CN107857827A - 一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤：a)将山茱萸干料粉碎成山茱萸超细粉料；b)山茱萸超细粉料在培养罐内超声、酶解，加蒸馏水，得到山茱萸多糖提取液；c)山茱萸多糖提取液的灭酶处理；d)超声、过滤、加乙醇静置、抽滤、干燥得山茱萸多糖粗品；e)对山茱萸多糖粗品进行分级脱蛋白；f)溶于蒸馏水，离心分离，取上清液过DEAE‑cellulose柱及层析柱；g)洗脱液进行真空低温升华，得到白色山茱萸多糖。本发明提出的分离提取与纯化方法，在复合酶雾汽的环境中进行酶解、分级脱蛋白以及蒸馏水层析，提取时间短，提取效率高，山茱萸多糖的产品纯度高，满足工业和实验要求。
Description
技术领域
本发明涉及植物多糖提取技术领域，具体涉及一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法。
背景技术
山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的干熟果肉，又名药枣或蜀枣，具有增强免疫系统功能，抗癌，利尿降压抗氧化的药理功效，是一种滋补类名贵药材。除此之外其在食品工业也有广泛应用。山茱萸含有山茱萸多糖、有机酸、鞣质等有效成分，其中山茱萸多糖尤其具有免疫调节、抗刷老等功效，其对于人体其他疾病的预防与治疗也同样随着人们对其认识的加深而得到越来越多的重视。而山茱萸多糖的提取，分离和纯化的技术方法也成为研究的一大方向。
现有的山茱萸多糖提取方法普遍通过醇沉过滤后经单次脱蛋白及过层析柱等方式进行，但是这种方式存在提取效率低，提取时间周期长且多糖的获取纯度较低，难以满足工业或实验要求等缺点。本发明针对上述现有技术中的缺点提供一种高效率高纯的山茱萸多糖的分离提取与纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效高纯度山茱萸多糖的提取、分离及纯化方法，缩短了提取时间，提高了提取效率及山茱萸多糖产品纯度。
一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤：
a)将山茱萸干料以液氮为冷源，经冷冻粉碎机粉碎成山茱萸超细粉料；
b)将所述山茱萸超细粉料喷洒于35℃环境的复合酶雾汽培养罐内，并辅以超声处理，酶解15min，加入35℃蒸馏水，得到山茱萸多糖提取液；
c)将山茱萸多糖提取液加热至90℃，保持15分钟，冷却至35℃，进行灭酶处理；
d)灭酶处理后进行超声处理，超声功率600w，提取3次后过滤，加入等体积的工业纯乙醇静置3h，然后进行抽滤以及低温升华干燥，得到山茱萸多糖粗品；
e)对山茱萸多糖粗品进行分级脱蛋白；
f)分级脱蛋白后将之溶于三次蒸馏水中，进行离心分离，取上清液过DEAE-cellulose柱及层析柱；
g)洗脱液进行真空低温升华，得到白色山茱萸多糖。
优选的，步骤b)中所述复合酶雾汽来自pH6.5含有果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶的酶溶液，其中超声频率为1.7MHz，以能够实现超声悬浮及加速酶解过程。
优选的，步骤e)中的分级脱蛋白的过程为：将山茱萸多糖粗品制成0.5mg/ml的溶液，定容100ml，按比例逐次加入浓度递增的Sevag试剂，萃取3次，每次取上清液；其中，三次萃取过程中Sevag试剂的添加量分别为10ml、15ml和25ml。
优选的，步骤f)中的过柱过程具体为：将分级脱蛋白后溶于三次蒸馏水的山茱萸多糖溶液过DEAE-cellulose柱两次，用NaCl溶液洗脱，洗脱液进行层析分离过凝胶柱，将Sephacryl S-300柱与Sephacryl S-300HR柱进行上下连接，其中，Sephacryl S-300柱规格为120mm×300mm，Sephacryl S-300HR柱规格为30mm×300mm；后用三次蒸馏水4MPa压力下洗脱。
本发明的有益效果：
1)将山茱萸首先进行低温粉碎雾化酶解，充分利用超声振动及超声悬浮的效果，在维持复合酶雾汽环境的基础上大大提高的酶解速率，其酶解过程的前置也更好地保护了山茱萸多糖结构的完整性，同时，充分的酶解过程也将现有技术中重复醇沉过滤的过程简化为一次醇沉，并进一步缩短了后续醇沉步骤的沉降时间；
2)对山茱萸多糖粗品分级脱蛋白，在Sevag脱蛋白技术的基础上，通过精确控制Sevag试剂的用量逐级增加Sevag试剂浓度，最终保证了在不破坏山茱萸多糖结构的基础上，获得了更高纯度的山茱萸多糖产品；
3)在层析过程中在将Sephacryl S-300柱与Sephacryl S-300HR柱连接使用的基础上，将山茱萸多糖粗品溶于三次蒸馏水中，减小了Sephacryl S-300HR柱外径尺寸，并统一加压洗脱，在缩短了层析过程的同时，进一步大幅提高了山茱萸多糖产品的纯度，更好地满足了工业或实验要求，同时，三次蒸馏水的使用也尤为关键，其是连接两种层析柱进行层析过柱提高纯度的前提基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例，本发明提出的一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤：
a)将山茱萸干料以液氮为冷源，经冷冻粉碎机粉碎成山茱萸超细粉料；
b)将山茱萸超细粉料喷洒于35℃环境的复合酶雾汽培养罐内，并辅以超声处理，酶解15min，加入35℃蒸馏水，得到山茱萸多糖提取液；其中，复合酶雾汽来自pH6.5含有果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶的酶溶液，其中超声频率为1.7MHz；
c)将山茱萸多糖提取液加热至90℃，保持15分钟，冷却至35℃，进行灭酶处理；
d)灭酶处理后进行超声处理，超声功率600w，提取3次后过滤，加入等体积的工业纯乙醇静置3h，然后进行抽滤以及低温升华干燥，得到山茱萸多糖粗品；
e)对山茱萸多糖粗品进行分级脱蛋白：将山茱萸多糖粗品制成0.5mg/ml的溶液，定容100ml，按比例逐次加入浓度递增的Sevag试剂，萃取3次，每次取上清液；其中，三次萃取过程中Sevag试剂的添加量分别为10ml、15ml和25ml；
f)分级脱蛋白后将之溶于三次蒸馏水中，进行离心分离，取上清液过DEAE-cellulose柱两次，用NaCl溶液洗脱，洗脱液进行层析分离过凝胶柱，将Sephacryl S-300柱与Sephacryl S-300HR柱进行上下连接，其中，Sephacryl S-300柱规格为120mm×300mm，Sephacryl S-300HR柱规格为30mm×300mm；后用三次蒸馏水4MPa压力下洗脱；
g)洗脱液进行真空低温升华，得到白色山茱萸多糖。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)将山茱萸干料以液氮为冷源，经冷冻粉碎机粉碎成山茱萸超细粉料；
b)将所述山茱萸超细粉料喷洒于35℃环境的复合酶雾汽培养罐内，并辅以超声处理，酶解15min，加入35℃蒸馏水，得到山茱萸多糖提取液；
c)将山茱萸多糖提取液加热至90℃，保持15分钟，冷却至35℃，进行灭酶处理；
d)灭酶处理后进行超声处理，超声功率600w，提取3次后过滤，加入等体积的工业纯乙醇静置3h，然后进行抽滤以及低温升华干燥，得到山茱萸多糖粗品；
e)对山茱萸多糖粗品进行分级脱蛋白；
f)分级脱蛋白后将之溶于三次蒸馏水中，进行离心分离，取上清液过DEAE-cellulose柱及层析柱；
g)洗脱液进行真空低温升华，得到白色山茱萸多糖。
2.根据权利要求1所述的一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于：步骤b)中所述复合酶雾汽来自pH6.5含有果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶的酶溶液，其中超声频率为1.7MHz，以能够实现超声悬浮及加速酶解过程。
3.根据权利要求1所述的一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于：步骤e)中的分级脱蛋白的过程为：将山茱萸多糖粗品制成0.5mg/ml的溶液，定容100ml，按比例逐次加入浓度递增的Sevag试剂，萃取3次，每次取上清液；其中，三次萃取过程中Sevag试剂的添加量分别为10ml、15ml和25ml。
4.根据权利要求1所述的一种山茱萸多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于：步骤f)中的过柱过程具体为：将分级脱蛋白后溶于三次蒸馏水的山茱萸多糖溶液过DEAE-cellulose柱两次，用NaCl溶液洗脱，洗脱液进行层析分离过凝胶柱，将Sephacryl S-300柱与Sephacryl S-300HR柱进行上下连接，其中，Sephacryl S-300柱规格为120mm×300mm，Sephacryl S-300HR柱规格为30mm×300mm；后用三次蒸馏水4MPa压力下洗脱。
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