CN101323648A - 一种桑黄粗多糖的提取方法及桑黄多糖的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然产物有效成分提取领域，具体涉及一种桑黄粗多糖的提取方法及桑黄多糖的纯化方法。本发明需要解决的技术问题是公开一种桑黄粗多糖提取物的提取方法和一种高效逆流色谱制备桑黄多糖的方法。本发明用超声萃取法从桑黄子实体中提取桑黄粗多糖，用高速逆流色谱法进一步纯化桑黄多糖。本发明的方法桑黄粗多糖的得率高，可达生药的6％；而且进一步纯化桑黄多糖其纯度大幅提高，达75％左右。

Description

一种桑黄粗多糖的提取方法及桑黄多糖的纯化方法
技术领域
本发明属于天然产物有效成分提取领域，具体涉及一种桑黄粗多糖的提取方法及桑黄多糖的纯化方法。
背景技术
桑黄(Phellinus linteus)，寄生于杨、柳、桦、栎、松等树木之上，分布广泛，是东方人(尤其是中国、韩国和日本等)的传统中药。近年来，日本、韩国相继对其进行开发，它是目前国际公认的生物抗癌领域中药效非常好的药用真菌，抗癌效果比灵芝、加里斯茸、PL-2、PL-5(MeSima)好，已成为药用真菌研究领域的一个热点。目前已确认桑黄的功效主要来自于桑黄多糖(polysaccharide from Phellinus linteus)，其药理作用如下：
1、抗癌：早在1968年，日本人科学家发现，桑黄野生子实体的提取物对小鼠肉瘤S180的抑制率为95.7％，并发现桑黄中发挥抗癌作用的物质为多糖。目前，大量的研究结果表明桑黄多糖能有效抑制癌细胞生长和防止其转移是通过细胞调节和体液免疫而起作用的。桑黄多糖是目前所知抗癌效果最显著的多糖，并且对正常成纤维细胞没有细胞毒作用。因此，可以说桑黄多糖可能是化学方法抗癌的又一个理想药物。
2、抗纤维化：第二军医大学对桑黄抗纤维化作用进行了试验研究.结果发现：桑黄能显著降低肝纤维化大鼠血清氨基酸转移酶水平和血清胶原成分的含量。并且病理组织观察显示桑黄对肝细胞有明显的保护作用，同时抑制纤维组织增生，阻止肝纤维化的形成与发展。
3、抗氧化：韩国部学者研究了桑黄乙酸乙酯浸提物的抗氧化作用，结果发现：对超氧阴离子的清除、抗坏血酸引起油脂氧化的抑制、过氧化物和一氧化氮的清除有很好的效果。
4、其他药理作用：研究发现桑黄提取物还具有抗菌、消炎作用，并且还发现了该提取物还具有镇痛作用。
目前市场上主要产品包括桑黄多糖、桑黄子实体超细粉末、桑黄纯菌丝体粉末等。
桑黄子实体质地较硬，成份复杂，致使多糖分离纯化较为困难。因此，桑黄样品需经过一定的前处理得到粗多糖提取物，之后进入逆流色谱进行进一步纯化。传统的样品前处理主要是采用水煮方法，萃取时间长达6小时以上，耗能高，且粗多糖的得率低，仅为生药的2％。然后粗桑黄多糖经凝胶过滤技术进行提纯，过程繁琐，耗时较长，而且产品纯度低，一般在25％左右，作为药物制剂需要更高纯度的桑黄多糖产品。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是公开一种桑黄粗多糖提取物的提取方法以克服现有技术中存在的桑黄粗多糖得率低的技术缺陷。
本发明需要解决的技术问题之二是公开一种高效逆流色谱制备桑黄多糖的方法以克服现有技术中存在的桑黄多糖纯度低的技术缺陷。
发明人经过广泛而深入的研究，用超声萃取方法制备桑黄粗多糖，不仅缩短了萃取时间、而且大大提高了桑黄粗多糖的得率。进而，发明人采用高速逆流色谱方法实现了快速纯化桑黄多糖，大大提高了桑黄多糖的纯度。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法，包括将桑黄子实体粉碎、萃取、离心、醇沉淀、洗涤、干燥的步骤，其中所述的萃取为超声萃取。
优选地，一种从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法，其中将粉碎的桑黄子实体和去离子水混合，超声萃取的条件为粉碎的桑黄子实体∶去离子水＝1∶4～8、超声温度50～70℃、超声时间20～40min、工作2秒、停3秒，超声功率800～1200W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液。
更优选地，一种从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法，其中将粉碎的桑黄子实体和去离子水混合，超声萃取的条件为料液比桑黄子实体∶去离子水＝1∶6、超声温度60℃、超声时间30min、工作2秒、停3秒，超声功率1000W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液。
桑黄子实体的粉碎方法在本领域是常用技术，如用高速中药粉碎机粉碎桑黄子实体，粉碎至本领域技术人员常用的粒度即可，如粉碎至40～80目。
用醇沉淀法沉淀萃取液中的桑黄多糖，醇沉淀前将萃取液浓缩，如用旋转蒸发仪浓缩之，一般地浓缩到原体积的1/3，加入三倍体积的无水乙醇、静置2小时～4小时，离心收集沉淀，然后经过将沉淀溶于去离子水，置于切割分子量1000Da的半透膜中对去离子水透析24小时，真空干燥即得桑黄粗多糖提取物。
桑黄样品来源包括：Phellinus igniarius、Phellinus linteus、Phellinus baumii，这三种真菌药用价值相同或相似。
所需设备包括：高速中药粉碎机(粉碎细度10-120目)、超声波萃取器(复频共振式)、高速离心机、旋转蒸发仪、真空干燥箱。
本发明提供了一种从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖的方法，其特征在于，用高速逆流色谱法从桑黄粗多糖提取物中纯化桑黄多糖。优选的从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖的方法，其特征在于，用18％PEG1000，14％KPi(pH6.8)的水性二相系统作高速逆流色谱的介质。
更优选的从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖的方法，其特征在于包括如下步骤，(1)水性二相系统配制：取聚乙二醇(PEG1000)180g，K2HPO470g，KH2PO470g，蒸馏水680g于分液漏斗中，溶解，摇匀后静置.即得18％PEG1000，14％KPi(pH6.8)的水性二相系统1000g，分成上层溶液和下层溶液，以下相为固定相，上相为流动相；(2)HS-CCC法分离桑黄多糖：将固定相充实整个螺旋柱后，开启色谱仪，调节转速为600r/min，然后以1ml/min的流速导入流动相，待两相达到平衡后进样，样品浓度为10mg桑黄粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的转速，用流动相以1ml/min的流速进行洗脱，每6ml收集一份洗脱液，将第26份至30份洗脱液合并、冷冻干燥即得桑黄多糖。
一种桑黄多糖的纯化方法，包括如下步骤：(a)从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物；和(b)用高速逆流色谱法从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖。
优选的，一种桑黄多糖的纯化方法，包括如下步骤：(a)从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物；和(b)用高速逆流色谱法从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖，其特征在于，步骤(a)包括将桑黄子实体粉碎、萃取、离心、醇沉淀、洗涤、干燥的步骤，其中所述的萃取为超声萃取，超声萃取的条件是为粉碎的桑黄子实体∶去离子水＝1∶4～8、超声温度50～70℃、超声时间20～40min、工作2秒、停3秒，超声功率800～1200W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液。
更优选的，一种桑黄多糖的纯化方法，包括如下步骤：(a)从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物；和(b)用高速逆流色谱法从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖，其特征在于，步骤(a)包括将桑黄子实体粉碎、萃取、离心、醇沉淀、洗涤、干燥的步骤，其中所述的萃取为超声萃取，超声萃取的条件是为粉碎的桑黄子实体∶去离子水＝1∶4～8、超声温度50～70℃、超声时间20～40min、工作2秒、停3秒，超声功率800～1200W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液；步骤(b)包括(1)水性二相系统配制：取180g聚乙二醇PEG1000，K2HPO470g，KH2PO470g，蒸馏水680g于分液漏斗中，溶解，摇匀后静置.即得18％PEG1000，14％KPi(pH6.8)的水性二相系统1000g，分成上层溶液和下层溶液，以下相为固定相，上相为流动相；(2)HS-CCC法分离桑黄多糖：将固定相充实整个螺旋柱后，开启色谱仪，调节转速为600r/min，然后以1ml/min的流速导入流动相，待两相达到平衡后进样，样品浓度为10mg桑黄粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的转速，用流动相以1ml/min的流速进行洗脱，每6ml收集一份洗脱液，将第26份至30份洗脱液合并、冷冻干燥即得桑黄多糖。
所需设备包括：TBE-300A高速逆流色谱系统，配8823B-UV紫外检测仪，按照设备厂家提供的说明书进行操作。
桑黄多糖的测定方法在本领域是公知的，如硫酸-苯酚法(张惟杰，糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1994：202-212，271.339.)。
本发明从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法具有显著的技术效果：传统水煮方法制备桑黄粗多糖提取物的方法，萃取时间长达6小时以上，耗能高，且粗多糖最高得率仅为生药的2％；而本法采用超声波萃取法制备桑黄粗多糖提取物，萃取时间缩短至1小时，耗能低，且产品得率高达生药的6％以上。
逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)结合了液液萃取和分配色谱的优点，是一种不用任何固态载体或支撑的液液分配色谱技术。可以在短时间内实现高效的分离。与高效液相色谱(HPLC)不同的是，它不需要固体支撑体，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。因为制备量大，是一种理想的制备分离技术。
本发明的桑黄多糖纯化方法具有显著的技术效果：现有技术采用液液萃取和凝胶过滤技术进行提纯，过程繁琐，耗时较长，而且产品纯度低，一般在25％左右，本发明用逆流色谱技术纯化桑黄多糖能够显著提高分离效率，较之传统的液液萃取和凝胶过滤技术具有纯化时间短、操作简便等优点，并且能够大幅度提高产品纯度。本发明一个实施例中桑黄多糖纯度达到75％以上。
以下结合具体实施利进一步说明本发明，但是应该理解，这些实施例都是说明性的。
具体实施方式：
实施例1
将1000g桑黄子实体切成适当小块，放入高速中药粉碎机中粉碎，粉碎细度达到60目。将粉碎后的桑黄粉粒与6L去离子水混合，放在超声波萃取器中进行超声萃取。超声温度60℃，超声时间30min(工作2秒，停3秒)，超声功率1000W。5000rpm离心10min，将所得沉淀按照上述超声萃取条件重新操作一遍。5000rpm，离心10min，将两次萃取并离心后所得上清液合并。在旋转蒸发仪中将萃取液浓缩到原体积的1/3，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇。5000rpm，离心10min，将所得沉淀放入膜切割分子量1000的透析袋中透析，采用流动去离子水透析24h，50℃真空干燥。得到粗提物351g，多糖纯度18.6％，粗多糖得率为生药的6.52％。
实施例2
配制18％PEG1000，14％KPi(pH 6.8)的水性二相系统，分成上层溶液和下层溶液，以下相为固定相，上相为流动相。称取粗多糖提取物200mg，用流动相配成20ml的样品溶液。将固定相充实HS-CCC整个螺旋柱后，开启色谱仪，调节转速为600r/min，然后以1ml/min的流速导入流动相，待两相达到平衡后进样；并以600r/min的转速，用流动相以1ml/min的流速进行洗脱，以每6ml收集一份洗脱液，将第26份至30份洗脱液合并，冻干。测得所得产品多糖含量76.7％，蛋白质含量18.8％。

Claims (7)

1.一种从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法，包括将桑黄子实体粉碎、萃取、离心、醇沉淀、洗涤、干燥的步骤，其特征在于所述的萃取为超声萃取。
2.根据权利要求1的从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法，其特征在于将粉碎的桑黄子实体和去离子水混合，超声萃取的条件为粉碎的桑黄子实体∶去离子水＝1∶4～8、超声温度50～70℃、超声时间20～40min、工作2秒、停3秒，超声功率800～1200W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液。
3.根据权利要求2的从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物的方法，其特征在于将粉碎的桑黄子实体和去离子水混合，超声萃取的条件为料液比桑黄子实体∶去离子水＝1∶6、超声温度60℃、超声时间30min、工作2秒、停3秒，超声功率1000W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液。
4.一种从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖的方法，用高速逆流色谱法从桑黄粗多糖提取物中纯化桑黄多糖，其特征在于，用18％PEG1000，14％KPi(pH6.8)的水性二相系统作高速逆流色谱的介质。
5.根据权利要求4的从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤，(1)水性二相系统配制：取聚乙二醇(PEG1000)180g，K2HPO4 70g，KH2PO4 70g，蒸馏水680g于分液漏斗中，溶解，摇匀后静置.即得18％PEG1000，14％KPi(pH6.8)的水性二相系统1000g，分成上层溶液和下层溶液，以下相为固定相，上相为流动相；(2)HS-CCC法分离桑黄多糖：将固定相充实整个螺旋柱后，开启色谱仪，调节转速为600r/min，然后以1ml/min的流速导入流动相，待两相达到平衡后进样，样品浓度为10mg桑黄粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的转速，用流动相以1ml/min的流速进行洗脱，每6ml收集一份洗脱液，将第26份至30份洗脱液合并、冷冻干燥即得桑黄多糖。
6.一种桑黄多糖的纯化方法，包括如下步骤：(a)从桑黄子实体制备桑黄粗多糖提取物；和(b)用高速逆流色谱法从桑黄粗多糖提取物纯化桑黄多糖，其特征在于，步骤(a)包括将桑黄子实体粉碎、萃取、离心、醇沉淀、洗涤、干燥的步骤，其中所述的萃取为超声萃取，超声萃取的条件是为粉碎的桑黄子实体∶去离子水＝1∶4～8、超声温度50～70℃、超声时间20～40min、工作2秒、停3秒，超声功率800～1200W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液。
7.根据权利要求6的桑黄多糖的纯化方法，其特征在于，步骤(a)包括将桑黄子实体粉碎、萃取、离心、醇沉淀、洗涤、干燥的步骤，其中所述的萃取为超声萃取，超声萃取的条件是为粉碎的桑黄子实体∶去离子水＝1∶4～8、超声温度50～70℃、超声时间20～40min、工作2秒、停3秒，超声功率800～1200W；离心收集上清，沉淀按照上述超声萃取条件重复一次，离心收集上清，合并两次的上清液即为桑黄多糖的萃取液；和，步骤(b)包括(1)水性二相系统配制：取180g聚乙二醇PEG1000，K2HPO4 70g，KH2PO4 70g，蒸馏水680g于分液漏斗中，溶解，摇匀后静置.即得18％PEG1000，14％KPi(pH6.8)的水性二相系统1000g，分成上层溶液和下层溶液，以下相为固定相，上相为流动相；(2)HS-CCC法分离桑黄多糖：将固定相充实整个螺旋柱后，开启色谱仪，调节转速为600r/min，然后以1ml/min的流速导入流动相，待两相达到平衡后进样，样品浓度为10mg桑黄粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的转速，用流动相以1ml/min的流速进行洗脱，每6ml收集一份洗脱液，将第26份至30份洗脱液合并、冷冻干燥即得桑黄多糖。
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