CN112608395A - 一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法 - Google Patents

一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法。本发明首次对山茱萸籽多糖进行了分离纯化，首先对山茱萸籽多糖进行脱色、脱蛋白处理，然后利用阴离子交换柱层析进行初步分离纯化，葡聚糖凝胶柱层析进一步分离纯化，从而得到纯度较高的山茱萸籽多糖组分，为进一步探讨山茱萸籽多糖结构及其生物活性奠定技术基础，也为山茱萸籽产业带来更大的经济效益。

Description

一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法。
背景技术
山茱萸(Fructus Corni)为山茱萸科植物山茱萸的干燥果肉，又名山萸肉、药枣、肉枣等,临床上以除去种子的成熟果实入药，其味酸、涩、微温,归肝肾经，有补益肝肾、涩精固脱的功效，是我国传统的中药材，也是中医常用的名贵药材之一。中医药临床研究证明，山茱萸是治疗糖尿病、冠心病和高血压病的主要药材。现代研究表明，山茱萸具有增强免疫系统功能、抗炎抑菌、降血糖、抗休克、抗氧化、抗肿瘤等作用。山茱萸中含有丰富的多糖类成分，药理研究显示，山茱萸多糖是其中一类主要活性成分；果肉中主要成分有糖类、有机酸类及其酯类、鞣质类等。多糖类物质是生命代谢不可缺少的重要物质,具有多种生物活性，多糖的分离纯化是研究多糖结构和活性的基础，只有得到相对纯度较高的多糖组分，才能更好地分析其结构，从而探究其重要的生理功能，因此多糖类物质为当今生物医药研究和开发的一大热点。
目前国内外对山茱萸的研究主要集中在化学成分及药理作用方面，其主要成分为环烯醚萜苷类、五环三萜酸及其酯类、鞣质类、挥发油类及多糖类等，具有免疫调节、降低血糖、抗休克、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗衰老、抗癌、抗艾滋病和治疗不育症等药理活性。
山茱萸籽是山茱萸果实留下的果仁，富含多糖、蛋白质和油脂等成分。山茱萸籽目前的研究仅限于山茱萸籽油、栲胶，山茱萸籽多糖尚无人研究，而山茱萸籽中的糖类物质相当丰富，大量的山茱萸籽中的糖类物质未得到合理的利用，造成植物多糖资源的浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，它包括以下步骤：
S1.脱色：将山茱萸籽粗多糖溶液中加入双氧水，并调节溶液的pH值至8-9，在35-45℃的水浴中脱色0.5-1.5h，脱色后离心得澄清粗多糖溶液；
S2.脱蛋白：将澄清粗多糖溶液中加入Sevage试剂，剧烈震荡15-25min后移入分液漏斗中静置，弃取中间层和下层，多次重复至分液漏斗中无明显的中间蛋白层；将上层的浓缩多糖溶液用透析袋透析除去盐类及小分子杂质，得无蛋白的山茱萸籽多糖；
S3.阴离子交换柱层析：采用DEAE-52纤维素柱对无蛋白的山茱萸籽多糖进行分离纯化,分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/LNaCl溶液以1.0mL/min的流速逐步洗脱，收集吸收峰洗脱液；
S4.葡聚糖凝胶柱层析：采用Sephadex G-100柱对步骤S3中的吸收峰洗脱液进一步分离纯化，用蒸馏水以流速0.4mL/min洗脱，收集吸收峰洗脱液，并将洗脱液后处理得高纯度的山茱萸籽多糖。
进一步地，步骤S1中所述双氧水的质量百分比浓度为30％。
进一步地，步骤S1中用氢氧化钠调节溶液的pH值。
进一步地，步骤S1中所述离心的转速为5000-7000r/min，离心时间为3-7min。
进一步地，步骤S2中所述Sevage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
进一步地，步骤S2中所述透析时间为45-50h，并间隔12h更换一次蒸馏水。
进一步地，步骤S3中所述无蛋白的山茱萸籽多糖溶液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为5mL，上样前山茱萸籽多糖溶液过0.45μm的过滤膜。
进一步地，步骤S4中所述洗脱液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为4mL。
进一步地，步骤S4中所述后处理包括浓缩、透析和冻干。
本发明具有以下优点：本发明首次对山茱萸籽多糖进行了分离纯化，首先对山茱萸籽多糖进行脱色、脱蛋白处理，然后利用阴离子交换柱层析进行初步分离纯化，葡聚糖凝胶柱层析进一步分离纯化，从而得到纯度较高的山茱萸籽多糖组分，为进一步探讨山茱萸籽多糖结构及其生物活性奠定技术基础，也为山茱萸籽产业带来更大的经济效益。
附图说明
图1为本发明方法流程图；
图2为本发明DEAE-52柱层析洗脱图；
图3为本发明Sephadex G-100柱层析洗脱图；
图4为本发明多糖组分COSP-4的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，它包括以下步骤：
S1.脱色：将山茱萸籽粗多糖溶液中加入质量百分比浓度30％的双氧水，并加入氢氧化钠调节溶液的pH值至8，在35-45℃的水浴中脱色0.5h，脱色后离心得澄清粗多糖溶液；其中，离心机的转速为5000r/min，离心时间为3min；
S2.脱蛋白：将澄清粗多糖溶液中加入Sevage试剂，氯仿与正丁醇的体积比为4:1，剧烈震荡15min后移入分液漏斗中静置，弃取中间层和下层，多次重复至分液漏斗中无明显的中间蛋白层；将上层的浓缩多糖溶液用透析袋透析除去盐类及小分子杂质，透析时间为45h，并间隔12h更换一次蒸馏水，得无蛋白的山茱萸籽多糖；
S3.阴离子交换柱层析：采用DEAE-52纤维素柱对无蛋白的山茱萸籽多糖进行分离纯化,分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl溶液以1.0mL/min的流速逐步洗脱，收集吸收峰洗脱液；其中，无蛋白的山茱萸籽多糖溶液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为5mL，上样前山茱萸籽多糖溶液过0.45μm的过滤膜；
S4.葡聚糖凝胶柱层析：采用Sephadex G-100柱对步骤S3中的吸收峰洗脱液进一步分离纯化，用蒸馏水以流速0.4mL/min洗脱，收集吸收峰洗脱液，所述洗脱液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为4mL，并将洗脱液浓缩、透析和冻干得高纯度的山茱萸籽多糖。
实施例2：一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，它包括以下步骤：
S1.脱色：将山茱萸籽粗多糖溶液中加入质量百分比浓度30％的双氧水，并加入氢氧化钠调节溶液的pH值至9，在45℃的水浴中脱色1.5h，脱色后离心得澄清粗多糖溶液；其中，离心机的转速为7000r/min，离心时间为7min；
S2.脱蛋白：将澄清粗多糖溶液中加入Sevage试剂，氯仿与正丁醇的体积比为4:1，剧烈震荡25min后移入分液漏斗中静置，弃取中间层和下层，多次重复至分液漏斗中无明显的中间蛋白层；将上层的浓缩多糖溶液用透析袋透析除去盐类及小分子杂质，透析时间为50h，并间隔12h更换一次蒸馏水，得无蛋白的山茱萸籽多糖；
S3.阴离子交换柱层析：采用DEAE-52纤维素柱对无蛋白的山茱萸籽多糖进行分离纯化,分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl溶液以1.0mL/min的流速逐步洗脱，收集吸收峰洗脱液；其中，无蛋白的山茱萸籽多糖溶液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为5mL，上样前山茱萸籽多糖溶液过0.45μm的过滤膜；
S4.葡聚糖凝胶柱层析：采用Sephadex G-100柱对步骤S3中的吸收峰洗脱液进一步分离纯化，用蒸馏水以流速0.4mL/min洗脱，收集吸收峰洗脱液，所述洗脱液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为4mL，并将洗脱液浓缩、透析和冻干得高纯度的山茱萸籽多糖。
实施例3：一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，它包括以下步骤：
S1.脱色：将山茱萸籽粗多糖溶液中加入质量百分比浓度30％的双氧水，并加入氢氧化钠调节溶液的pH值至9，在40℃的水浴中脱色1h，脱色后离心得澄清粗多糖溶液；其中，离心机的转速为6000r/min，离心时间为5min；
S2.脱蛋白：将澄清粗多糖溶液中加入Sevage试剂，氯仿与正丁醇的体积比为4:1，剧烈震荡20min后移入分液漏斗中静置，弃取中间层和下层，多次重复至分液漏斗中无明显的中间蛋白层；将上层的浓缩多糖溶液用透析袋透析除去盐类及小分子杂质，透析时间为48h，并间隔12h更换一次蒸馏水，得无蛋白的山茱萸籽多糖；
S3.阴离子交换柱层析：采用DEAE-52纤维素柱对无蛋白的山茱萸籽多糖进行分离纯化,分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl溶液以1.0mL/min的流速逐步洗脱，收集吸收峰洗脱液；其中，无蛋白的山茱萸籽多糖溶液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为5mL，上样前山茱萸籽多糖溶液过0.45μm的过滤膜；
S4.葡聚糖凝胶柱层析：采用Sephadex G-100柱对步骤S3中的吸收峰洗脱液进一步分离纯化，用蒸馏水以流速0.4mL/min洗脱，收集吸收峰洗脱液，所述洗脱液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为4mL，并将洗脱液浓缩、透析和冻干得高纯度的山茱萸籽多糖。
以下通过实验说明本发明的有益效果：
一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，如图1所示，它包括以下步骤：
S1.脱色：称取500mg山茱萸籽粗多糖，溶于蒸馏水中配制成5mg/mL的山茱萸籽多糖溶液，加入5mL质量百分比浓度30％的双氧水，并加入氢氧化钠调节溶液的pH值至9，在40℃的水浴中脱色1h，脱色后离心得澄清粗多糖溶液；其中，离心机的转速为6000r/min，离心时间为5min；
S2.脱蛋白：将澄清粗多糖溶液中加入Sevage试剂，氯仿与正丁醇的体积比为4:1，剧烈震荡20min后移入分液漏斗中静置20min，弃取中间层和下层，多次重复至分液漏斗中无明显的中间蛋白层；将上层的浓缩多糖溶液用透析袋透析除去盐类及小分子杂质，透析时间为48h，并间隔12h更换一次蒸馏水，得无蛋白的山茱萸籽多糖，冷冻干燥，即可获得山茱萸籽多糖，多糖的回收率为72.14％±0.41％；
S3.阴离子交换柱层析：采用DEAE-52纤维素柱对无蛋白的山茱萸籽多糖进行分离纯化,称取500mg山茱萸籽多糖样品，溶于50mL蒸馏水中，配制成浓度为10mg/mL的多糖溶液，多糖溶液过0.45μm过滤膜，每次上样体积5mL，分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl溶液以1.0mL/min的流速逐步洗脱，自动馏分收集器每管收集5mL馏分，以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法测定，得到五个多糖组分(COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5)，合并主要吸收峰洗脱液，浓缩，透析48h除盐，冷冻干燥；
S4.葡聚糖凝胶柱层析：采用Sephadex G-100(1.6cm×50cm)柱对主要馏分COSP-4进一步分离纯化，洗脱液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为4mL，用蒸馏水以流速0.4mL/min洗脱，自动馏分收集器每管收集2mL馏分，采用苯酚-硫酸法于490nm处测定每管洗脱液的吸光值，绘制洗脱曲线，根据出峰位置收集主要馏分、浓缩、透析，冻干得到多糖纯化组分COSP-4。
实验结果：
1.阴离子交换柱层析
DEAE-52纤维素柱为阴离子交换层析柱，能根据样品所带电荷的强弱将其分成不同的组分。由图2可知，经过蒸馏水、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaCl溶液进行洗脱，得到五个多糖纯化组分(COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5)。分别收集多糖组分，浓缩后透析，冻干得白色粉末，为山茱萸籽多糖初步分离纯化组分COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5，得率分别为2.12％、5.24％、6.57％、20％、2.07％。
2.葡聚糖凝胶柱层析
凝胶色谱柱是根据分子量大小对样品进行分离纯化，分子量大的分子先流出色谱柱，分子量小的后流出，从而达到分离效果。利用Sephadex G-100对经过离子交换柱初步分离的含量最高多糖组分COSP-4进行进一步的纯化，如图3所示，用Sephadex G-100纯化后的COSP-4为单峰，表明多糖样品相对纯净单一，为均一组分。主要馏分收集、浓缩、透析，冻干得精制的山茱萸籽多糖组分COSP-4，呈白色粉末状，得率为70％，综合阴离子交换柱层析第一步纯化得率，COSP-4最终得率为14％。
3.多糖组分纯度鉴定
多糖组分纯度鉴定结果如图4所示，从图4可以看出，COSP-4在200nm附近有明显的紫外吸收，说明在200nm附近有吸收峰，而在260nm和280nm处没有明显的吸收峰，说明没有蛋白质和核酸残留，表明多糖纯度较高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1.脱色：将山茱萸籽粗多糖溶液中加入双氧水，并调节溶液的pH值至8-9，在35-45℃的水浴中脱色0.5-1.5h，脱色后离心得澄清粗多糖溶液；
S2.脱蛋白：将澄清粗多糖溶液中加入Sevage试剂，剧烈震荡15-25min后移入分液漏斗中静置，弃取中间层和下层，多次重复至分液漏斗中无明显的中间蛋白层；将上层的浓缩多糖溶液用透析袋透析除去盐类及小分子杂质，得无蛋白的山茱萸籽多糖；
S3.阴离子交换柱层析：采用DEAE-52纤维素柱对无蛋白的山茱萸籽多糖进行分离纯化,分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/LNaCl溶液以1.0mL/min的流速逐步洗脱，收集吸收峰洗脱液；
S4.葡聚糖凝胶柱层析：采用Sephadex G-100柱对步骤S3中的吸收峰洗脱液进一步分离纯化，用蒸馏水以流速0.4mL/min洗脱，收集吸收峰洗脱液，并将洗脱液后处理得高纯度的山茱萸籽多糖。
2.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S1中所述双氧水的质量百分比浓度为30％。
3.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S1中用氢氧化钠调节溶液的pH值。
4.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S1中所述离心的转速为5000-7000r/min，离心时间为3-7min。
5.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述Sevage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
6.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述透析时间为45-50h，并间隔12h更换一次蒸馏水。
7.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S3中所述无蛋白的山茱萸籽多糖溶液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为5mL，上样前山茱萸籽多糖溶液过0.45μm的过滤膜。
8.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S4中所述洗脱液的上样浓度为10mg/mL，上样体积为4mL。
9.根据权利要求1所述的一种山茱萸籽多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤S4中所述后处理包括浓缩、透析和冻干。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210406

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