粉碎后的落叶松根或根木粉中加入其重量8-12倍的20-40％w/w乙醇，进行回流提取1次，过滤，将提取得到的醇提液浓缩至原体积1/10-1/15，得醇提液浓缩液；剩下的落叶松根或根木粉渣用其重量5-8倍的水煎煮1次，过滤，得到水提液，将醇提液浓缩液、水提液混合，得到总提取液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中乙醇回流提取的时间为1-2h，提取温度为30-50℃，提取液旋转蒸发至提取液体积是原提取液体积的1/10-1/15；水提取的时间为1-2h，温度为30-50℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中大孔树脂柱中的填充材料选自AB-8、D-101或HPD100型大孔树脂中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将4L的大孔树脂填充入柱子中，控制上样液含有二氢槲皮素的浓度范围为0.5-0.7mg/mL，上样的流速范围20-40ml/min，上样时间1-2h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中洗脱步骤中流速为25-50mL/min，分别用4-6L的纯净水、30％w/w乙醇洗脱后，再用1-2倍柱体积的70％w/w的乙醇洗脱，得到含有二氢槲皮素的洗脱液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中结晶物与纯净水重量比为1:3-5。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中的二氢槲皮素提取物经过二次重结晶后二氢槲皮素的纯度达到95％以上。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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