CN105755082A - 一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法 - Google Patents

一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法 Download PDF

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王成章
周昊
陈虹霞
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Abstract

本发明涉及一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法。将新鲜白果脱壳、粉碎后，用Tris?HCl溶液提取、饱和(NH4)2SO4分级沉淀制备白果蛋白，白果蛋白先用蒸馏水配制成一定浓度的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中进行高静压处理20～30min，然后取高压处理后白果蛋白样品，于90℃条件下热处理5 min，调节溶液的pH值至蛋白酶最适宜的水解pH，再按一定比例加入蛋白酶进行水解1～2 h，水解温度为蛋白酶最佳水解温度，水解结束后在95℃下灭酶活10 min，水解样品进行冷冻干燥后，即得低敏性白果蛋白粉。采用该技术制得的白果蛋白粉，致敏性低或无过敏性，且具有很好的溶解性、乳化性和抗氧化活性，产品附加值高，可以成为工业上生产低敏性白果蛋白粉的一种新技术。

Description

一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法
技术领域
本发明属于农林产品加工技术领域，特别是涉及一种以白果蛋白为原料，采用高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法。
背景技术
白果是中国特有古老树种银杏的果实，我国的白果资源丰富，产量占全世界的70%。白果具有极高的营养和医疗价值，其作为食疗、滋补、保健食品已有1000多年的历史。近年来由于银杏的快速发展，出现了严重的市场供需问题。行家预测，依我国各地银杏产区的种植情况，10年后全国白果产量将达到30万吨，而届时国际市场需求量只是10万吨左右。目前白果价格，最高每公斤8元/公斤，最低降至4元/公斤，个别地方出现了种银杏果不如种花生果、毁树种田的现象。目前对白果的加工利用，大多是采用传统方式将白果加工成菜肴、罐头、饮料、蜜饯等，白果产品的加工还是处于初级加工水平，而产品的深层次研究和深加工几乎没有，从而导致白果产品的附加值极低，严重阻碍了银杏产业健康持续发展，成为地方政府解决林农经济的当务之急。
白果中含有丰富的蛋白质，含量达到10-15%，其氨基酸组成丰富、合理，必需氨基酸接近WHO/FAO推荐模式，属于优质蛋白。研究表明，白果具有抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤和抗菌等多种生理活性，极具营养和医疗价值，其作为食疗、滋补、保健食品已有1000多年的历史。但是生食白果会引起过敏反应甚至死亡，即使熟制的白果也不能过多食用，儿童对白果更为敏感。已有研究证实，白果中蛋白过敏原是引起过敏反应的主要物质基础，目前对如何降低和消除白果蛋白过敏性的研究还处于空白，从而限制了白果的食用和低敏性白果产品的开发。
目前食物蛋白脱敏方法主要是利用酶法或物理手段破坏蛋白质的空间构象，或断裂一些化学键从而破坏蛋白过敏原的抗原表位，使之与抗体结合受到影响，致敏性降低或消除。酶解法是破坏蛋白过敏原线性表位最为有效的方法，具有作用温和、高效和特异性强等特点，其在牛奶、大豆、鸡蛋、虾、花生和小麦蛋白的脱敏已得到很好的应用。蛋白经过酶解后，不仅致敏性降低，且酶解生成的多肽通常具有更好的性能和生物活性，在体内更易消化吸收。 高静压处理是一种新兴发展的非热食品加工技术, 其可破坏蛋白过敏原的构象表位达到降低过敏性的效果。研究表明，高静压处理不仅可以破坏抗原构象表位，而且其可加快蛋白酶的水解速度，提高酶的水解率，此外高压可使蛋白的结构展开，暴露其内部的抗原表位，这样可使蛋白酶和内部抗原接触更充分，水解更完全，从而提高脱敏效果。因此高静压技术不仅可提高蛋白酶的脱敏效果，其与酶解法配合使用，可同时破坏抗原线性表位和构象表位，可以最大程度降低食物致敏性。
目前国内外还没有将高静压和蛋白酶解技术应用于白果蛋白脱敏方面的研究报道。
针对以上不足，本发明提出采用高静压结合蛋白酶解技术制备低敏性白果蛋白粉。该方法以白果蛋白为原料，经过高静压处理后，再进行蛋白酶解反应，使白果蛋白水解成多肽，制备低敏性白果蛋白粉。该方法绿色环保，工艺操作简单，生产成本低，制备得到的白果蛋白粉，致敏性低或无过敏性，且具有很好的溶解性、乳化性和抗氧化活性，产品附加值高，可以成为工业上生产低敏性白果蛋白粉的一种新技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用高静压结合蛋白酶解技术制备低敏性白果蛋白粉的方法，该方法绿色安全，操作简单，生产成本低，制备得到的白果蛋白粉，致敏性低或无过敏性，且具有很好的溶解性、乳化性和抗氧化活性，适合工业化生产。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法，具体步骤如下：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:15～20g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌24～48h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后得到白果蛋白。
（2）高静压处理
取一定量的白果蛋白，用蒸馏水配制成浓度为40～60 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为100～700MPa，处理时间均为20～30min。
（3）蛋白酶水解
取一定量上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，然后用1mol/L HCl 或1 mol/ L NaOH调节溶液的pH值至蛋白酶最适宜的水解pH，根据白果蛋白样品质量，按1～5%的质量比例加入蛋白酶进行水解，水解温度为蛋白酶最佳水解温度，水解时间为1～2 h ，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得到低敏性白果蛋白粉。
所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶或中性蛋白酶中的一种。
所述的蛋白酶最适宜的水解pH，碱性蛋白酶为pH8.0，木瓜蛋白酶为pH6.5， 胃蛋白酶为pH1.5，中性蛋白酶为pH7.0。
所述的蛋白酶最佳水解温度，碱性蛋白酶为45℃，木瓜蛋白酶为55℃，胃蛋白酶为40℃，中性蛋白酶为45℃。
本发明采用高静压对白果蛋白进行处理，白果蛋白用蒸馏水配制成浓度为40～60mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理20～30min，处理压力范围为100～700MPa。
本发明考察了不同处理压力对白果蛋白致敏性的影响，分别采用100，200，300，400，500，600和700MPa的压力处理白果蛋白，然后采用ELISA法测定不同压力处理过的白果蛋白样品的致敏性，结果表明，随着处理压力的增加，白果蛋白的脱敏率呈上升趋势，当处理压力为100或200MPa时，白果蛋白致敏性分别降低6.5%和11.2%，当处理压力为300,400或500MPa时，白果蛋白致敏性分别降低28.5%，30.3%和38.5%，当处理压力升至为600或700MPa时，白果蛋白致敏性分别降低至43.6%和44.2%。因此优选处理压力为300～700MPa。
本发明采用蛋白酶对高压处理过的白果蛋白进行水解制备低敏性白果蛋白粉，取一定量高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，然后用1 mol/L HCl 或1mol/ L NaOH调节溶液的pH值至蛋白酶最适宜的水解pH，根据白果蛋白样品质量，按1～5%的质量比例加入蛋白酶进行水解1～2 h，水解温度为蛋白酶最佳水解温度，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得到低敏性白果蛋白粉。所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶中的一种。所述的蛋白酶最适宜的水解pH，碱性蛋白酶为pH8.0，木瓜蛋白酶为pH6.5，胃蛋白酶为pH1.5，中性蛋白酶为pH7.0。所述的蛋白酶最佳水解温度，碱性蛋白酶为45℃，木瓜蛋白酶为55℃，胃蛋白酶为40℃，中性蛋白酶为45℃。
本发明考察了不同种类蛋白酶对白果蛋白致敏性的影响，结果表明木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对白果蛋白的脱敏效果最好，其次是胃蛋白酶和中性蛋白酶。因此优选的酶种类为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
本发明对制备得到的低敏性白果蛋白粉的溶解性、乳化性和抗氧化活性进行了测定，结果表明经过高压结合蛋白酶解处理后，白果蛋白对DPPH-清除率由原来的32%提高到75～90%，乳化活性指数由原来的28.5%提高到70～85%，溶解性由原来的8.2%提高到60～75%。
本发明的有益效果：
（1）本发明采用高静压结合蛋白酶解技术制备低敏性白果蛋白粉，制备得到的白果蛋白粉，致敏性低或无过敏性，可用于易敏性人群，特别是儿童配方食品的添加。
（2）本发明制备的低敏性白果蛋白粉具有很好的溶解性、乳化性和抗氧化活性，营养价值高，产品附加值高，具有很高的市场竞争力。
（3）本发明采用的方法不影响产品外观，不产生苦味及其他不良风味，而且工艺操作简单，绿色环保，生产成本低，安全性高，适合工业化生产。
（4）本发明技术对提高白果产品附加值，拓展其在功能性食品、医药和化妆品行业的应用具有重要意义。
附图说明
图1不同处理压力条件下白果蛋白的致敏率。
图2不同处理压力条件下不同蛋白酶水解产物的致敏率。
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明不受此限制。
实施例1
白果蛋白的高静压处理
取一定量的白果蛋白，用蒸馏水配制成浓度为40～60 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为100～700MPa，处理时间均为20～30min。
本发明研究了不同处理压力对白果蛋白致敏性的影响，分别取白果蛋白50g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，分别将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，分别采用100，200，300，400，500，600和700MPa的压力于25℃条件下进行高静压处理20min，然后采用ELISA法测定不同压力处理过的白果蛋白样品的致敏性，试验结果见图1。
由图1结果可见，随着处理压力的增加，白果蛋白的脱敏率呈上升趋势，当处理压力为100或200MPa时，白果蛋白致敏性分别降低6.5%和11.2%，当处理压力为300,400或500MPa时，白果蛋白致敏性分别降低28.5%，30.3%和38.5%，当处理压力升至为600或700MPa时，白果蛋白致敏性分别降低至43.6%和44.2%。因此优选处理压力为300～700MPa。
实施例2
白果蛋白的蛋白酶水解
取一定量高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，然后用1 mol/LHCl 或1 mol/ L NaOH调节溶液的pH值至蛋白酶最适宜的水解pH，根据白果蛋白样品质量，按1～5%的质量比例加入蛋白酶进行水解，水解温度为蛋白酶最佳水解温度，水解时间为1～2 h ，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得到低敏性白果蛋白粉。
所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶或中性蛋白酶中的一种。
所述的蛋白酶最适宜的水解pH，碱性蛋白酶为pH8.0，木瓜蛋白酶为pH6.5，胃蛋白酶为pH1.5，中性蛋白酶为pH7.0。
所述的蛋白酶最佳水解温度，碱性蛋白酶为45℃，木瓜蛋白酶为55℃，胃蛋白酶为40℃，中性蛋白酶为45℃。
本发明考察了不同种类蛋白酶对白果蛋白致敏性的影响，分别取不同压力处理后的白果蛋白样品10g，于90 ℃条件下热处理5 min，然后用1 mol/L HCl 或1 mol/ L NaOH调节溶液的pH值至各蛋白酶最适宜的水解pH，根据白果蛋白样品质量，按2%的质量比例加入不同蛋白酶进行水解，水解温度为各蛋白酶最佳水解温度，水解时间为2 h ，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥得到低敏性白果蛋白粉，然后采用ELISA法测定不同蛋白酶对不同压力处理过的白果蛋白样品的脱敏效果，试验结果见图2。
由图2结果可见，在100～700MPa范围内，木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶对白果蛋白的脱敏效果均优于胃蛋白酶或中性蛋白酶，当压力达到600～700MPa，木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶可完全脱除白果蛋白的脱敏性，而当压力达到700MPa时，胃蛋白酶或中性蛋白酶可脱除95%以上白果蛋白的脱敏性，因此优选的酶种类为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
实施例3：
低敏性白果蛋白粉的制备
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:15g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌24h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白150.2g，纯度为96.8%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为100MPa，处理时间均为20min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/ L NaOH调节溶液的pH值至8，然后加入1g碱性蛋白酶进行水解2h，水解温度为45℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低59.2%，对DPPH-清除率为79.6%，乳化活性指数为78.5%，溶解性为68.2%。
实施例4：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:20g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌36h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白162.5g，纯度为96.5%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为200MPa，处理时间均为25min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/L HCl调节溶液的pH值至6.5，然后加入0.5g木瓜蛋白酶进行水解1.5h，水解温度为55℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低64.4%，对DPPH-清除率为85.6%，乳化活性指数为80.2%，溶解性为70.5%。
实施例5：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:18g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌48h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白165.3g，纯度为95.8%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为300MPa，处理时间均为20min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/L HCl调节溶液的pH值至1.5，然后加入1g胃蛋白酶进行水解2h，水解温度为40℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低69.4%，对DPPH-清除率为82.4%，乳化活性指数为81.6%，溶解性为71.4%。
实施例6：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:20g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌24h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白158.6g，纯度为96.0%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为400MPa，处理时间均为30min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/L HCl调节溶液的pH值至7，然后加入0.8g中性蛋白酶进行水解1h，水解温度为45℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低78.7%，对DPPH-清除率为83.7%，乳化活性指数为82.4%，溶解性为72.5%。
实施例7：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:20g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌40h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白163.4g，纯度为96.1%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为500MPa，处理时间均为20min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/ L NaOH调节溶液的pH值至8，然后加入0.2g碱性蛋白酶进行水解2h，水解温度为45℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低95.5%，对DPPH-清除率为88.7%，乳化活性指数为84.3%，溶解性为74.6%。
实施例8：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:15g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌32h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白158.6g，纯度为95.8%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为600MPa，处理时间均为25min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/L HCl调节溶液的pH值至6.5，然后加入0.6g木瓜蛋白酶进行水解1.5h，水解温度为55℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低100%，对DPPH-清除率为90.2%，乳化活性指数为85.6%，溶解性为75.3%。
实施例9：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果1kg脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:20g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌48h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后，得到白果蛋白163.5g，纯度为96.3%。
（2）低敏性白果蛋白粉的制备
取白果蛋白20g，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为700MPa，处理时间均为30min；取上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，用1 mol/L HCl调节溶液的pH值至1.5，然后加入1g胃蛋白酶进行水解2h，水解温度为40℃，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得低敏性白果蛋白粉。经测定，其致敏性降低98.7%，对DPPH-清除率为89.6%，乳化活性指数为84.8%，溶解性为74.5%。

Claims (4)

1.一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）白果蛋白的分离纯化
取新鲜白果脱壳，冷冻干燥后，研磨过筛，用石油醚脱脂至脱脂完全为止，待石油醚完全挥发后，按1:15～20g/mL的比例加入pH 7.4的浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl溶液进行蛋白提取，4℃下磁力搅拌24～48h，然后在4℃下5000r/min 冷冻离心15min，上清液分别通过40和80g/100mL 饱和度的(NH4)2SO4进行分级沉淀，4℃下5000r/min 冷冻离心30min，沉淀用少量pH 8.0的浓度为0.01mol/L的Tris-HCl溶液溶解，置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中用相同的Tris-HCl溶液进行透析，透析液冷冻干燥后得到白果蛋白；
（2）高静压处理
取一定量的白果蛋白，用蒸馏水配制成浓度为40～60 mg/mL的白果蛋白溶液，将其密封于双层聚乙烯塑料袋中，抽真空密封后，置于高压设备中，于25℃条件下进行高静压处理，处理压力范围为100～700MPa，处理时间均为20～30min；
（3）蛋白酶水解
取一定量上述高压处理后的白果蛋白样品，于90 ℃条件下热处理5 min，然后用1mol/L HCl 或1 mol/ L NaOH调节溶液的pH值至蛋白酶最适宜的水解pH，根据白果蛋白样品质量，按1～5%的质量比例加入蛋白酶进行水解，水解温度为蛋白酶最佳水解温度，水解时间为1～2 h ，水解结束后在95 ℃下灭酶活10 min，然后将水解样品进行冷冻干燥，即得到低敏性白果蛋白粉。
2.如权利要求1所述的一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶或中性蛋白酶中的一种。
3.如权利要求1所述的一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的蛋白酶最适宜的水解pH，碱性蛋白酶为pH8.0，木瓜蛋白酶为pH6.5、胃蛋白酶为pH1.5，中性蛋白酶为pH7.0。
4.如权利要求1所述的一种高静压结合酶解法制备低敏性白果蛋白粉的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的蛋白酶最佳水解温度，碱性蛋白酶为45℃，木瓜蛋白酶为55℃、 胃蛋白酶为40℃，中性蛋白酶为45℃。
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