CN111840349B - 一种从艾叶中同时提取多糖和黄酮类成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从艾叶中同时提取多糖和黄酮类成分的方法,包括以下步骤:1)将艾叶粉加入离子液体双水相并进行超高压提取,离心收集提取液;2)将收集到的提取液静置分相,上相液过DEAE纤维素柱得到艾叶多糖溶液,下相液加入乙酸乙酯萃取并回收离子液体,然后过大孔树脂柱后得艾叶黄酮溶液;3)分别浓缩、干燥得到艾叶多糖和艾叶黄酮。本发明大幅降低了艾叶多糖和黄酮的生产成本和周期,具有提取效率高,产物纯度高,操作简单,能耗低、环境友好等优点,所得产物具有很好的降血脂活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种从艾叶中同时提取多糖和黄酮类成分的方法,属于天然药物领域。
背景技术
艾叶是一种菊科艾属多年生草本植物,在我国,艾叶种类繁多、分布广泛、且有悠久的药用和食用历史。其叶、茎、籽均可入药,其中叶具有散寒止痛、温经止血、祛湿止痒功效,我国民间还有饮艾酒、食用艾饼的习惯,是人们喜爱的一种天然野生蔬菜。现代研究发现,艾叶的化学成分主要包含蛋白质、各种矿物质、脂肪、黄酮、多糖和挥发油等,其中研究最多的是挥发油,而针对黄酮和多糖类化合物的研究相对较少。艾叶黄酮和艾叶多糖具有丰富的生物活性,如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等,艾叶生物活性的研究发展需要依靠提取、分离、纯化等技术的支撑,因此如何高效获得高质量的天然产物,对艾叶研究具有重大意义。
目前艾叶黄酮和艾叶多糖的提取方法主要有常规溶剂提取法、微波或超声波辅助提取法、酶解法、超临界萃取法等,如CN 109929047公开了一种采用超声波辅助水提艾叶多糖的方法,但所需提取时间长(10-30min)、提取温度高(60-80℃),容易导致提取物的活性下降;CN 109363969公开了一种艾草有效成分的综合利用方法,采用超临界CO2辅助提取艾叶黄酮和艾叶多糖,但超临界设备成本高,而且非极性的CO2多适用于提取脂溶性物质,对于极性的艾叶黄酮和多糖提取效率很低。
超高压能在常温下使细胞结构发生变化,细胞内的有效成分能与提取溶剂在短时间内充分接触,达到快速、高效地提取目的。由于超高压能够对非共价键(氢键、离子键、疏水键)产生影响,而共价键不受影响,因此高压能使蛋白质变性、酶失活、微生物死亡等,而不破坏原料中小分子有效成分的生理活性,达到纯化、灭菌的目的,因此在制药和食品领域得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从艾叶中同时提取多糖和黄酮类成分的方法,以克服现有方法工艺复杂、成本高、效率低等问题。
上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种从艾叶中同时提取多糖和黄酮类成分的方法,包括以下步骤:
1)将艾叶粉按1:10-30的料液比加入离子液体双水相并在100-500MPa的压力下进行超高压提取,离心收集提取液;
2)将收集到的提取液静置分相,上相液过DEAE纤维素柱,依次用水和NaCl溶液洗脱,收集含有艾叶多糖的洗脱液,下相液加入乙酸乙酯萃取并回收离子液体,然后过大孔树脂柱,用60-90%乙醇洗脱,收集含有艾叶黄酮的洗脱液;
3)将洗脱液分别浓缩、干燥,得到艾叶多糖和艾叶黄酮。
优选地,所述离子液体双水相中含有0.2-0.5g/mL的离子液体和0.05-0.15g/mL的盐。
优选地,所述离子液体双水相中含有0.3g/mL的离子液体和0.09g/mL的盐。
所述离子液体包括但不限于[C8MIM]PF6、[C4MIM]Cl、[C6MIM]Br、[BMIM]Cl、[C2MIM]BF4等,所述盐包括但不限于氯化钠、硫酸钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钠、硝酸镁等,本发明优选的离子液体为溴化1-己基-3-甲基咪唑([C6MIM]Br),该离子液体的极性和溶解性更有利于提取艾叶黄酮和多糖,本发明优选的盐为K2HPO4。
优选地,所述压力为200-300Mpa。
优选地,所述超高压提取的保压时间是1-10min。
所述大孔树脂柱包括但不限于D101、AB-8、H103、ADS-7、NKA-9、HP-20、S-8、X-5等型号,本发明优选为AB-8型大孔树脂柱,该大孔树脂柱对艾叶黄酮具有更优异的纯化能力。
优选地,所述乙醇为80%乙醇。
本发明还提供了一种降血脂药物,其活性成分是艾叶多糖和艾叶黄酮,所述艾叶多糖和艾叶黄酮是按以上所述方法提取的。
根据本发明的一个实施例,当用于降血脂药物时,所述艾叶多糖与艾叶黄酮的质量比为1:2。
本发明中所涉及的料液比指的是重量体积比,单位是g:mL。本发明中所涉及乙醇浓度均指体积浓度,如80%乙醇指的是每100ml乙醇水溶液中含有乙醇80ml。
本发明的有益效果是:
1)使用离子液体双水相进行提取,试验证明,与乙酸乙酯、蒸馏水等常规提取溶剂相比具有较高的艾叶多糖和黄酮提取率,更加特别的是,当使用离子液体双水相时,能够将提取液通过简单的分相操作实现艾叶多糖和黄酮的分离,而普通的提取溶剂通常要经过复杂的萃取、层析等步骤才能实现多种物质的分离,因此本发明还大幅降低了生产的成本和周期。
2)本发明在常温下使用超高压对活性成分进行提取,与常规的煎煮、回流、微波或超声波辅助提取、酶解法相比,具有温度低、时间短等优点,提取时间不超过10min,因此不会对温度敏感的活性成分造成破坏,与超临界萃取、渗漏等低温提取方式相比,本发明不依赖于昂贵的设备,而且具有周期短的优点。本发明通过对超高压提取中提取溶剂的种类和浓度、料液比、提取压力和时间等进行大量优化,进一步提高了艾叶多糖和黄酮的提取率。
3)提取产物中杂质含量低、生理活性成分纯度高、分子量小、生物利用率高,试验表明具有很好的降血脂作用,可制作成粉剂、片剂、胶囊、口服液等食品、保健品或药品。
4)本发明还具有操作简单、设备安全、能耗低、环境友好等优点。
附图说明
图1:不同溶剂对提取率的影响。
图2:不同料液比对提取率的影响。
图3:不同浸泡时间对提取率的影响。
图4:各组动物总甘油三酯含量变化。
图5:各组动物总胆固醇含量变化。
图6:各组动物高密度脂蛋白含量变化。
图7:各组动物低密度脂蛋白含量变化。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1提取工艺预试验
步骤1.于每年6月1日~6月15日采摘新鲜艾叶的叶,洗净后在40-50℃下干燥,烘干后粉碎过40-60目筛得到艾叶粉末。
步骤2.称取10g艾叶粉末于聚乙烯塑料袋中,按一定的料液比加入不同溶剂密封,室温下浸泡一段时间后,放入超高压提取设备,在100~500MPa的压力下保持一定时间,然后卸压。分别采用苯酚硫酸法和紫外分光光度计法检测提取液中艾叶多糖和艾叶黄酮含量。
采用单因素法考察提取溶剂、料液比和浸泡时间对艾叶多糖和艾叶黄酮提取率的影响。
①提取溶剂对提取率的影响
分别用[C6mim]Br/K2HPO4离子液体双水相、80%乙酸乙酯、蒸馏水为提取溶剂按料液比1:20(g:mL),室温浸泡12h后,在200MPa的压力下提取2min。试验结果如图1所示,从提取率(提取率=多糖质量或黄酮质量/艾叶干粉质量×100%)结果来看,无论是艾叶多糖还是艾叶黄酮,[C6mim]Br/K2HPO4离子液体双水相和蒸馏水的提取效果都优于乙酸乙酯,尤其是采用离子液体提取艾叶黄酮的提取率最高,可能与其阴、阳离子结构有关。因此优先选择[C6mim]Br/K2HPO4离子液体双水相。
②料液比对提取率的影响
以蒸馏水为提取溶剂,料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40和1:50(g:mL),室温浸泡12h后,在200MPa的压力下提取2min。试验结果如图2所示,在1:10~1:40之间随着料液比的增加,两种物质的提取率均缓慢增加,当料液比为1:40时艾叶多糖的提取率最高,1:20时艾叶黄酮的提取率最高;而料液比超过1:40后两种物质的提取率反而降低。考虑到实际生产中,较大的料液比会消耗更多能源,而提取率又没有明显增加,因此建议料液比选1:20左右。
③浸泡时间对提取率的影响
以蒸馏水为提取溶剂,料液比为1:20(g:mL),室温分别浸泡0、4、8、12、16h后,在200MPa的压力下提取2min。试验结果如图3所示,可以看出浸泡时间对提取率的影响不大,差异不超过±0.5,随着浸泡时间的增加,提取率趋于平稳,说明超高压处理之前不需要浸泡。
实施例2提取工艺正交试验
在预试验的基础上,进一步通过正交试验摸索最佳的超高压提取条件。
一种艾叶提取物的制备工艺,具体步骤为:
步骤1.于每年6月1日~6月15日采摘新鲜艾叶的叶,洗净后在40℃下干燥,烘干后粉碎过40目筛得到艾叶粉末。
步骤2.称取一定量的艾叶粉末于聚乙烯塑料袋中,按料液比1:20(g:mL)加入[C6mim]Br/K2HPO4离子液体双水相并密封,放入超高压生物提取设备,在一定的压力下保持一段时间,然后迅速卸压。
为进一步考察超高压提取艾叶多糖和艾叶黄酮的最佳工艺参数,对离子液体浓度、K2HPO4浓度、提取压力和提取时间进行L9(34)正交试验。因素水平表见表1,正交试验设计及结果见表2。
表1因素水平表
表2正交试验设计及结果
由表2可知,对于艾叶多糖来说,各因素的影响顺序为A>D>C>B,即离子液体浓度对艾叶多糖的提取率影响最大,其次是保压时间,然后是提取压力,最后是K2HPO4浓度,得到最优化组合为试验5号,即离子液体浓度为0.3g/mL,K2HPO4浓度为0.09g/mL,在250MPa的压力下保持2min,艾叶多糖提取率为9.17%。
艾叶黄酮含量分析,通过比较极差发现各因素的影响顺序为A>C>B>D,同样离子液体浓度对艾叶黄酮的提取率影响最大,其次是提取压力,然后是K2HPO4浓度,最后是保压时间,得到最优化组合为试验1号,即离子液体浓度为0.25g/mL,K2HPO4浓度为0.08g/mL,在150MPa的压力下保持2min,提取1次,艾叶黄酮提取率为12.01%。
由于在1号试验条件下艾叶多糖的提取率最低,因此选择5号试验条件作为最终的提取工艺参数。
实施例3提取物的纯化
步骤3.卸压后将提取液离心10min(4000r/min),滤液置于分液漏斗中静置20min分相,上相液浓缩至100mL后过DEAE-纤维素-52柱(每次上样30mL浓缩液,吸附半小时后用5倍柱体积蒸馏水洗柱,再用5倍柱体积0.5mol/L NaCl溶液洗脱,流速2mL/min,用苯酚硫酸法检测洗脱液,检测呈黄色时开始收集洗脱液,将收集到的洗脱液合并浓缩,然后透析脱盐)得到艾叶多糖溶液;下相液加入等体积乙酸乙酯萃取回收离子液体,浓缩至100mL后过AB-8大孔树脂柱(每次上样50mL浓缩液,静态吸附12h后以1mL/min的流速用80%乙醇洗脱,洗脱液进入紫外分光光度检测器中,自动收集器采用多管收集法收集洗脱液)后得艾叶黄酮溶液。
步骤4.将艾叶多糖溶液和艾叶黄酮溶液分别浓缩至原体积1/4,然后冷冻干燥得到艾叶多糖粉末(纯度为96.0%)和艾叶黄酮粉末(纯度为97.3%)。
将AB-8型大孔树脂柱替换为D101、X-5,得到的艾叶黄酮粉末纯度分别为95.6%和92.7%。
实施例4降血脂动物试验
健康昆明大鼠24只,雌雄各半,平均体重为200±10g,适应性喂养3天后,第4天眼眶取血测空腹血脂,随机分为4组。A组(n=6)为正常组,剩余动物喂高脂饲料一周,建立高脂模型。将高脂模型动物随机分为3组,B组(n=6)为空白组,C组(n=6)每天灌胃艾叶提取物(艾叶黄酮:艾叶多糖=2:1,100mg/kg),D组(n=6)每天灌胃艾叶提取物(艾叶粉100mg/kg),每次0.1mL。
试验共8周,第一周建立高脂模型,第二周开始每周测总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C),比较大鼠在0W、2W和8W的各指标,试验结果见图4-图7。
由图可以看出,C组和D组在灌胃艾叶提取物第8周,TG、TC、LDL-C显著下降,且与空白组B相比有显著差异(p<0.01),与正常组A无显著差异;HDL-C含量增加,并接近正常值,与空白组B相比有显著差异(p<0.01),与正常组A无显著差异。说明艾叶提取物和艾叶粉具有调节血脂的作用,其中艾叶提取物的降脂效果略优于艾叶粉。
Claims (1)
1.一种从艾叶中同时提取多糖和黄酮类成分的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)将艾叶粉按1:20的料液比加入离子液体双水相并在250MPa的压力下进行超高压提取,所述超高压提取的保压时间是2min,离心收集提取液;所述离子液体双水相中含有0.3g/mL的离子液体和0.09g/mL的盐,所述离子液体为溴化1-己基-3-甲基咪唑,所述盐为K2HPO4;
2)将收集到的提取液静置分相,上相液过DEAE纤维素柱,依次用水和NaCl溶液洗脱,收集含有艾叶多糖的洗脱液,下相液加入乙酸乙酯萃取并回收离子液体,然后过AB-8型大孔树脂柱,用80%乙醇洗脱,收集含有艾叶黄酮的洗脱液;
3)将洗脱液分别浓缩、干燥,得到艾叶多糖和艾叶黄酮。
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