CN101524381A - 一种银杏花粉提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药及保健食品领域，公开了一种银杏花粉提取物及其制备方法和应用。该银杏花粉提取物是对银杏花粉进行CO₂超临界萃取得到的萃取物。该提取物能够改善记忆能力，可用于制备改善记忆能力的保健食品或药物。

Description

一种银杏花粉提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药及保健食品领域，涉及一种银杏花粉提取物及其制备方法和应用。

背景技术

银杏Ginkgo biloba L.为银杏目、银杏科(Ginkgoaceae)、银杏属植物，俗称白果树、公孙树、鸭脚树。在植物分类上属单属种植物，种群较小，仅一科一属一种，为我国原产，具有“活化石”之誉。银杏原产中国，雌雄异株，属裸子植物，没有果实，只有种子，银杏花粉富含人体所必需的氨基酸、多种不饱和脂肪酸、矿物元素及维生素E等，具有丰富的营养和广泛的药理作用，早在古代中国、希腊、埃及、波斯就把它作为健康和长寿食品。

传统的提取方法采用化学萃取法，该类方法要加入大量的化学试剂，其中包括大量的有机溶剂，即使加工成其它剂型，最终产品中仍难以避免某些化学试剂的残留，影响产品质量和保健医疗效果，另外，化学萃取法还会造成一定程度的环境污染，有损于实验人员的健康。

超临界流体萃取技术(Superitical Fluid Extraction，简称SFE)是20世纪兴起的一种提取、分离技术。上世纪50年代，美国的Todd和Elain首先在理论上提出了其可行性，直到70时年代才用于提取和分离。超临界流体兼有气、液两者的特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性能。如超临界CO₂的粘度是液态CO₂的百分之一，自扩散系数是液体的100倍。CO₂极性小，适于提取分子量小、亲脂性的挥发油、内酯、环氧化合物等物质，并且CO₂安全无毒，容易获得。超临界流体萃取技术就是利用超临界流体的这种特殊性质，在高压条件下将超临界流体与待分离的固体或液体混合物接触，调节系统的操作压力和温度，萃取出所需要的物质，随后通过降压或升温的方法，降低超临界流体的密度，使萃取物得到分离，该技术具有低温提取、保持有效成分的活性、没有溶剂残留和可进行选择性分离等特点，是利用超临界状态下CO₂的较好的溶剂特性，对挥发性较强的成分、热敏性物质和脂溶性成分的提取分离具有较好的效果，正受到越来越多的重视，新的研究、应用成果不断问世。

超临界提取的影响因素有SFE的流体比、CO₂流量、压力、时间、温度、粉碎粉粒度等，压力是SFE中最重要的参数。一定温度下，随着压力的增大，流体密度显著增加，溶质的溶解度增大，萃取效率提高。但过高的压力使生产成本明显提高，其萃取率增加有限。在SFE过程中，温度增加，加强了其扩散能力，使得被萃取物在超临界CO₂中溶解度增加，有利于萃取。但随着温度的增加，杂质的溶解度也增加，使精制过程复杂化，从而降低产品的收率。同时温度增加，CO₂流体的密度降低，使得对溶质的溶解力下降，降低产品收率。萃取时间增加，有利于超临界流体与溶质中有效成分的溶解平衡，增加萃取的时间就增加萃取得率。由于萃取一定时间后，随着溶质中有效成分的减少，再增加萃取时间，萃取得率增加缓慢，能耗增加。而且有些无效成分也更多地被萃取出来，直接影响产品的质量。

目前市场上还没有采用超临界萃取技术提取的银杏花粉提取物为主要成分用于改善记忆能力的产品。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题提供一种能改善记忆能力的银杏花粉提取物。

本发明另一个目的是提供上述银杏花粉提取物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述银杏花粉提取物在制备改善记忆能力的药物或保健品中的应用。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种银杏花粉提取物，该提取物是通过下列工艺提取得到的：

以银杏花粉为原料，采用CO₂为超临界介质，对银杏花粉进行超临界萃取，收集萃取物，得银杏花粉提取物。

所述的银杏花粉提取物，该提取物是通过下列工艺提取得到的：

银杏花粉加入粘结剂粘结成型，粉碎过20～40目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为18～35Mpa，萃取温度为35～65℃，CO₂的流速为10～30L/h，萃取0.5～25小时，收集萃取物，去除粘结剂得银杏花粉提取物。

所述的银杏花粉提取物，其中粘结剂为食用添加剂，优选为明胶和/或淀粉。

所述银杏花粉提取物的制备方法，包括下列步骤：

银杏花粉加入粘结剂粘结成型，粉碎过20～40目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为18～35Mpa，萃取温度为35～65℃，CO₂的流速为10～30L/h，萃取0.5～25小时，收集萃取物，去除粘结剂得银杏花粉提取物。

所述银杏花粉提取物的制备方法，其中粘结剂为食用添加剂，优选为明胶和/或淀粉。

所述的银杏花粉提取物在制备改善记忆能力的保健食品或药物中的应用。

人体推荐摄入量为本发明提取物1200mg/人/日(按实施例2制剂计算)。

本发明的有益效果：

本发明提供的提取物具有改善记忆能力的作用，可用于制备改善记忆能力的药物或保健食品。本发明提供的方法采用食用添加剂作粘结剂，解决了银杏花粉小而易造成系统堵塞的问题，并且由于采用CO₂超临界萃取，不存在化学萃取法会造成有机溶剂残留的弊端，食用安全无毒。

本发明提取物的药理效果：

以下实验采用本发明提取物按实施例2制备。

一、本发明提取物改善动物记忆作用的评价实验

1、材料与方法

1.1、受试样品：本发明提取物，按实施例2制备。

1.2、实验动物：昆明种小鼠，体重18～22g，由江苏省实验动物中心提供。合格证号：苏动(环)97001号和苏动(质)97001号。

1.3、剂量分组：根据本发明提取物的人体摄入量(1.2g/人/日，相当于20mg/kg.bw/日)，分别按其5倍、10倍、30倍设计三个剂量组及阴性对照组，即100mg/kg.bw、200mg/kg.bw、600mg/kg.bw及蒸馏水对照组，每日灌胃一次，连续30日。

1.4、数据分析：采用方差分析进行数据统计，计数资料用x²统计。

1.5、试验方法：

1.5.1、跳台试验：

昆明种雄性小鼠，体重18～22g，随机分为4组，每组10只。连续给样30日，末次给样后次日开始训练。将小鼠放入WJ型小鼠跳台自动控制仪内适应环境3分钟，然后立即通以36伏的交流电，训练8分钟，记录后5分钟的错误次数，以此作为学习成绩。24小时后重作测验，记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期以及3分钟内的错误总数，同时计算动物出现错误反应的频率。(每个剂量组小鼠训练与重测试均在先后两天相同时间内完成，测试环境为隔音、弱光的专用行为实验室，温度为25℃，湿度为54％)按上述步骤重复进行一次测试。

1.5.2、避暗试验

昆明种雄性小鼠，体重18～22g，随机分为4组，每组10只。连续给样30天，末次给样后次日开始训练。将小鼠面部背向WX-5型小鼠条件反射电刺明暗仪的洞口放入明室，并在其上方约20cm处悬一40w钨丝灯，同时启动计时器。记录小鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需要的时间。24小时后重作测验，记录每只小鼠进入暗室的潜伏期和5分钟内的电击次数，同时记录5分钟内进入暗室的小鼠数。(每个剂量组小鼠训练与重测试均在先后两天相同时间内完成，测试环境为隔音、弱光的专用行为实验室，温度为25℃，湿度为56％)按上述步骤重复进行一次测试。

2、结果：

2.1、试验中动物体重变化情况

由表1可见，小鼠试验30天，各组之间体重无统计学差异(p＞0.05)

表1试验中动物的体重

2.2、跳台试验结果

由表2、3结果可见，在跳台试验中，第一次试验本发明提取物组小鼠24小时后重测验时，中、高剂量组的潜伏期与对照组有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，低、中、高剂量组的错误次数与对照组有显著性差异(p＜0.01)；第二次试验本发明提取物组24小时后重测验时，低、中、高剂量组的潜伏期、错误次数、错误率与对照组有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，说明本发明提取物能改善小鼠的记忆能力。

表2本发明提取物对小鼠记忆的影响(跳台第一次)(x±s，n＝10)

注：^*与对照组比较，p＜0.05，^**与对照组比较，p＜0.01。

表3本发明提取物对小鼠记忆的影响(跳台第二次)(x±s，n＝10)

注：^*与对照组比较，p＜0.05，^**与对照组比较，p＜0.01。

2.3、避暗试验结果

由表4、5结果可见，在避暗试验中，第一次试验本发明提取物组小鼠训练时，低、中、高剂量组的错误次数与对照组有明显差异(p＜0.05或p＜0.01)，24小时后重测验时，低、中、高剂量组小鼠的潜伏期、中、高剂量组小鼠的错误次数、高剂量组小鼠的错误率与对照组有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)；第二次试验本发明提取物组小鼠训练时中、高剂量组的潜伏期、错误次数、错误率与对照组均有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，说明本发明提取物能改善小鼠的记忆能力。

表4本发明提取物对小鼠记忆的影响(避暗第一次)(x±s，n＝10)

注：^*与对照组比较，p＜0.05，^**与对照组比较，p＜0.01。

表5本发明提取物对小鼠记忆的影响(避暗第二次)(x±s，n＝10)

注：^*与对照组比较，p＜0.05，^**与对照组比较，p＜0.01。

3、结论

本发明提取物以100mg/kg.bw、200mg/kg.bw、600mg/kg.bw的剂量进行了改善小鼠记忆作用的评价实验，跳台试验及避暗试验均表明具有改善小鼠记忆的效应，重复进行一次试验，其结果基本一致，因此认为本发明提取物具有改善小鼠记忆的作用。

二、本发明提取物改善记忆(人体试食)试验报告

1、材料和方法

1.1、样品：本发明提取物，按实施例2制备。

1.2、剂量选择：本品推荐服用量为每日3次，每次2粒，每粒含本发明提取物0.2g。

1.3、试验方法：按照卫生部1996年颁布的“保健食品功能学评价程序和检验方法”中改善记忆作用的人体试食试验规程进行，采用韦氏记忆量表按测试要求测定受试学生的记忆商数。

1.4、测试量表：采用湖南医科大学心理学教研室1989年修订的“韦氏记忆量表”修订本。该量表除沿用了原有的经历、定向、数字顺序、视觉再生、联想学习、理解记忆、顺背和倒背数字7个分测验外，还增加了视觉再认、图片回忆、触摸测验3个分测验。修订本适用于7岁以上儿童、少年和成人。

1.5、人体试食试验

本试验与南京医科大学协作，在南京市大厂区某小学进行。实验期间不改变学生原来的膳食及活动。

在取得学校、家长、学生同意和密切配合的前提下，以自愿原则，选择四、五年级10～12岁健康学生为试验对象。选择72名学生，其中男生35人，女生37人。按班级随机分成实验组和对照组，实验组36人(男生20人，女生16人)，对照组36人(男生21人，女生15人)。完成全试验过程的学生共62人(男生27人，女生35人)，其中实验组31人(男生17人，女生14人)，对照组31人(男生18人，女生13人)。实验依从率86.1％。

实验为期50天。前5天为试验的适应期，在此期间，实验组与对照组学生均服用与本发明提取物送检样品外观相似、不含功效成分的普通淀粉胶囊作为安慰剂。每日上、下午各服用一次，每次3粒，温开水送服，由专人负责分送并记录。自第6日起，实验组学生服用本发明提取物胶囊，对照组学生服用淀粉胶囊，服用方法与适应期相同。

在试验开始前和结束时，采用韦氏记忆量表按测试要求测定受试学生的记忆商数。

1.6、测试条件：主试者受过训练，受试者自学自愿。测试环境安静，光线充足，按照“修订韦氏记忆量表”手册顺序逐项单独进行测试。

1.7、测试内容：依照“修订韦氏记忆量表”，测试项目为：经历+定、数字顺序、图片回忆、视觉再认、视觉再生、联想学习、触摸测验、理解记忆、顺背和倒背数字。

1.8、数据处理：将测试的各项分量表记分(原始分)换算成量表分，用配对计量资料比较的t检验和两样本均数的t检验进行统计处理，比较实验组和对照组之间各项分量表分和总量表分及记忆商数的差异性。

2、结果

2.1受试学生的健康检查

试食前，对所有志愿参加试验的学生进行健康检查，检查项目为身高、体重和血红蛋白；试食后，对完成试验的学生进行血红蛋白测定。

表6为试食前受试者体检结果。与对照组相比，实验组学生的身高、体重和血红蛋白无显著性差异(p＞0.05)。

表6试食前受试者体检结果

1：x±SD；n：受试学生人数

表7为试食前后受试者血红蛋白测定结果。与对照组相比，实验组学生试食前后血红蛋白无显著性差异(p＞0.05)。

表7试食前后受试者血红蛋白(g/L)测定结果

1：x±SD；n：受试学生人数

2.2、试食前后实验组与对照组各项测验量表分的比较

2.2.1试食前实验组与对照组各项测验量表分比较

表8为试食前实验组与对照组各项测验量表分结果。与对照组比较，试食前实验组各项测验量表分均无显著性差异(p＞0.05)。

表8试食前各项测验量表分结果

1：x±SD；n：受试学生人数

2.2.2试食后实验组与对照组各项测验量表分比较

表9为试食后实验组与对照组各项测验量表分比较。试食后，实验组除经历+定向、图片回忆外，其余各项测验量表分均高于对照组。经统计学检验，与对照组比较，视觉再认、视觉再生、触摸测验三项量表分有显著性差异(p＜0.05)；其余均无显著性差异(p＞0.05)。

表9试食后各项测验量表分结果

1：x±SD；n：受试学生人数

2.2.3实验组试食前后各项测验量表分比较

表10为实验组试食前后各项测验量表分结果。与试食前比较，试食后受试学生的视觉再认、视觉再生两项测验量表分有高度显著性差异(p＜0.01)；数字顺序、触摸测验、背数三项测验量表分有显著性差异(p＜0.05)；经历+定向、图片回忆、联想学习、理解记忆等四项测验量表分无显著性差异(p＞0.05)。

表10实验组试食前后各项测验量表分结果

注：¹x±SD；n：受试学生人数；²td为实验组试食前后配对比较的t值。

2.2.4对照组试食前后各项测验量表分比较

表11为对照组试食前后各项测验量表分结果。与试验前后比较，试食后对照组学生除图片回忆、联想学习外，其余各项测验量表分均有所增加，但仅有数字顺序(p＜0.05)、理解记忆(p＜0.01)测验量表分有统计学显著性差异；其余各项测验量表分均无显著性差异(p＞0.05)。

表11对照组试食前后各项测验量表分结果

注：¹x±SD；n：受试学生人数；²td为实验组试食前后配对比较的t值。

2.3试食前后实验组与对照组各项测验量表分差值比较

表12为试食前后实验组与对照组各项测验量表分差值结果。与对照组比较，试食后实验组的视觉再认测验量表分差值有统计学显著性差异(p＜0.01)；其余各项测验量表分差值均无显著性差异(p＞0.05)。

表12试食前后各项测验量表分差值结果

注：¹d±SD；n：受试学生人数

2.4试食前后实验组与对照组总量表分比较

表13为试食前后实验组与对照组总量表分结果。与试食前比较，试食后实验组记忆总量表分显著增加，有统计学显著性差异。与对照组比较，试食前实验组的记忆总量表分无显著性差异(p＞0.05)；试食后实验组的记忆总量表分有显著性差异(p＜0.05)；实验组的试食前后差值有统计学显著性差异(p＜0.05)。

表13试食前后记忆总量表分结果

注：¹x±SD；²d±SD；³试食前后比较

2.5本发明提取物对受试学生长时记忆、短时记忆的影响

2.5.1对受试学生长时记忆的作用

长时记忆测验包括经历+定向和数字顺序二项测验。表14为本发明提取物对受试学生长时记忆的作用。与试食前比较，试食后实验组的长时记忆量表分显著增加(p＜0.05)。与对照组比较，试食前后实验组的长时记忆均没有显著性差异(p＞0.05)。

表14本发明提取物对受试学生长时记忆的作用

注：¹x±SD；²d±SD；³试食前后比较

2.5.2本发明提取物对受试学生短时记忆的作用

短时记忆包括视觉再认、图片回忆、视觉再生、联想学习、触摸测验、理解记忆六项。表15为本发明提取物对受试学生短时记忆的作用。与试食前相比，试食后实验组的短时记忆量表分有显著性增加(p＜0.01)；对照组的量表分无显著性差异(p＞0.05)。与对照组比较，试食前后实验组短时记忆量表分及其差值短时记忆量表分均没有显著性差异(p＞0.05)。表明本发明提取物对受试学生短时记忆有一定的促进作用。

表15本发明提取物对受试学生短时记忆的作用

注：¹x±SD；²d±SD；³试食前后比较

2.6本发明提取物对受试学生改善记忆商的作用

表16为本发明提取物对受试学生改善记忆商的作用。与试食前比较，实验组试食后记忆商数显著增加(p＜0.01)；与对照组比较，试食前实验组的记忆商数没有显著性差异(p＞0.05)；试食后实验组的记忆商数及其差值有显著性差异(p＜0.05)。表明本发明提取物对受试学生改善记忆商数有促进作用。

表16本发明提取物对受试学生改善记忆商的作用

注：¹x±SD；²d±SD；³试食前后比较

3、结论

实验结果表明，受试学生食品用本发明提取物45天后，与对照组比较，试食后实验组各项测验量表分均增加，经统计学检验，实验组的视觉再认、视觉再生、触摸测验三项测验量表分增加值有显著性差异；试食后实验组的总量表分及其试食前后的总量表分增加值有显著性差异；试食后实验组受试学生记忆商数改善程序显著高于对照组。与试食前比较，试食后实验组的视觉再认、视觉再生、数字顺序、触摸测验和背数的量表分及总量表分及其试食前后总量表分差值显著性增加；试食后实验组的长时记忆、短时记忆和记忆商数均有显著提高。根据“保健食品功能学评价程序和检验方法”判定标准，本发明提取物对受试学生有改善记忆的作用。

三、本发明提取物毒性试验

1、急性毒性试验：选用昆明种小鼠20只，雌雄各10只，体重20～23g。按GB15193.3-94《食品安全性毒理学评价程序和方法》中规定急性毒性试验方法进行，剂量为15000mg/kg，试验前动物禁食16小时后灌胃，连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。观察期间，小鼠饮食和活动正常，生长良好，未见明显异常，无死亡。故本发明提取物的急性经口LD₅₀雌雄小鼠均＞15000mg/kg，属无毒类。

2、遗传毒性试验：按GB15193.3-94《食品安全性毒理学评价程序和方法》中规定的方法进行Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸变试验结果均为阴性，说明本发明提取物无明显诱变作用。

3、30天喂养试验：SD大鼠设低、中、高剂量组(按本发明提取物分别为250、1000、4000mg/kg.bw)及空白对照组，连续饲养30d，试验动物一般情况良好、体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变。血常规及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围，脏器病理组织学检查均未见与样品有关的病理改变。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

银杏花粉(破壁率＞90％)加入明胶粘结成型，干燥，粉碎过30目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为20Mpa，萃取温度为40℃，CO₂的流速为15L/h，萃取8小时，收集萃取物，去除明胶得银杏花粉提取物。

实施例2

银杏花粉(破壁率＞99％)加入明胶粘结成型，干燥，粉碎过40目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为30Mpa，萃取温度为50℃，CO₂的流速为20L/h，萃取5小时，收集萃取物，去除明胶得银杏花粉提取物。

实施例3

银杏花粉(破壁率＞95％)加入明胶粘结成型，干燥，粉碎过30目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为25Mpa，萃取温度为35℃，CO₂的流速为30L/h，萃取10小时，收集萃取物，去除明胶得银杏花粉提取物。

实施例4

银杏花粉(破壁率＞98％)加入水和淀粉粘结成型，干燥，粉碎过40目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为18Mpa，萃取温度为65℃，CO₂的流速为30L/h，萃取15小时，收集萃取物，去除淀粉得银杏花粉提取物。

实施例5

银杏花粉(破壁率＞96％)加入水、明胶和淀粉粘结成型，干燥，粉碎过30目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为35Mpa，萃取温度为45℃，CO₂的流速为10L/h，萃取20小时，收集萃取物，去除明胶和淀粉得银杏花粉提取物。

Claims (6)

1、一种银杏花粉提取物，其特征在于该提取物是通过下列工艺提取得到的：

以银杏花粉为原料，采用CO₂为超临界介质，对银杏花粉进行超临界萃取，收集萃取物，得银杏花粉提取物。

2、根据权利要求1所述的银杏花粉提取物，其特征在于该提取物是通过下列工艺提取得到的：

银杏花粉加入粘结剂粘结成型，粉碎过20～40目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为18～35Mpa，萃取温度为35～65℃，CO₂的流速为10～30L/h，萃取0.5～25小时，收集萃取物，去除粘结剂得银杏花粉提取物。

3、根据权利要求2所述的银杏花粉提取物，其特征在于粘结剂为食用添加剂，优选为明胶和/或淀粉。

4、权利要求1或2所述银杏花粉提取物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

银杏花粉加入粘结剂粘结成型，粉碎过20～40目筛，装入萃取器，通入CO₂进行超临界萃取，萃取压力为18～35Mpa，萃取温度为35～65℃，CO₂的流速为10～30L/h，萃取0.5～25小时，收集萃取物，去除粘结剂得银杏花粉提取物。

5、根据权利要求4所述银杏花粉提取物的制备方法，其特征在于粘结剂为食用添加剂，优选为明胶和/或淀粉。

6、权利要求1或2所述的银杏花粉提取物在制备改善记忆能力的保健食品或药物中的应用。