CN101983969B

CN101983969B - 白果蛋白超微粉的制备方法

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Publication number: CN101983969B
Application number: CN201010112088.8A
Authority: CN
Inventors: 王成章; 陈西娟; 叶建中; 陈虹霞; 马维新; 周彬; 程耀波
Original assignee: PIZHOU XINYUAN BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd; Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Current assignee: Chengdu Yishenrui Technology Co ltd; Jiangsu Hengtian Biotechnology Co ltd; Shanghai Di Wan Electronic Technology Co ltd; Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Priority date: 2010-02-12
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2030-02-12
Also published as: CN101983969A

Abstract

本发明公开一种白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于低温干燥新鲜白果、低温气流破壁，低温去脂、通过盐溶解和盐析、10KD-30KD超滤膜分离、DEAE-cellulose柱分离、冷冻干燥、低温气流粉碎等工艺，制备的白果蛋白超微粉分子量在17KD-20KD，含水量＜5％，总蛋白大于90％，粒径为1-25μm，破壁率大于98％。制备的白果油收率明显提高，相对于普通白果粉超临界萃取的白果油收率提高20％-35％。

Description

白果蛋白超微粉的制备方法

技术领域

本发明设计一种蛋白制备提取领域，尤其涉及一种白果蛋白超微粉的制备方法。

背景技术

银杏白果，内含多种生物活性营养物质，每百克干果中含蛋白质134g，脂肪3g，碳水化合物712g，钙196mg，胡萝卜素02mg，硫胺素044mg，尼克酸26mg，另外还含有少量的银杏黄酮、白果黄素、白果内酯等生物药用活性物质。李时珍《本草纲目》中有载：“白果熟食温肺益气，定喘嗽，缩小便，止白浊。生食降痰，消毒杀虫。”白果具有明显的抑制结核杆菌生长、抗癌、抗衰老、抗疲劳、耐缺氧的作用。食则补心养气，益肾润肺，涩精固元，延年益寿；入药可止咳平喘，对老人哮喘、妇女白带、小儿遗尿等皆有一定的疗效。1992年被我国卫生部确定为药食同源果品。

白果不仅含有黄酮、萜内酯、蛋白质和微量元素，而且银杏油脂中主要含有两种必需脂肪酸，即亚油酸和α-亚麻酸。在传统的加工工艺中，没有脱毒工艺，产品中残留氰氢酸、白果酸、氢化白果酸和白果酚等银杏毒素，容易引起不良反应，影响人的神经系统、消化系统、皮肤系统和造血系统。而且由于含有不饱和脂肪酸容易引起蚝败变质，采用常规的破碎对白果有效成份的提取率很低，因此，制约了白果粉体产品的深加工。如何将传统的白果干果的加工转向白果超微粉体及其高浓蛋白产品，国内外尚没有任何报道。

近年来，超微细粉化技术在中药粉碎中的应用日趋增多，运用超声粉碎、超低温粉碎等现代超细微加工技术，可将原生药从传统粉碎工艺得到的中心粒径150～200目的粉末(75μm以下)，提高到现在的中心粒径为5～10μm以下，在该细度条件下，一般药材细胞的破壁率≥95％。这种新技术的采用，可使白果其中的有效成分直接暴露出来，从而使有效营养成分的溶出更加迅速完全，最大程度地保留了银杏白果中生物活性物质及各种营养成分，提高了药效。

CO₂超临界萃取工艺在植物油及植物提取物中应用广泛，国内有文献报道利用CO₂超临界萃取工艺萃取白果油，但如果将白果普通的机械粉碎，再进行CO₂超临界萃取，白果油的提取率很低，大量的白果油及酚酸类成分仍残留于粉体中，影响白果进一步深加工。因此，银杏白果超细粉体及其功能化食品的深加工藕合技术研究是银杏产业近期研究的热点和亟待解决的问题。

近年来，关于蛋白质以及多肽的研究进展迅速，尤其是一些具有生理和药物活性的天然多肽和蛋白质，目前已有为数不少的新成分被发现，它们不仅在调节机体功能上发挥重要的作用，而且在抗艾滋病、癌症、心脑血管等疾病上也具有活性。

白果富含活性蛋白质，具有很好的药用价值。国外学者从白果槲寄生及同科植物中分到Viscotoxin A2，A1，B及PhOrat oxin等同源多肽，有46个氨基酸残基组成。国内华中农业大学的邓乾春采用(NH₄)₂SO₄盐溶盐析法得到了一种白果清蛋白(GAP)，经分离纯化从中鉴定出一种在GAP中占主要级分的新蛋白，命名为GAP II a，分子量为29248u，氨基酸组成为脂肪族氨基酸残基占33.21％(共90个)，芳香族氨基酸残基占7.38％(共20个)，羟基氨基酸残基与含硫氨基酸残基占26.57％(共72个)，酸性氨基酸残基及其酰胺占23.61％(共64个)，碱性氨基酸残基占6.27％(共17个)。经证实GAP具有较明显的生物活性，具有抗生物氧化活性，能显著增强小鼠的免疫调节作用，增强免疫功能低下模型小鼠的免疫调节能力，刺激模型小鼠造血功能的恢复，并能提高模型小鼠的抗氧化能力，且对γ射线辐射损伤小鼠的保护作用。黄文报道了GAP对黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)等真菌有很强的抑制作用，而且对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia Coli)等细菌也有一定的作用。陈晓清等人从海水小球藻(Chlorellapacifica)提取液中通过硫酸铵沉淀，DEAE-52离子交换层析和SephadexG-200凝胶过滤层析后分离纯化出1种抗菌蛋白，经测定，两个亚基的相对分子量分别为61kD和70kD，且纯化的蛋白质对产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和中华根霉(Rhizopus chinensis)有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肠炎病病原菌(Ameromonas punctata)也有抑制作用，其抗真菌活性比抗细菌强。

在蛋白质的提取分离方法方面，BETTY A.EIPPER于1972年提取了小鼠微管蛋白，采用了以下方法：于0-4℃下粉碎并均匀化小鼠脑组织，室温下放入pH6.5的0.05mol/L焦磷酸钠，2.5mmol/L MgCl₂溶液，0.24mol/L蔗糖溶液和0.1mmol/L鸟苷酸溶液中，提取可溶性蛋白(离心条件：16,000×g，30min)，上清液进行饱和硫酸铵分级沉淀，分级范围为30％～50％。蛋白提取液上DEAE-纤维素树脂，用PPMg(0.05mol/L焦磷酸钠，2.5mmol/LMgCl₂)溶液平衡树脂，0.01mol/L NaCl溶液淋洗，再用0.26mol/L NaCl溶液洗脱微管蛋白。Mary.C KENNEDY等人对牛肝脏的Cytosolic Aconitase蛋白进行了一系列纯化步骤。制备过程都形成了一定的模式，即破碎匀质→超声盐提取→饱和盐析→透析除盐→上离子交换层析柱→透析除盐→上凝胶层析柱→透析除盐→进行电泳制备或分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种高品质的白果高浓蛋白超微粉的加工方法。通过本发明制备的白果高浓蛋白超微粉，破壁率大于98％，总蛋白大于90％、分子量分布17KD-20KD、粒径为1-25μm；同时制备原味高品质白果油。本专利制备的高浓蛋白超微粉无油脂和氰氢酸、白果酸、白果酚等白果毒素残留，而且分子量分布易为人体吸收，能明显提高机体的免疫功能。该方法具有资源利用率高、成本低，产品附加值高的特点，而且对环境友好。

本发明的技术解决方案：

一种白果蛋白超微粉的制备方法，由以下步骤组成：

第一步，低温干燥：将秋季收集的新鲜白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，再除去外壳和内衣，将果仁粉碎，红外快速测定，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉，

第二步，低温破壁：在温度低于10℃下，将所述白果粗粉采用喷式低温气流粉碎机破壁粉碎得到白果超微粉，气流粉碎机分级轮频率20-60Hz，空气压力0.8-1.5MPa，加料速度为1kg/h-3kg/h，粉碎时间5-50min，

第三步，低温去脂：将白果超微粉采用CO₂超临界萃取，萃取压力10-30MPa，萃取温度25-50℃，萃取时间1-4h，CO₂流量10-30L/h，采用质量浓度为1％-15％石油醚作为夹带剂，

第四步，低温盐溶解和盐析：采用超声波在温度低于10℃下提取所述CO₂超临界萃取剩下的白果超微粉，提取剂为0.15-0.30mol/L NaCl盐溶液，所述白果超微粉与提取剂比例为1∶4-1∶20(g/ml)，提取时间10-60min，提取次数2-6次，

第五步，盐析：采用质量浓度为10％-15％单宁酸、质量浓度为10％-15％的三氯乙酸(TCA)、(NH4)₂SO₄(APS)、乙醇和丙酮等任一种溶剂或几种混合溶剂加入到超声波低温提取液中，盐溶液与提取液的体积比为1∶3-5，沉淀离心，分离得到白果蛋白，

第六步，膜分离：将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，采用分子量15KD-25KD的超滤离心浓缩管分离，超滤膜为聚醚砜，离心力12000g-15000g，离心时间10-50min，得到白果蛋白的浓缩液，

第七步，色谱柱分离：采用二乙氨基乙基纤维素(DEAE-cellulose)和葡聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱色谱依次分离白果蛋白的浓缩液，洗脱剂采用pH＝8.0的0.1-1mol/L不同浓度的NaCl溶液，

第八步，冷冻干燥：将色谱柱分离得到的高浓蛋白液采用-10℃至-50℃冷冻干燥15-48h，再低温气流破壁，低温气流破壁的条件与第二步低温破壁的条件相同，使其粒度在1-25μm。

上述技术方案中，所述白果品种为泰兴龙眼、随州圆型果、泰兴大佛指、灵川梅型果、兴安长柄果、灵川马玲果中的一种。第二步低温破壁的温度为0-10℃。超声波提取的温度为0-10℃。所述超临界萃取温度为40℃、压力为20MPa、流速为15L/h、时间为3h。第五步所述溶剂为(NH4)₂SO₄或质量浓度为10％-15％的单宁酸。

每年秋天收集的新鲜白果除去外种皮后，白果的水份含量高于50％，在自身酶的作用下发生化学成分的代谢，酶降解，容易发霉变质，蛋白质和油脂等营养成分破坏。因此，传统的保存方法是将白果在太阳下晒干、或热烘干，白果的水分仍在10％左右，由于高温容易引起蛋白质的化学变性，因此，本专利的加工方法为了保证白果的品质和蛋白质不发生降解，采用冷冻干燥的方法，将含水量在50％-65％新鲜白果脱壳后在-10℃至-50℃冷冻干燥，冷冻时间6-50小时，优选-15℃-25℃，冷冻时间10-28小时，含水量＜6％。如果不采用本专利技术处理，由于水份高(一般高于15％或达到50％以上)白果蛋白易酶解，产生异味，也容易霉变，影响到白果的风味。如果采用热干燥或日晒处理，白果原有的挥发性成分容易损失，同时油脂容易产生酸败。本专利低温冷冻的白果含水率低于6％，不仅易于保存，比传统的方法可延长货架期半年，而且保持了白果的原质和原风味。

传统的白果蛋白粉的制备是先将新鲜白果高温蒸煮，使壳变脆，用机械辊筒轧壳分离，再用直接蒸气冲去内衣膜等预处理，果仁用去离子水喷淋后凉干，用磨浆机打成固体粒度在200μm以上的浆液，50℃-80℃真空浓缩，制成固含量25％-35％的悬浮液，再在进风温度190℃-220℃下喷雾干燥得含水量在10％左右的粉体；冷冻干燥白果粉末中蛋白质含量11.78％大于喷雾干燥白果粉末中蛋白质含量9.76％。这是由于经过高温处理，白果蛋白、多肽、酶等活性物已变性，不能保持原有蛋白和多肽的结构。

不同干燥方式对白果粉末颗粒度产生影响，冷冻干燥的白果粉末颗粒呈现长形、针形、扁片形、椭圆形等，形状多样，且不规则(图1a)；而喷雾干燥的白果粉末颗粒大多接近球形(图1b)。这是由于喷雾干燥经过了雾化器的造粒过程，使颗粒均匀且形状基本相同；冷冻干燥干燥过程中物料静止在平面上，没有造粒过程，料液随意结合，形成的颗粒形状多样化。

本发明将新鲜白果在-10℃至-50℃冷冻干燥，冷冻干燥后的白果经机械辊筒破壳分离，风机分级去除囊衣、胚芽后，采用喷式低温气流粉碎机破壁粉碎，气流粉碎机分级轮频率20-60Hz，温度＜10℃，空气压力0.8-1.5MPa，加料速度为1kg/h-3kg/h，粉碎时间5-50min，白果超微粉的粒径为1-25μm，破壁率大于98％，不仅有效地保持了白果蛋白质的活性组分未变性，而且破壁可以大大提高超临界对油脂的萃取率，比传统的方法可延长货架期半年，而且保持了白果的原质和原风味，有利于提高盐溶性蛋白质的提取率。

白果粗粉中含有3-10％油脂，容易引起蚝败变质，因此将白果粉中的油脂分离可延长白果粉的保存期。传统的办法采用压榨制油和非极性溶剂提取制油。

本发明收集江苏泰兴大佛指，扁佛指，七星果，龙眼等七个品种的白果，对比超声波萃取法、索氏提取法和二氧化碳超临界萃取白果油的工艺，分别考察对白果油收率的影响。如表1。

表1不同萃取方式对白果油脂萃取率比较

由表1可以看出，白果不同品种的油脂含量存在明显差异，索式提取率在1.79％-6.58％，超声波提取率在1.22％-5.10％，超临界萃取提取率在2.64％-7.98％，CO₂超临界萃取率白果油脂的收率最高，因此，本发明选择CO₂超临界萃取白果油脂，以泰兴龙眼为原料，设计了影响白果油萃取率的温度、压力、流速、时间四因素三水平的正交实验，结果见表2。

表2正交试验结果分析

本发明公开了二氧化碳超临界萃取白果油的最佳工艺为：温度40℃、压力20MPa、流速15L/h、时间3h，1％-15％石油醚作为夹带剂。

为了提高白果油脂的萃取率，本发明采用低温气流粉碎白果成超微粉，低温气流粉碎分级轮频率20-60Hz，温度＜10℃，空气压力0.8-1.5MPa，加料速度为1kg/h-3kg/h，粉碎时间5-50min，白果超微粉的粒径为1-25μm。与传统破碎的白果粉相比，白果超微粉粒径小，比表面积增大，提高了溶剂与白果油脂接触面积，因此再进行CO₂超临界低温萃取，萃取压力10-30MPa，萃取温度25-50℃，萃取时间1-4h，CO₂流量10-30L/h，石油醚作为夹带剂，优选超临界萃取温度40℃、压力20MPa、流速15L/h、时间3h，制备不饱合脂肪酸大于85％的白果油脂，不仅提取率高，而且品质好。表3是超微白果粉和普通白果粉超临界萃取的白果油收率对比。

表3粒度对超临界萃取白果油脂收率的比较

表3表明：采用低温气流粉碎白果成超微粉，对泰兴大佛指，扁佛指，七星果，龙眼等七个不同品种的白果进行超临界萃取，萃取压力10-30MPa，萃取温度25-50℃，萃取时间1-4h，CO₂流量10-30L/h，优选超临界萃取温度40℃、压力20MPa、流速15L/h、时间3h，石油醚作为夹带剂，不同品种的白果油脂收率提高明显提高，相对于普通白果粉超临界萃取的白果油收率提高20％-35％。

超临界萃取白果超微粉，不仅白果油收率提高，而且品质好，尤其是不饱和脂肪酸含量提高到85％以上，其中9，12-C_18:2亚油酸占31.876％，8-C_18:1油酸占20.360％；9-C_18:1油酸占19.345％。因此，不同的提取方式对白果油脂提取率和化学成分的影响明显。

白果中的蛋白质会因其生长环境、条件、品种的不同，表现出含量的差异。本发明公开湖北、广西和江苏不同产地6个品种蛋白质的含量，如表4。

表4.不同产地不同品种白果蛋白质的含量

蛋白质在不同溶剂中按其溶解度可分为水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白和难溶性蛋白。本发明选择不同极性的溶剂依次提取，采用凯式定氮法分析江苏、湖北和广西不同产地不同品种白果蛋白质含量差异，采用酸水解和HPLC研究白果粉及其盐溶蛋白部位中氨基酸组成的变化。结果表明：不同产地不同品种白果蛋白质占干基含量在7.86％-11.88％，相对湿度在56.01％-60.01％；白果中水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白相对含量分别为18％-25％、15％-20％、1％-2％、28％-35％和20％-25％；盐溶蛋白提取单因素工艺为提取时间10-60min，固液比1∶3-1∶20，提取次数3-5次，盐溶蛋白提取率可达95％以上。

本专利对比了热回流提取与超声波提取CO₂超临界萃取脱脂后的白果超微粉，热回流提取采用pH 8.5、0.15mol/L的Tris-HCl溶液作为提取液，料液比1∶20，提取时间4h，所得白果蛋白质提取率可达到75.01％。本发明公开的超声波提取工艺，采用超声波低温提取CO₂超临界萃取剩下的白果超微粉，选用0.15-0.30mol/L NaCl盐溶液为提取剂，白果超微粉与提取剂比例为1∶4-1∶20(g/ml)，提取时间10-60min，提取次数2-6次。最佳工艺提取时间、料液比、提取次数分别为30min、1∶7、3次，蛋白质的提取率大于95％。因此本发明超声波提取白果蛋白质，比传统的热回流提取率高于20％-30％。

本专利采用质量浓度为10％-15％单宁酸、质量浓度为10％-15％的TCA、(NH4)₂SO₄(APS)、乙醇和丙酮等任一种溶剂或几种混合溶剂加入到超声波低温提取液中，盐溶液与提取液的体积比为1∶3-5，沉淀离心，分离白果蛋白，优选质量浓度为10％-15％单宁酸和APS，蛋白质的回收率高于85％。如表5。

表5.不同试剂对白果蛋白质的析出作用

将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，固液比(g/ml)为1∶10-1∶50，再采用分子量15KD-25KD的聚醚砜膜的超滤离心浓缩管分离，离心力12000g-15000g，优选14000g，离心时间10-50min，优选20-30min，得到白果蛋白的浓缩液。

本专利对比不同方法纯化白果蛋白，如表6。采用DEAE-cellulose和Sephadex G50柱色谱依次吸附白果蛋白的浓缩液，对蛋白质有很好的选择性吸附，再采用pH＝8.0的0.1-1mol/L不同浓度的NaCl溶液洗脱，优选0.1mol/L，0.2mol/L，0.3mol/L，得到高浓蛋白质样品，将色谱柱分离得到的高浓白蛋液采用-10℃-35℃冷冻干燥，时间15-48h，优选-30℃，时间30h，制备一种白果高浓蛋白超微粉，其中含水量＜5％，总蛋白大于90％，分子量分布在17KD-20KD，粒径为1-25μm，破壁率大于98％。

表6不同树脂选择性吸附白果蛋白

本发明制备一种白果高浓蛋白超微粉，不仅总蛋白大于90％，而且总蛋白中氨基酸的组成比未脱脂的白果原粉中含量明显提高，赖氨酸(Lys)从1.25％提高至4.53％，丝氨酸(Ser)从1.83％提高至10.55％，组氨酸(His)从10.34％提高至44.24％，说明DEAE-cellulose-52树脂和Sephadex G50纯化蛋白质的选择性好，如表7。

表7.白果高浓蛋白超微粉中氨基酸组成分析

本发明获得如下技术效果：

1.本发明通过对新鲜白果进行冷冻干燥和破碎预处理，采用低温气流粉碎成超微粉，整个工艺过程处于低温，代替传统的太阳爆晒或热烘干方法，由于高温引起化学成分的代谢变化，因此，本专利采用冷冻干燥的方法，将含水量在50％-65％新鲜白果脱壳后在-10℃至-50℃冷冻干燥，含水量＜6％，易于保存且保持了白果的原质和原风味。冷冻干燥后的白果经机械剥壳和去除囊衣、胚芽后，再经普通的破碎机干法粉碎，温度低于30℃，过筛，制备粒度在1目-50目未脱脂的白果粗粉，且保持了白果蛋白质的活性组分未变性。

2.本发明采用CO₂超临界萃取低温气流粉碎的不同品种的白果超微粉，制备的白果油收率明显提高，相对于普通白果粉超临界萃取的白果油收率提高20％-35％。本发明超临界萃取白果超微粉，不仅白果油收率提高，而且品质好，能全面的将油脂等脂溶物萃取出来，避免其它方法萃取存在白果油、氰氢酸、白果酸、白果酚等白果毒素残留和白果粉蚝败变质等问题，尤其是白果油中不饱合脂肪酸提高到90％以上，其中9，12-C_18:2亚油酸占31.876％，8-C_18:1油酸占20.360％；9-C_18:1油酸占19.345％。

3.本发明超声波提取白果蛋白质，比传统的热回流提取率高于20％-30％；采用超滤膜、cellulose树脂和Sephadex G50，总蛋白大于90％，并且首次分离的蛋白质分子量分布在17KD-20KD，粒径为1-25μm，破壁率大于98％。总蛋白中氨基酸的组成比白果原粉中含量明显提高，赖氨酸(Lys)从1.25％提高至4.53％，丝氨酸(Ser)从1.83％提高至10.55％，组氨酸(His)从10.34％提高至44.24％。

四、附图说明

图1为冷冻干燥颗粒白果粉末的形状；

图2为喷雾干燥颗粒白果粉末的形状；

图3为超临界萃取超微白果粉的白果油气质图谱；

图4为白果超微细粉果颗粒粒度分布曲线；

图5为白果蛋白cellulose-52和Sephadex G50洗脱曲线

图6不同试剂沉淀蛋白的电泳

图7白果蛋白质的电泳分子量分布，图中符号说明：其中，1-标准分子量marker；2-SephadexG50洗脱峰值3-同2；4-同1

具体实施方式

以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

实施例1

一种白果蛋白超微粉的制备方法，由以下步骤组成：

第一步，低温干燥：将秋季新鲜收集的白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，例如温度选取为-20℃，-30℃，-40℃，再除去外壳和内衣，将果仁粉碎，红外线快速测定，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉，

第二步，低温破壁：在温度低于10℃下，例如选取为-3℃，-5℃，-15℃，0℃，2℃，5℃，8℃，9℃，将所述白果粗粉采用喷式低温气流粉碎机(市场可购得，浙江丰利设备有限公司DFJ-15型)破壁粉碎得到白果超微粉，气流粉碎机分级轮频率20-60Hz，例如选取为30Hz，40Hz，50Hz，空气压力0.8-1.5MPa，例如选取为0.9MPa，1.0MPa，1.2MPa，1.4MPa，加料速度为1kg/h-3kg/h，例如选取为1.5kg/h，2kg/h，2.5kg/h，粉碎时间5-50min，例如选取为8min，10min，20min，30min，40min，

第三步，低温去脂：将白果超微粉采用CO₂超临界萃取，萃取压力10-30MPa，例如选取为15MPa，20MPa，25MPa，萃取温度25-50℃，例如选取为30℃，40℃，45℃，萃取时间1-4h，例如选取为2h，3h，3.5h，CO₂流量10-30L/h，例如选取为15L/h，20L/h，25L/h，采用质量浓度为1％-15％石油醚作为夹带剂，例如质量浓度选取为8％，12％，

第四步，低温盐溶解和盐析：采用超声波在温度低于10℃下提取所述CO₂超临界萃取剩下的白果超微粉，例如选取为-3℃，-5℃，-15℃，0℃，2℃，5℃，8℃，9℃，提取剂为0.15-0.30mol/L NaCl盐溶液，例如为0.20mol/L，所述白果超微粉与提取剂比例为1∶4-1∶20(g/ml)，例如选取为1∶5，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶18，提取时间10-60min，提取时间例如可以选取为15min，20min，35min，45min，55min，提取次数2-6次，例如可以提取3次，5次，

第五步，盐析：采用质量浓度为10％-15％单宁酸、质量浓度为10％-15％的三氯乙酸(TCA)、(NH4)₂SO₄(APS)、乙醇和丙酮等任一种溶剂或几种混合溶剂加入到超声波低温提取液中，盐溶液与提取液的体积比为1∶3-5，例如选取为1∶3，1∶4，1∶5，沉淀离心，分离得到白果蛋白，

第六步，膜分离：将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，采用分子量15KD-25KD的超滤离心浓缩管分离，超滤膜为聚醚砜，离心力12000g-15000g，例如14000g，离心时间10-50min，例如选取为20min，30min，40min，得到白果蛋白的浓缩液，

第七步，色谱柱分离：采用二乙氨基乙基纤维素(DEAE-cellulose)和葡聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱色谱依次分离白果蛋白的浓缩液，洗脱剂采用pH＝8.0的0.1-1mol/L不同浓度的NaCl溶液，浓度可以选取为0.2mol/L，0.4mol/L，0.7mol/L，0.9mol/L，

第八步，冷冻干燥：将色谱柱分离得到的高浓白蛋液采用-10℃至-50℃冷冻干燥15-48h，冷冻干燥温度可以选取为：-20℃，-30℃，-40℃，干燥时间可以选取为35小时，28小时，10小时，再低温气流破壁(条件与第二步低温破壁相同)，使其粒度在1-25μm，是平均粒度，例如为15微米，20微米。

上述技术方案中，所述白果品种为泰兴龙眼、随州圆型果、泰兴大佛指、灵川梅型果、兴安长柄果、灵川马玲果中的一种。第二步低温破壁的温度为0-10℃。超声波提取的温度为0-10℃。所述超临界萃取温度优选为40℃、压力为20MPa、流速为15L/h、时间为3h。第五步所述溶剂为(NH4)₂SO₄或质量浓度为10％-15％的单宁酸。

实施例2

一种白果蛋白超微粉的制备方法，以下步骤组成：

(1)低温干燥：将每年秋季新鲜收集的白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，冷冻时间6-50小时，用机械辊筒压壳破碎，除去外壳和内衣，果仁粉碎成白果粗粉，含水量＜6％，粒度在10目-50目，

(2)低温破壁：将低温干燥的白果粗粉采用喷式低温气流粉碎机破壁粉碎，气流粉碎机分级轮频率20-60Hz，温度＜10℃，空气压力0.8-1.5MPa，加料速度为1kg/h-3kg/h，粉碎时间5-50min，白果超微粉的粒径为1-25μm，破壁率大于98％。

(3)低温去脂：将低温破壁的白果超微粉采用CO₂超临界萃取，萃取压力10-30MPa，萃取温度25-50℃，萃取时间1-4h，CO₂流量10-30L/h，1％-15％石油醚作为夹带剂，制备白果油脂中不饱合脂肪酸＞85％.

(4)低温盐溶解和盐析：采用超声波低温提取CO₂超临界萃取剩下的白果超微粉，选用0.15-0.30mol/L NaCl盐溶液为提取剂，白果超微粉与提取剂比例为1∶4-1∶20(g/ml)，提取时间10-60min，提取次数2-6次。

(5)盐析：采用10％-15％单宁酸、10％-15％TCA、(NH4)₂SO₄(APS)、乙醇和丙酮等任一种溶剂或几种混合溶剂加入到超声波低温提取液中，盐溶液与提取液的体积比为1∶3-5，，沉淀离心，分离白果蛋白。

(6)膜分离：将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，采用分子量15KD-25KD的超滤离心浓缩管分离，超滤膜为聚醚砜，离心力12000g-15000g，离心时间10-50min，得到白果蛋白的浓缩液。

(7)色谱柱分离：采用DEAE-cellulose和Sephadex G50柱色谱依次分离白果蛋白的浓缩液，洗脱剂采用pH＝8.0的0.1-1mol/L不同浓度的NaCl溶液。

(8)冷冻干燥：将色谱柱分离得到的高浓白蛋液采用-10℃至-50℃冷冻干燥，时间15-48h，含水量＜5％，再破碎粒度在1-25μm。

本实施例中，所述的白果高浓蛋白超微粉，总蛋白大于90％，蛋白质分子量17KD-20KD，粒径为1-25μm，破壁率大于98％。所述的白果，白果品种为泰兴龙眼、随州圆型果、泰兴大佛指、灵川梅型果、兴安长柄果、灵川马玲果。本实施例中，第二步低温破壁的温度优选为0-10℃。本实施例中，超声波提取的温度优选为0-10℃。

实施例3白果超微粉的制备

收集江苏泰兴大佛指，扁佛指，七星果，龙眼等七个品种的白果，去壳，红外快速测定水分，含水量在50％-65％新鲜白果放入-40℃冰柜中冷冻38h，红外快速测定水分，得到含水量＜6％的干燥白果，用粉碎机将果仁粉碎成白果粗粉，过筛，选择粒度在10目-50目的白果粉。再用气流粉碎机粉碎，粉碎温度＜10℃，空气压力0.8-1.0MPa，加料速度为1kg/h，制备七个品种的白果超微粉，粒径为1-25μm，破壁率大于95％。白果超微细粉果颗粒粒度分布曲线如图2。

实施例4白果油的制备

称量白果超微粉100g，放入1L超临界萃取罐中，选取温度为40、45和50℃，压力为20、25和30MPa，流速为15、20和25L/h，时间为2h、3h和4h，在不同温度、压力、流速和时间等工艺条件下进行超临界萃取正交试验。每隔半小时取一次样，实验结束后收集样品并用石油醚洗涤，抽滤除杂质，真空浓缩除去石油醚即得白果油，称量并计算油含量。结果表明萃取压力10-30MPa，萃取温度25-50℃，萃取时间1-4h，CO₂流量10-30L/h，优选超临界萃取温度40℃、压力20MPa、流速15L/h、时间3h，石油醚作为夹带剂，东台果油的收率9.36％，泰兴大佛指油收率9.2％，扁佛指油收率9.12％，七星果油收率6.3％，龙眼油收率5.8％，马铃油收率7.6％。本实施例相对于普通白果粉超临界萃取的白果油收率提高20％-35％。

不同品种的白果油具有以下物理特征：

折光指数(n⁴⁰)：1.460～1.468；相对密度(d)：0.922～0.929；碘值(I)(g/100g)：95～115；皂化值(KOH)(mg/g)：187～196；不皂化物(g/kg)：≤15。色泽(罗维朋比色槽133.4mm)≤黄70红4.0；水分及挥发物/(％)≤0.2；不溶性杂质/(％)≤0.2；酸值(KOH)/(mg/g)≤4.0；加热试验(280℃)。

本实施例制备的白果油进行甲酯化：取0.5ml的白果油加入0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液4ml，置于60℃水浴上皂化30min(油珠完全消失)，冷却后加入150g/ml三氟化硼甲醇溶液2ml于60℃水浴上酯化5min，冷却后加入正己烷和饱和氯化钠水溶液2ml，取上清液供GC-MS分析。

GC-MS分析条件：HP-5弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气：高纯氦，流量：1.2mL/min，气化室温度：280℃，毛细管柱程序升温：80℃开始以每分钟4℃升至290℃，恒温30min。质谱条件是：质谱离子源：EI源，电离能：70eV，离子源温度：230℃。

白果油中不饱和脂肪酸总量可达到83.209％，其中9，12-C_18:2亚油酸甲酯占29.876％，8-C_18:1油酸甲酯占17.360％；9-C_18:1油酸甲酯占18.345％，如表8。超临界萃取超微白果粉的白果油气质图谱如图3。

表8超临界萃取白果超微粉的化学组成

实施例5超声波提取超微脱脂白果粉

准确称取20g白果粉，先后采用水、0.1-0.2mol/L NaCl盐溶液、60％-80％醇溶液及0.2％-0.3％NaOH溶液，以料液比1∶3-1∶10进行两次提取，每次提取超声20-40min，提取液离心取上清，合并上清液，取2ml进行蛋白质含量测定，白果中不同提取部位蛋白质的含量比例如表9。采用超声波提取，选择提取时间(5min，10min，15min，20min，25min，and30min)、提取溶剂0.15mol/L NaCl溶液；料液比(1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7；1∶8，1∶9和1∶10)，提取次数(1，2和3次)，提取液在10,000rpm下离心取上清，进行蛋白质含量测定，确定了盐提蛋白质的最佳提取时间、料液比、提取次数分别为30min、1∶7、3次，白果蛋白质的提取率大于95％。

表9白果中不同提取部位蛋白质的相对含量

实施例6热回流提取超微脱脂白果粉

1蛋白质提取率单因素试验

1.1提取液浓度对提取率的影响

分别取Tris-HCl浓度0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L，以pH 8.0，料液比1∶10，4℃恒温下提取4h，适当搅拌。3000r/min离心10min，取上清液测定蛋白质含量。

1.2提取液pH值对提取率的影响

配制pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl(0.2mol/L)，以1∶10的料液比，在4℃恒温下提取白果蛋白质，提取时间为4h，适当搅拌。3000r/min离心10min，取上清液测定蛋白质含量。

1.3料液比对提取率的影响

分别采用料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以pH 8.0，0.2mol/L Tris-HCl，4℃恒温下提取4h提取白果蛋白质，适当搅拌。3000r/min离心10min，取上清液测定蛋白质含量。

1.4提取时间对提取率的影响

提取时间分别取2、4、6、8、10h，以Tris-HCl溶液浓度0.2mol/L，pH 8.0，料液比1∶10，4℃恒温下提取4h，适当搅拌。3000r/min离心10min，取上清液测定蛋白质含量。

2蛋白质提取率正交实验设计

根据单因素试验结果，选择提取液浓度、提取液pH值、料液比、提取时间进行四因素四水平L₁₆(4⁵)正交试验设计。

3.蛋白质测定方法

蛋白质含量采用Bradford的考马斯亮蓝G-250法测定。

4数据分析

采用Excel 2003进行回归和相关分析，用DPS统计软件进行方差分析。结果以平均值±标准误表示。

5.热回流提取蛋白质正交实验结果如表10。

表10热回流提取蛋白质正交实验

选取料液比(A)、提取时间(B)提取液浓度(C)、提取液pH(D)四个因素，以白果蛋白质的提取率为指标，优化出白果蛋白质的最佳提取条件，从试验结果(见表11)可以得出：影响白果蛋白质子蛋白质提取率的因素显著(R值)次序为：A＞C＞D＞B，即料液比对白果蛋白质的提取率影响最大。

表11方差分析

表11表明，各因素对白果蛋白质提取率作用大小依次为：料液比＞提取液浓度＞提取液pH＞提取时间。Tris-HCl溶液提取白果蛋白的最佳工艺为：pH为8.5，0.15mol/L Tris-HCl溶液，料液比1∶20，提取时间4h，白果蛋白质的提取率达到90.9％。

实施例7超微脱脂高浓白果蛋白粉制备

1.取300g超临界脱脂的白果粉，加入0.14mol/LNaCl溶液，料液比1∶5常温搅拌提取3次，提取液在-35℃冷冻干燥35h，得到粗提物干粉45g。

2.称取粗提物20g，以料液比1∶10的比例与70％硫酸铵溶液混合，搅拌使其尽可能溶解，并静置24h，离心取沉淀，上清加入硫酸铵至饱和，搅拌后静置24h，离心，合并两次沉淀，将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，采用分子量25KD的超滤离心浓缩管分离，超滤膜为聚醚砜，离心力12000g-13000g，离心时间10-30min，得到白果蛋白的浓缩液。透过液通过10KD的超滤离心膜管组件，收集截留液，在-25℃冷冻干燥25h，将截留液浓缩至原体积四分之一。

3.称取20ml浓缩后的截留液，与80ml pH＝8的缓冲液混合，离心取上清液。再经DEAE-cellulose-52树脂柱，pH8的磷酸缓冲溶液淋洗，0.1-0.3mol/LNaCl溶液步进洗脱，280nm紫外检测，收集峰值区域洗脱液，然后再经过Sephadex G50柱，采用蒸馏水洗脱，平衡，除盐(如图4)。收集峰值区域洗脱液，纯化后的蛋白质溶液，利用标准曲线方程测得其浓度为0.345mg/ml，在-45℃冷冻干燥20h，干燥得到纯化蛋白质1.3g。纯化后的蛋白质纯度达到90.77％。经电泳分析，得到蛋白质分子量17KD-20KD 3-4个蛋白条带(如图5)。纯化后的蛋白质再破碎成粒度在1-25μm的超微高浓蛋白粉，破壁率大于98％，含水量＜5％。

实施例8超微脱脂高浓白果蛋白粉制备

1.取300g超临界脱脂的白果粉，加入0.20mol/LNaCl溶液，料液比1∶10常温搅拌提取3次，提取液在-45℃冷冻干燥30h，得到粗提物干粉45g。

2.称取粗提物20g，以料液比1∶8的比例与10％-15％TCA溶液混合，搅拌使其尽可能溶解，并静置30h，离心取沉淀，上清加入10％-15％TCA至饱和，搅拌后静置24h，离心，合并两次沉淀，加水充分溶解，离心收集上清液。上清液通过30KD的超滤离心膜管组件，收集透过液，透过液通过10KD的超滤离心膜管组件，收集截留液，在-30℃冷冻干燥25h，将截留液浓缩至原体积四分之一。

3.称取20ml浓缩后的截留液，与80ml pH＝8的缓冲液混合，离心取上清液。再经DEAE-cellulose-52树脂柱，pH8的磷酸缓冲溶液淋洗，0.1-0.3mol/LNaCl溶液步进洗脱，280nm紫外检测，收集峰值区域洗脱液，然后再经过Sephadex G50柱，采用蒸馏水洗脱，平衡，除盐(如图4)。收集峰值区域洗脱液，纯化后的蛋白质溶液，利用标准曲线方程测得其浓度为0.345mg/ml，在-45℃冷冻干燥20h，干燥得到纯化蛋白质1.5g，纯化后的蛋白质纯度达到92.4％。经电泳分析，得到蛋白质分子量17KD-20KD 3-4个昼白条带(如图5)。纯化后的蛋白质再破碎成粒度在1-25μm的超微高浓蛋白粉，破壁率大于98％，含水量＜5％。

实施例9超微脱脂高浓白果蛋白粉制备

1.取300g超临界脱脂的白果粉，加入0.25mol/LNaCl溶液，料液比1∶15常温搅拌提取3次，提取液在-45℃冷冻干燥30h，得到粗提物干粉42g。

2.称取粗提物20g，以料液比1∶6的比例与10％-15％单宁酸溶液混合，搅拌使其尽可能溶解，并静置40h，离心取沉淀，上清加入10％-15％单宁酸至饱和，搅拌后静置24h，离心，合并两次沉淀，加水充分溶解，离心收集上清液。上清液通过30KD的超滤离心膜管组件，收集透过液，透过液通过10KD的超滤离心膜管组件，收集截留液，在-40℃冷冻干燥25h，将截留液浓缩至原体积四分之一。

3.称取20ml浓缩后的截留液，与80ml pH＝8的缓冲液混合，离心取上清液。再经DEAE-cellulose-52树脂柱，pH8的磷酸缓冲溶液淋洗，0.1-0.3mol/LNaCl溶液步进洗脱，280nm紫外检测，收集峰值区域洗脱液，然后再经过Sephadex G50柱，采用蒸馏水洗脱，平衡，除盐(如图4)。收集峰值区域洗脱液，纯化后的蛋白质溶液，利用标准曲线方程测得其浓度为0.345mg/ml，在-45℃冷冻干燥25h，干燥得到纯化蛋白质1.2g。纯化后的蛋白质纯度达到94.1％。经电泳分析，得到蛋白质分子量17KD-20KD 3-4个蛋白条带(如图5)。纯化后的蛋白质再破碎成粒度在1-25μm的超微高浓蛋白粉，破壁率大于98％，含水量＜5％。

Claims

1.一种白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

第一步，低温干燥：将秋季收集的新鲜白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，再除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉，

第四步，低温盐溶解和盐析：采用超声波在温度低于10℃下提取所述CO₂超临界萃取剩下的白果超微粉，提取剂为0.15-0.30mol/L NaCl盐溶液，所述白果超微粉与提取剂比例以g/ml作为单位为1：4-1：20，提取时间10-60min，提取次数2-6次，

第五步，盐析：将(NH4)₂SO₄溶液加入到超声波低温提取液中，盐溶液与提取液的体积比为：1：3-5，沉淀离心，分离得到白果蛋白，

第七步，色谱柱分离：采用二乙氨基乙基纤维素和葡聚糖凝胶G50柱色谱依次分离白果蛋白的浓缩液，所述二乙氨基乙基纤维素色谱柱的洗脱剂采用0.1-1mol/L NaCl溶液梯度洗脱，所述葡聚糖凝胶G50色谱柱洗脱剂采用蒸馏水，

第八步，冷冻干燥：将色谱柱分离得到的高浓蛋白液采用-10℃至-50℃冷冻干燥15-48h，再低温气流破壁使其粒度在1-25μm。

2.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于白果品种为泰兴龙眼、随州圆型果、泰兴大佛指、灵川梅型果、兴安长柄果、灵川马玲果中的一种。

3.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于第二步低温破壁的温度为0-10℃。

4.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于超声波提取的温度为0-10℃。

5.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于第三步所述超临界萃取温度为40℃、压力为20MPa、流速为15L/h、时间为3h。